隋怡，滕明剛，饒浠銳，楊麗，楊武德，柴慧芳

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）為薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，別名茨梨、文先果、送春歸[1]，味甘、酸澀，性平，歸脾、胃經(jīng)，主要產(chǎn)于貴州西部地區(qū)。刺梨含有多種活性成分，包括多糖類、有機(jī)酸類、黃酮類、三萜類化合物，因其富含超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和維生素C等抗氧化成分，素有“維C之王”的美譽(yù)[1]?，F(xiàn)代研究表明，刺梨具有健胃消食、止瀉、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2-3]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，越來越多的人被肥胖問題困擾[4]。肥胖的并發(fā)癥包括糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等，危害人體健康[5]。體質(zhì)量決定于能量的攝取和消耗之間的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體攝入的能量超過機(jī)體消耗的能量，過剩的能量便以脂肪形式儲(chǔ)存于脂肪組織中，形成肥胖[5]。目前降脂的藥物主要有他汀類、貝特類等，但其潛在肝毒性令人擔(dān)憂[6]。因此，尋找一種天然、不良作用小的減肥降脂化合物已經(jīng)成為亟待解決的問題。

前期研究發(fā)現(xiàn)，刺梨果汁有降低小鼠體質(zhì)量的作用。在此基礎(chǔ)上，探究刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠的影響，以期尋找到一種天然的減肥降脂化合物，為進(jìn)一步研究刺梨減肥降脂活性機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)刺梨應(yīng)用價(jià)值提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種健康成年小鼠（雄性，體質(zhì)量28 g～32 g）：貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究所，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（黔）2021-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度22℃～25℃、相對(duì)濕度50%～60%，各組小鼠自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)過程遵循貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理，倫理批準(zhǔn)號(hào)：20210032。

1.2 主要試劑

刺梨（貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)刺梨）：市售；辛伐他汀片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20084420）：山東鑫齊藥業(yè)有限公司；高脂飼料（組成：77.5%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.5%膽酸鹽）：江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司；總膽固醇檢測(cè)試劑盒、甘油三酯檢測(cè)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程有限公司；瘦素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；油紅O染色試劑盒：碧云天生物工程有限公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（SR-3000 Solvent Rack）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；質(zhì)譜儀（QT 0203 G 003）：美國(guó)布魯克（中國(guó)）有限公司；倒置相差顯微鏡（DIAPHOT 300）、顯微鏡成像系統(tǒng)（DS-Ri2）：日本尼康（中國(guó)）有限公司；自動(dòng)酶標(biāo)讀儀（aynorgy2）：美國(guó)百樂（中國(guó)）有限公司；離心機(jī)（VELOCITY 18R）：生命動(dòng)力Dynamica（中國(guó)）有限公司；石蠟包埋機(jī)（EG1150）、切片機(jī)（RM2235）：德國(guó)徠卡（中國(guó)）有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物的配制

取新鮮刺梨果1 kg，將鮮果充分榨汁，棄渣，取刺梨果汁，加70%乙醇低溫（4℃）回流提取，蒸發(fā)濃縮成125 g浸膏。將此浸膏加少量雙蒸水溶解，雙蒸水定容配制成含生藥分別為0.25、0.125、0.062 5 g/mL的刺梨醇提液，每種各200 mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取100 mg辛伐他汀片，研缽中加少量雙蒸水研磨溶解，雙蒸水定容至200 mL。配成0.5 mg/mL藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物的分組、造模與給藥

清潔級(jí)健康成年昆明種小鼠48只，雄性，28 g～32 g。隨機(jī)分為正常組（灌胃，生理鹽水）、模型組（灌胃，生理鹽水）、刺梨醇提物高劑量組（灌胃，5 g/kg，含生藥）、刺梨醇提物中劑量組（灌胃，2.5 g/kg，含生藥）、刺梨醇提物低劑量組（灌胃，1.25 g/kg，含生藥）、辛伐他汀組（灌胃，100 mg/kg），每組8只。除正常組進(jìn)食普通飼料外，其余各組每日自由進(jìn)食高脂飼料建立食源性肥胖模型。各給藥組以相應(yīng)劑量按0.2 mL/10 g連續(xù)灌胃給藥30 d，每日1次。實(shí)驗(yàn)期間每日稱取小鼠體質(zhì)量、飲食和飲水量并記錄。以模型組小鼠與正常組小鼠相對(duì)顯著升高為造模成功標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠眼眶血液，離心（2 500 r/min，15 min）取上清液為血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。立即處死各組小鼠，取肝臟，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 生化試劑盒檢測(cè)食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)測(cè)定

取各組血清，按試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)各組小鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.4 油紅O染色觀察食源性肥胖小鼠肝臟脂肪含量

取各組小鼠肝組織，置于4%多聚甲醛中固定24h。酒精梯度脫水后用石蠟包埋，切片。用油紅O染色試劑盒對(duì)各組切片進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。顯微鏡觀察各組切片肝臟脂肪染色情況并分析。

2.5 ELISA法檢測(cè)食源性肥胖小鼠血清瘦素含量

取各組小鼠血清，將樣本稀釋后，按瘦素ELISA試劑盒說明書進(jìn)行ELISA瘦素（leptin，LEP）檢測(cè)。

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠體質(zhì)量、飲食、飲水量的影響

為了探究刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠體質(zhì)量的影響，對(duì)各組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行了記錄，結(jié)果見表1。

表1 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠體質(zhì)量的影響（n=8）Table 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the body weight of food-induced obese mice（n=8）g

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自造模第20天起，模型組小鼠與正常組小鼠相比體質(zhì)量有顯著提升（P<0.05），隨后與正常組體質(zhì)量差距逐漸加大；與模型組相比，自給藥第25天起，刺梨醇提物高、中劑量組小鼠體質(zhì)量有顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，辛伐他汀組小鼠體質(zhì)量給藥第30天呈現(xiàn)顯著降低（P<0.05）；刺梨醇提物低劑量組小鼠體質(zhì)量與同時(shí)間段模型組相比，有降低趨勢(shì)但尚無顯著性差異。

對(duì)各組小鼠的每日飲食和飲水量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠每日飲食量的影響（n=8）Fig.1 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the daily food intake of food-induced obese mice（n=8）

圖2 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠每日飲水量的影響（n=8）Fig.2 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the daily water intake of food-induced obese mice（n=8）

每日各組小鼠飲水量圍繞4 mL上下浮動(dòng)，無顯著變化；自給藥第20天起，模型組小鼠飲食量與正常組相比顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，刺梨高、中、低劑量組小鼠飲食量顯著降低（P<0.05），與正常組小鼠相差不大；辛伐他汀組小鼠飲食量與模型組相比無顯著性差異。

3.2 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)的影響

為探究刺梨醇提物降血脂作用，測(cè)定食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表2 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)水平的影響（n=8）Table 2 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on serum lipid indexes of food-induced obese mice（n=8）mmol/L

結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高（P<0.05），呈現(xiàn)高血脂狀態(tài)；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組和辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量均顯著降低（P<0.05）；刺梨醇提物低劑量組僅血清LDL-C與模型組相比顯著降低（P<0.05），顯示出刺梨醇提物具有顯著降血脂作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.3 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠肝臟組織脂肪含量的影響

刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠肝臟組織脂肪含量的影響，見圖3。

圖3 油紅O染色觀察刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠肝組織脂肪含量的影響（n=8，×40）Fig.3 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the hepatic fat content of food-induced obese mice observed by oil red O staining（n=8，×40）

由圖3可以看到，與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟細(xì)胞散在大量脂滴；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組和辛伐他汀組肝細(xì)胞間散在脂滴顯著降低，刺梨醇提物低劑量組脂滴含量也有所降低。

3.4 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠血清瘦素含量的影響

觀察到刺梨醇提物能顯著降低食源性肥胖小鼠飲食量，進(jìn)一步檢測(cè)了各組小鼠血清瘦素，結(jié)果見表3。

表3 刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠血清瘦素的影響（n=8）Table 3 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the serum leptin of food-induced obese mice（n=8）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠血清瘦素含量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組小鼠血清瘦素含量均顯著降低（P<0.05）；而刺梨醇提物低劑量組和辛伐他汀組對(duì)小鼠血清瘦素影響與模型組相比無顯著性差異。

4 討論與結(jié)論

古籍中記載刺梨具有健胃消食、止瀉等功效[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)小鼠20 d可造成小鼠食源性肥胖模型。而刺梨醇提物高、中劑量組能顯著降低食源性肥胖小鼠體質(zhì)量，作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性，且兩組自給藥25 d起效，起效時(shí)間快于辛伐他?。?0 d）。小鼠血清血脂檢測(cè)和肝組織脂肪檢測(cè)結(jié)果顯示，食源性肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C含量、肝組織脂肪含量與正常組相比顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組和辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量和肝組織脂肪含量均顯著降低（P<0.05），顯示出刺梨醇提物對(duì)食源性肥胖小鼠具有顯著降血脂、降低肝組織脂肪含量的作用，作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性，且與辛伐他汀組相當(dāng)。

大量研究表明[6-8]，瘦素為由脂肪組織分泌的，具有調(diào)節(jié)能量代謝、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)攝食行為的循環(huán)激素。正常情況下，機(jī)體脂肪含量增加會(huì)促進(jìn)瘦素的釋放而發(fā)揮厭食作用；而肥胖人群血中瘦素含量遠(yuǎn)高于正常人群，但依舊沒有改善肥胖，瘦素的這種在肥胖人群中效價(jià)的降低現(xiàn)象稱之為“瘦素抵抗”[9]。一方面，瘦素主要通過與瘦素受體（leptin receptors，LRs）結(jié)合而發(fā)揮其生理作用[10]。瘦素受體中最重要的為表達(dá)于下丘腦的長(zhǎng)型瘦素受體，瘦素與LEP結(jié)合后，會(huì)激活JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)一步激活下丘腦弓狀核中的POMC神經(jīng)元（一種抑制食欲神經(jīng)元），而抑制下丘腦弓狀核中的NPY/AgRP神經(jīng)元（一種促食欲神經(jīng)元），從而引發(fā)厭食行為[9]。另一方面，脂肪組織分泌的瘦素同樣可以促進(jìn)細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）的釋放，其可以抑制JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制瘦素的作用，形成“瘦素抵抗”[11]。 另有研究認(rèn)為[12]，“瘦素抵抗”的原因還可能與瘦素?zé)o法正常透過血腦屏障進(jìn)而發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用有關(guān)。減輕“瘦素抵抗”被認(rèn)為是治療肥胖及肥胖相關(guān)并發(fā)癥的有效途徑。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自給藥第20天起，與模型組小鼠相比，刺梨醇提物高、中、低劑量組小鼠飲食量顯著降低（P<0.05），且辛伐他汀組小鼠飲食量與模型組相比變化不大。顯示出兩者降低體質(zhì)量和血脂的不同機(jī)制。辛伐他汀為膽固醇合成限速酶抑制劑，具有顯著降血脂作用；而刺梨醇提物降低肥胖小鼠體質(zhì)量和血脂的作用似乎與抑制肥胖小鼠攝食量密切相關(guān)。因此考察了各組小鼠血清瘦素的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清瘦素含量顯著升高（P<0.05），說明模型組小鼠體內(nèi)存在“瘦素抵抗”；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組小鼠血清瘦素含量均顯著降低（P<0.05），提示刺梨醇提物能夠?qū)故吃葱苑逝衷斐傻男∈笱迨菟厣叩默F(xiàn)象，降低血清瘦素，這可能與增加瘦素利用率、改善“瘦素抵抗”作用有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究表明，刺梨醇提物能顯著降低食源性小鼠體質(zhì)量、飲食量、血脂水平、肝臟脂肪含量，且這一作用與降低血清瘦素水平密切相關(guān)，為進(jìn)一步探究刺梨對(duì)瘦素通路的影響奠定基礎(chǔ)。