李 娟 陳雨婷 師若迪 高園園 俞 洋

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種年齡相關(guān)性慢性疾病,其特點是視網(wǎng)膜黃斑區(qū)光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮發(fā)生退行性改變以及新生血管生成,由于主要影響視網(wǎng)膜黃斑中央凹區(qū)域,因此,AMD可造成不可逆轉(zhuǎn)的視力喪失[1]。隨著人口老齡化及肥胖人群數(shù)量的增加,AMD患病率在我國急劇上升,預計到2040年全球AMD患者人數(shù)將達到2.88億[2]。目前,AMD高發(fā)病率和致盲性已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題,對老年人的生活造成了非常嚴重的影響,因此,如何有效治療AMD成為臨床醫(yī)生最為關(guān)心的問題。Aziz等[3]研究顯示,長時間光照可導致視網(wǎng)膜光化學損傷。Kivinen等[4]研究顯示,光損傷參與的氧化應激反應在AMD 發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA是一類廣泛存在于真核生物、長度為20～24核苷酸的小分子單鏈RNA,目前已有研究顯示miRNA參與了AMD的發(fā)生和發(fā)展,但其具體作用機制尚不明確[5-6]。miRNA-21是在哺乳動物中最早被發(fā)現(xiàn)和確認的miRNA分子中的一種,大量研究顯示,miRNA-21通過調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、抗凋亡等多種分子機制,在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]。近年來,miRNA在RPE細胞增殖和凋亡中的研究逐漸增多,有研究證明,miRNA-21在H2O2誘導的人眼小梁網(wǎng)細胞氧化應激損傷過程中異常表達[8]。但有關(guān) miRNA-21在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的研究鮮見報道。因此,本研究旨在探討miRNA-21-5p對光誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系A(chǔ)RPE-19細胞(購于北京索萊寶科技有限公司,SP9310)。

青霉素-鏈霉素混合液、胰蛋白酶、RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司);胎牛血清(美國Gibco公司);DMEM/F12、磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司);CCK-8檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)ELISA檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司);丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司);miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、miRcute miRNA Detection Kit(北京天根生物科技有限公司);熒光定量PCR試劑盒(武漢莫納生物)。

Multiskan 酶標儀(美國Thermo公司);TES-1332A 數(shù)位式照度計(中國臺北泰仕電子工業(yè));FACSAriaⅡ型流式細胞檢測儀(美國 BD 公司);熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將復蘇的ARPE-19細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、10 g·L-1雙抗的完全培養(yǎng)基,于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞每2 d換液1次,待細胞密度約90%時以14比例傳代培養(yǎng),選取2～4代細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

選取生長狀態(tài)良好且穩(wěn)定的ARPE-19細胞進行計數(shù)后接種,以每孔400×103個接種到細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng),待細胞融合度為80%～90%時行細胞轉(zhuǎn)染。于超凈工作臺下分別配制A、B溶液。A液:將250 pmol siRNA稀釋于200 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中并輕輕混勻;B液:吸取10 μL TransIntro EL加入到稀釋好的siRNA中輕柔混勻,于室溫放置20 min。最后將siRNA-TransIntro EL復合物加入到細胞中并置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于轉(zhuǎn)染4～6 h后進行細胞換液,培養(yǎng)48 h后收集各組細胞,供后續(xù)檢測。

1.2.3 實驗分組

將ARPE-19細胞隨機分為5組,分別為:(1)對照組,僅使用TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)ARPE-19細胞48 h;(2)損傷組,使用TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)ARPE-19細胞48 h后,給予24 h光損傷;(3)過表達組,加入TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)ARPE-19細胞48 h后,再加入miRNA-21-5p mimics,然后給予24 h光損傷;(4)陰性組,加入TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)ARPE-19細胞48 h后,再加入miRNA-21-5p mimics NC,然后給予24 h光損傷;(5)PI3K/Akt阻斷劑組,加入TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)ARPE-19細胞48 h后,再加入miRNA-21-5p mimics和LY294002,然后給予24 h光損傷。各組處理結(jié)束后,收集ARPE-19細胞進行各項指標檢測。

1.2.4 細胞光損傷模型的構(gòu)建

將ARPE-19 細胞培養(yǎng)于6孔板中,用光照強度為(16 500±200)lx的LED冷光燈垂直照射細胞24 h,光照時培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37.5 ℃,其中對照組用錫紙包裹。

1.2.5 qRT-PCR法檢測miRNA-21-5p表達水平

用Trizol試劑提取各組ARPE-19細胞總RNA,利用微量分光光度計測定RNA 濃度。按照RT-PCR試劑盒操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進行PCR擴增。用12 g·L-1瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物,EB染色,內(nèi)參為U6。擴增后進行溶解曲線分析,miRNA-21-5P引物序列:5’-GGTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3’,U6引物序列:5’-TCGCTTCGGCAGCACATA-3’?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt方法計算。

1.2.6 CCK-8法檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期ARPE-19細胞,充分消化后,將細胞以每孔5×103個接種于96孔板,分組處理后,按照試劑盒步驟,用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的OD值并計算各組細胞活力。

1.2.7 流式細胞儀檢測ROS含量

用培養(yǎng)基1 000倍稀釋DCFH-DA,收集分組處理后的ARPE-19細胞,用冷的PBS洗滌。PBS重懸細胞,調(diào)整細胞密度為1×106個·mL-1,300 r·min-1離心10 min,棄上清。0.5 mL稀釋好的DCFH-DA重懸細胞,混勻,于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,每隔3～5 min顛倒混勻一次。用無血清培養(yǎng)基洗細胞3次后加入500 μL無血清培養(yǎng)基重懸,最后用流式細胞儀FITC通路檢測各組ARPE-19細胞ROS含量。

1.2.8 ELISA法檢測細胞SOD活性和MDA含量

收集分組處理后的ARPE-19細胞,按照SOD、MDA ELISA檢測試劑盒說明書步驟進行檢測,分別設(shè)計標準孔及對照孔,在酶標儀上檢測后記錄各組ARPE-19細胞SOD活性和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測各組細胞miRNA-21-5p的表達水平

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,對照組、損傷組、過表達組、陰性組和PI3K/Akt阻斷劑組ARPE-19細胞miRNA-21-5p相對表達量分別為0.91±0.01、0.30±0.04、2.72±0.21、0.25±0.04、1.23±0.07。與對照組相比,損傷組ARPE-19細胞miRNA-21-5p表達明顯下降(P<0.001);與損傷組相比,過表達組ARPE-19細胞miRNA-21-5p表達顯著升高(P<0.001),而陰性組細胞miRNA-21-5p表達無明顯差異(P=0.679);PI3K/Akt阻斷劑組較過表達組細胞miRNA-21-5p表達明顯下降(P<0.001)。

2.2 CCK-8法檢測各組ARPE-19細胞存活率

CCK-8法檢測結(jié)果顯示,對照組、損傷組、過表達組、陰性組和PI3K/Akt阻斷劑組ARPE-19細胞存活率分別為(99.96±3.91)%、(57.36±3.17)%、(86.90±3.69)%、(54.08±1.61)%、(65.21±1.89)%。與對照組相比,損傷組ARPE-19細胞存活率明顯下降(P<0.001);與損傷組相比,過表達組ARPE-19細胞存活率明顯上升(P<0.001),陰性組ARPE-19細胞存活率無明顯差異(P=0.071);PI3K/Akt阻斷劑組較過表達組細胞存活率顯著下降(P<0.001)。

2.3 流式細胞儀檢測各組 ARPE-19細胞ROS含量

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,對照組、損傷組、過表達組、陰性組和PI3K/Akt阻斷劑組ARPE-19細胞ROS含量分別為(5.57±0.83)%、(75.13±3.48)%、(22.23±1.21)%、(72.70±4.20)%、(32.60±1.15)%。與對照組相比,損傷組ARPE-19細胞ROS含量明顯升高(P<0.001);與損傷組相比,過表達組ARPE-19細胞ROS含量明顯降低(P<0.001),陰性組細胞ROS含量無明顯差異(P=0.275);與過表達組相比,PI3K/Akt阻斷劑組ARPE-19細胞ROS含量明顯升高(P=0.001)(圖1)。表明miRNA-21-5p能顯著降低光誘導的ARPE-19細胞氧化應激水平。

A:對照組;B:損傷組;C:過表達組;D:陰性組;E:PI3K/Akt阻斷劑組。

2.4 ELISA法檢測各組ARPE-19細胞SOD活性和MDA含量

ELISA法檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,損傷組ARPE-19細胞SOD活性明顯降低,MDA含量明顯增加(均為P<0.001);與損傷組相比,過表達組ARPE-19細胞SOD活性升高,MDA含量減少(均為P<0.001),陰性組細胞SOD活性、MDA含量均無明顯差異(P=0.150、0.301);與過表達組相比,PI3K/Akt阻斷劑組ARPE-19細胞SOD活性明顯降低,MDA含量明顯增加(均為P<0.001)(表1)。

表1 各組ARPE-19細胞SOD活性和MDA含量

3 討論

AMD是一種多因素致盲性疾病,發(fā)病率高,已成為致盲的首要疾病,但可以得到有效治療的患者卻極其有限,故尋找安全高效的防治AMD藥物成為當前的研發(fā)熱點。而RPE細胞損傷是 AMD 病理改變的始動環(huán)節(jié),過度光照損傷會加速RPE細胞功能障礙,最終導致AMD的發(fā)生[9]。

miRNA是長度約22個核苷酸內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子,在轉(zhuǎn)錄后可通過RNA干擾機制負性調(diào)控約60%的人類基因[10]。目前研究表明,在人類視網(wǎng)膜、角膜等眼部組織中已發(fā)現(xiàn)上百種miRNA的表達,miRNA通過調(diào)控下游靶基因來維持眼部組織的正常功能[11]。研究發(fā)現(xiàn),有多種miRNA已被確定為細胞、組織或機體衰老的調(diào)節(jié)因子,miRNA參與的氧化應激、病理性新生血管化以及免疫炎癥反應等進程與AMD的發(fā)生存在相關(guān)性[12]。miRNA-21屬于miRNA家族,位于染色體17q23.2上,miRNA-21作為一種致癌基因,在多種腫瘤中高表達[13]。miRNA-21參與多種腫瘤細胞的凋亡、侵襲、分化、增殖等過程,是通過對相關(guān)靶基因的調(diào)節(jié)來完成的[14]。有研究表明,通過下調(diào)miRNA-21的表達,能顯著改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變情況[15]。在高糖誘導的 RPE 細胞中,lncRNA XIST 能通過下調(diào) miRNA-21-5p 的表達來抑制ARPE-19 細胞的凋亡[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ARPE-19細胞光照24 h,與對照組相比,損傷組細胞存活率顯著降低;與損傷組相比,過表達組、PI3K/Akt阻斷劑組細胞存活率均明顯升高;過表達組與PI3K/Akt阻斷劑組相比細胞存活率顯著上升。表明miRNA-21-5p能顯著提高光損傷后ARPE-19細胞存活率。

氧化應激是AMD發(fā)生、發(fā)展的重要病理機制之一,其會導致RPE或脈絡(luò)膜微血管損傷,RPE損傷會進一步介導Bruch膜及脈絡(luò)膜的炎癥反應,促發(fā)的炎癥反應又會使細胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積,進而影響RPE,加速AMD進展[17-18]。氧化應激是當有害物質(zhì)刺激機體時其體內(nèi)ROS含量隨之增加,使得氧化程度超出了氧化物的清除能力范圍,氧化與抗氧化作用間失去平衡,從而導致細胞損傷[19]。體內(nèi)氧自由基清除劑SOD為細胞抗氧化防御體系的重要物質(zhì),對機體氧化動態(tài)平衡至關(guān)重要[20]。MDA是細胞氧化程度和受損的重要標志[21]。有研究表明,在心肌缺血再灌注損傷模型中,紅景天苷通過促進miRNA-21-5p過表達從而減輕心肌細胞凋亡,并減輕心肌氧化應激及炎癥水平[22]。馬佳等[23]在H2O2誘導的視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics 后,細胞中ROS、MDA含量降低,SOD活性上升,這提示 miRNA-21抵抗H2O2誘導的細胞氧化應激損傷機制可能是通過清除細胞內(nèi)氧化應激產(chǎn)物 ROS、MDA實現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示,與對照組相比,損傷組ARPE-19細胞中ROS含量顯著升高,SOD活性明顯降低,MDA含量明顯增加;與損傷組相比,過表達組、PI3K/Akt阻斷劑組ARPE-19細胞ROS含量均明顯降低,SOD活性均升高,MDA含量均減少;過表達組與PI3K/Akt阻斷劑組相比,細胞ROS水平明顯降低,SOD活性明顯升高,MDA含量明顯減少,表明miRNA-21-5p能顯著降低光誘導的ARPE-19細胞氧化應激水平,提高光誘導的ARPE-19細胞抗氧化能力。

4 結(jié)論

miRNA-21-5p能顯著提高光損傷后ARPE-19細胞存活率以及抗氧化能力,其抗氧化機制推測可能與miRNA-21-5p作用于ROS上游調(diào)控因子有關(guān)。但因本實驗條件有限,相關(guān)機制有待進一步探索。