楊星星，付 輝*，王炳志，李細(xì)清，張 鑫，嚴(yán)義勇，王幸幸

(1.深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東深圳 518101；2.深圳市通量檢測(cè)科技有限公司，廣東深圳 518038)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥由于其高效低毒被廣泛用于蔬菜、水果、農(nóng)作物、林業(yè)的害蟲防治。然而，隨著擬除蟲菊酯類農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的使用，其原藥本體及代謝物殘留危害日益明顯，現(xiàn)已引起世界各國(guó)研究者的極大關(guān)注[1-2]。目前，檢測(cè)擬除蟲菊酯殘留最常用的方法是氣相色譜法，此外，高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜-色譜聯(lián)用技術(shù)等[3-11]也都可用于擬除蟲菊酯殘留的檢測(cè)，但這些儀器分析法對(duì)樣品基質(zhì)要求高，往往需要復(fù)雜的前處理，不僅耗時(shí)費(fèi)錢，而且會(huì)造成痕量擬除蟲菊酯的損失；再加上這些儀器分析方法無(wú)法滿足低成本、高通量、快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。免疫分析法由于前處理簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)正好可以彌補(bǔ)這些不足，因此建立擬除蟲菊酯的免疫檢測(cè)技術(shù)具有很好的發(fā)展前景和市場(chǎng)潛力。

建立擬除蟲菊酯免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵是制備親和力強(qiáng)和高靈敏度的抗體，而重點(diǎn)在于半抗原的設(shè)計(jì)合成。一直以來(lái)，由于對(duì)抗原抗體作用機(jī)理以及半抗原空間結(jié)構(gòu)的了解不足，導(dǎo)致半抗原設(shè)計(jì)具有很大的盲目性，通常需要反復(fù)多次的試錯(cuò)嘗試，耗費(fèi)了大量的資金和時(shí)間。而且對(duì)于非有機(jī)合成專業(yè)的人員來(lái)說(shuō)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行有機(jī)修飾或從頭合成半抗原，往往非常困難。另外，擬除蟲菊酯是一類典型的手性農(nóng)藥，含有多個(gè)旋光異構(gòu)單體，這對(duì)于能夠識(shí)別手性單體的抗體而言，一種菊酯往往是多種物質(zhì)的混合物，增大了免疫分析的難度。目前針對(duì)擬除蟲菊酯半抗原的合成主要有全合成在苯環(huán)上衍生手臂[12-14]、在菊酯的氰基上衍生手臂，這些方法制備的半抗原手性結(jié)構(gòu)會(huì)有很多種，而對(duì)半抗原進(jìn)行手性分離又是非常困難的事；有的甚至只使用菊酯的部分結(jié)構(gòu)[15-16]，導(dǎo)致免疫獲得的抗血清競(jìng)爭(zhēng)不理想。為了能夠有效地獲得高質(zhì)量擬除蟲菊酯的抗體，筆者經(jīng)過(guò)多次嘗試成功運(yùn)用擬除蟲菊酯原藥為原料，在不改變菊酯整體結(jié)構(gòu)情況下，經(jīng)過(guò)幾步簡(jiǎn)單的合成，制備出與原藥手性結(jié)構(gòu)一樣的農(nóng)藥半抗原單體；并對(duì)幾種擬除蟲菊酯的抗血清進(jìn)行性能測(cè)試，能夠滿足一定的要求，為后續(xù)進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑。氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯原藥購(gòu)自成都溫江試劑；二甲硫醚、三苯基磷乙酸叔丁酯、無(wú)水四氫呋喃、三氟乙酸、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、液溴購(gòu)于上海安耐吉試劑公司；卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)、牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自北京Solarbio生物有限公司；擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢；包被液、稀釋液、洗滌液、封閉液、TMB 底物溶液、終止液均參考文獻(xiàn)[17]配制。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Balb/c小鼠，雌性，8～9周齡，體重 20～22 g(廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.1.3儀器。DHJF-8002 低溫恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)浴(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本愛朗公司)；酶標(biāo)板自動(dòng)洗滌機(jī)(美國(guó)，Bio-tech)；API 3000液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)，AB)；酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo)；臭氧發(fā)生器(廣州奧普發(fā)環(huán)保科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1半抗原的合成。稱取10 mmol擬除蟲菊酯原藥(氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯)，用30 mL二氯甲烷溶解后轉(zhuǎn)移至冷阱中，在-78 ℃下通入預(yù)干燥并預(yù)冷卻的臭氧6 h(臭氧通過(guò)臭氧發(fā)生器制備，產(chǎn)氣量為20 g/h)。反應(yīng)完成后通入預(yù)干燥并預(yù)冷卻的氮?dú)?5 min，再加入70 mmol二甲硫醚，-78 ℃通入氮?dú)夤呐莘磻?yīng)30 min后取出，蒸干溶劑，過(guò)柱純化得無(wú)色油狀物JZ-1。

將12 mmol三苯基磷乙酸叔丁酯溶于30 mL二氯甲烷，在冰水浴下通入氯氣直到體系變黃綠，停止氯氣(注：若是制備溴氰菊酯半抗原則是直接加入液溴)，繼續(xù)攪拌過(guò)夜，反應(yīng)完成后旋干后無(wú)需后處理直接用，即得到JZ-2。

取4.0 mmol JZ-1再加入6.0 mmol JZ-2，用無(wú)水四氫呋喃20 mL與二氯甲烷3 mL溶解。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 h，反應(yīng)完成后加適量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有機(jī)相，蒸干后過(guò)柱純化，得到無(wú)色油狀物JZ-3。

稱取1.5 mmol JZ-3溶于6 mL二氯甲烷，再加入3 mL三氟乙酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，反應(yīng)完成后旋蒸除去溶劑，加乙酸乙酯30 mL，用檸檬酸-檸檬酸鈉飽和溶液洗滌2次，再用水洗滌2次，最后用飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相干燥后旋干，得白色固體即菊酯半抗原，分別編號(hào)為JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4，具體合成路線和結(jié)構(gòu)見圖1和表1。

注：R1、R2為H、Cl、Br、F3C-；R為菊酯其他帶有苯環(huán)結(jié)構(gòu)；X為Cl、Br。 Note：R1 and R2 are H，Cl，Br and F3C-；R is pyrethroid and others have benzene ring structure；X is Cl，Br.圖1 擬除蟲菊酯半抗原合成路線Fig.1 Synthesis route of pyrethroid hapten

表1 4種擬除蟲菊酯半抗原結(jié)構(gòu)

1.2.2人工抗原的合成。采用活潑酯法將合成的擬除蟲菊酯半抗原JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4分別與載體蛋白BSA 相偶聯(lián)，制備菊酯人工免疫抗原。具體步驟：稱取1 mmol半抗原、1.1 mmol N-羥基琥珀酰亞胺、1.2 mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，加入0.5 mL DMF溶解，在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后吸取0.2 mL，緩慢滴加到3 mL 10 mg/mL 的 BSA 碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)/DMF(2∶1，v/v)混合液中，在磁力攪拌下室溫反應(yīng)6 h。將反應(yīng)液置于透析袋內(nèi)，在0.01 mol/L pH 7.4的 PBS 溶液中攪拌透析，每 4～8 h 換1 次透析液，共透析72 h。透析結(jié)束后將透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分裝于 1 mL 離心管中，分別編號(hào)JZ-H1-BSA、JZ-H2-BSA、JZ-H3-BSA、JZ-H4-BSA，于-20 ℃冰箱中存放備用。

采用混合酸酐法制備包被原，具體步驟：將1 mmol菊酯半抗原溶于 0.5 mL DMF，冰浴下，加入1.2 mmol三丁胺、1.2 mmol氯甲酸異丁酯，室溫避光攪拌反應(yīng) 60 min，得到的混合酸酐溶液緩慢滴加到3 mL 20 mg/mL 的 OVA PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)/DMF(2∶1，v/v)混合液中，室溫磁力攪拌反應(yīng) 3 h，將反應(yīng)液置于透析袋內(nèi)，在0.01 mol/L pH 7.4的 PBS 溶液中攪拌透析，每 4～8 h 換1 次透析液，共透析72 h。透析結(jié)束后將透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分裝于 1 mL 離心管中，分別編號(hào)JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA，于-20 ℃冰箱中存放備用。

1.2.3抗血清制備。選取12 只8 周齡的 Balb/c 雌性小鼠分為4組，每組(編號(hào)分別為 1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)小鼠)首先是尾部采血取血清作為陰性血清，之后進(jìn)行免疫，免疫4次，每次免疫間隔21 d，第4次免疫后7 d，挖眼采集血清100 μL，冰箱過(guò)夜，10 000 r/min離心 10 min，得到菊酯鼠多抗血清。

1.2.4抗血清效價(jià)和靈敏度測(cè)定。將包被原JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA用碳酸緩沖液稀釋至所需濃度包被后，抗血清效價(jià)的測(cè)定采用間接非競(jìng)爭(zhēng) ELISA 操作程序，抗血清靈敏度的測(cè)定采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 操作程序，具體程序參照文獻(xiàn)[18] 。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的鑒定將“1.2.1”合成的4種擬除蟲菊酯半抗原JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4采用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)在負(fù)離子模式下進(jìn)行，如圖2所示。從圖2可以看出，這些半抗原均可得到分子離子峰 [M-H]-以及倍峰 [2M-H]-；JZ-H1分子離子峰 424.4[M-H]-，倍峰849.5 [2M-H]-；JZ-H2分子離子峰 399.4[M-H]-，倍峰799.7[2M-H]-；JZ-H3分子離子峰 442.6[M-H]-，倍峰885.5[2M-H]-；JZ-H4分子離子峰470.6[M-H]-，倍峰939.6 [2M-H]-；這些峰均與其對(duì)應(yīng)化合物的分子量相符(表1)，說(shuō)明這些半抗原合成成功。

圖2 4種擬除蟲菊酯半抗原質(zhì)譜圖Fig.2 The MS of four pyrethroid haptens

2.2 人工抗原的鑒定將菊酯半抗原分別與載體蛋白偶聯(lián)后，制備獲得包被抗原和免疫抗原，通過(guò)紫外掃描獲得相應(yīng)的紫外吸收光譜(圖3)。從圖3可以看出，偶聯(lián)物的紫外吸收均發(fā)生明顯變化，表明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。

圖3 免疫抗原和包被抗原紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of immune antigen and coating antigen

2.3 抗血清效價(jià)和靈敏度測(cè)定由間接非競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法測(cè)定4種藥物產(chǎn)生的抗血清，經(jīng)過(guò)4次免疫，抗血清的效價(jià)均達(dá)到15 000倍以上(表2)，說(shuō)明被免疫的小鼠產(chǎn)生了抗體。

表2 各小鼠免疫效價(jià)Table 2 Immune titers of mice

在這4類藥物抗血清中，每種選擇效價(jià)較高的小鼠抗血清利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法進(jìn)行抗體靈敏度檢測(cè)。以0.2 mg/mL 濃度的JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA包被原分別包被酶標(biāo)板，分別配制 0、0.000 1、0.001 0、0.100 0、1.000 0、10.000 0、100.000 0 mg/L 7個(gè)梯度的菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(含 10%甲醇，pH 7.2)。每孔依次加入 50 μL 待測(cè)菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液、50 μL 抗血清(氯氰菊酯稀釋20 000倍、氯菊酯稀釋25 000倍、氟氯氰菊酯稀釋25 000倍、溴氰菊酯稀釋30 000倍)。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法的抑制曲線如圖4所示。從圖4可以看出，4種抗血清均有競(jìng)爭(zhēng)，隨著各菊酯標(biāo)準(zhǔn)品用量的增加，抑制率會(huì)逐漸升高；在1 mg/L時(shí)除了溴氰菊酯的抑制率低于50%，其余均高于50%，這說(shuō)明血清中的抗體和各菊酯發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，抗血清中存在針對(duì)菊酯的特異性抗體，直接證明了制備的各菊酯人工抗原合成成功。

圖4 各菊酯的抑制曲線Fig.4 Inhibition curve of each pyrethroid

3 討論

有關(guān)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的免疫檢測(cè)已經(jīng)有很多學(xué)者進(jìn)行了報(bào)道，菊酯類農(nóng)藥免疫檢測(cè)的一大難點(diǎn)就是設(shè)計(jì)合成其半抗原，現(xiàn)有研究一般采用全合成的方法進(jìn)行制備，而由此帶來(lái)的問(wèn)題是合成的半抗原會(huì)有很多手性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致免疫結(jié)果不理想，制備的抗體往往有滴度而沒有競(jìng)爭(zhēng)。 該研究首次以4種擬除蟲菊酯為事例，采用原藥經(jīng)臭氧氧化、氯代反應(yīng)、維悌希反應(yīng)、水解4步化學(xué)反應(yīng)合成半抗原，沒有改變藥物的手性結(jié)構(gòu)，最大限度地保留藥物本身的官能團(tuán)，這樣制備的抗體才能有較高的靈敏度和特異性。