安麗 高鴻 劉艷秋 鐘毅 曹瑩 易菁 劉旸佟睿 潘志軍 王圣釗 吳昊 劉美言

1貴州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院（貴陽 550004）；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科（貴陽 550004）；3貴州醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心（貴陽 550025）；4貴陽市第四人民醫(yī)院麻醉科（貴陽 550007）

再灌注心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）是心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）后較為常見的并發(fā)癥之一［1］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［2］，低溫缺血再灌注后，RA 的發(fā)生與心肌細胞間縫隙連接通道的連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達減少有關(guān)，但Cx43 下調(diào)的機制尚不明確。文獻報道大部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的初生肽蛋白，需借助分子伴侶完成折疊與組裝，初生肽蛋白最初與分子伴侶熱休克蛋白40（heat shock protein 40，HSP40）和熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）形成復(fù)合物，通過應(yīng)激誘導(dǎo)磷蛋白1（stress induced phosphoprotein 1，STIP1）與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）結(jié)合后完成折疊組裝［3］，HSP90 可與Cx43 結(jié)合，發(fā)揮心臟保護作用［4］，而未折疊或錯誤折疊的Cx43 易被泛素化降解［5］。另有研究［6］表明STIP1 在缺氧處理的心肌細胞中低表達，而STIP1 基因敲除的小鼠可致胚胎死亡［7］，這表明該分子是必不可少的輔助伴侶。然而，RA 的發(fā)生及心肌細胞Cx43 蛋白的下調(diào)是否與STIP1 有關(guān)，目前未見相關(guān)報道。本研究通過建立大鼠Langendroff 離體心臟灌注模型，采用Mapping Lab 矩陣式電生理標(biāo)測系統(tǒng)及Western blot 和免疫組化檢測STIP1、Cx43 蛋白表達和分布，探究STIP1 通過調(diào)節(jié)Cx43 表達影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導(dǎo)的機制，為尋求防治RA 的新靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 本研究已獲貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（審核批號：NO.2200996）。選擇體質(zhì)量250 ～ 350 g，健康清潔級2～3月齡雄性SD 大鼠16 只，腹腔注射3%肝素3 125 U/kg 進行抗凝10 min 處理后，再腹腔注射1%的戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g 完成麻醉，待麻醉生效之后，開胸迅速取出心臟，并置于4 ℃的K-H 液（mmol/L：NaCl 118、CaCl21.26、KCl 4.5、MgSO4·7H2O 1.22、KH2PO41.18、C6H12O611.1、NaHCO324.99、pH 值7.4）中，沖洗主動脈內(nèi)的殘留血液，顯露并修剪主動脈后，固定主動脈于IH-SR，844 型Langendorff 灌注裝置（德國HUGO SACHS ELEKTRONIK-HARVARD APPA RATUS GmbH D-79232 March-Hugstetten）上，主動脈插管深度距主動脈瓣距離>2 mm，用95%O2-5%CO2預(yù)充K-H 液，設(shè)置灌流恒溫（36.5～37.5 ℃）、恒壓（8.65 kPa）后進行逆行非循環(huán)式灌注。Langendroff 離體心臟灌注模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為：在平衡灌注上述K-H 液10 min 內(nèi)離體心臟恢復(fù)正常節(jié)律跳動且心率（heart rate，HR）>180 次/min。

1.2 實驗分組 將建立成功的離體心臟模型16個，通過數(shù)字表法隨機分成兩組，每組8 個。對照組（C 組）：持續(xù)灌注37 ℃K-H 液120 min；低溫缺血再灌注組（IR組）：持續(xù)灌注37 ℃K-H液30 min后，經(jīng)主動脈根部注射4 ℃20 mL/kg Thomas 停跳液（mmol/L：NaCl 110、KCl 16.1、CaCl21.26、NaHCO39.99、MgCl 15.96、pH 值7.8）使心臟停搏后停灌K-H液60 min，心臟在停跳期間，被置于4 ℃K-H 液中，在心臟停灌的30 min 時，被追加半量4 ℃10 mL/kg Thomas 液經(jīng)主動脈根部注射，停跳60 min 結(jié)束后經(jīng)主動脈根部再灌注37 ℃K-H 液30 min。

1.3 微電極陣列測定心室肌前壁電傳導(dǎo) 持續(xù)灌注15 min 后，于左心室前壁放置64 矩陣式電極固定，放置參考電極于主動脈根部，隨后將電極導(dǎo)線與Mapping Lab 矩陣式電生理標(biāo)測系統(tǒng)的信號輸入線連接，根據(jù)采集的局部場電位調(diào)整矩陣式電極與心臟貼合情況，記錄左心室局部的電傳導(dǎo)情況。分別采集持續(xù)灌注15 min（T0）、持續(xù)灌注30 min（T1）、再灌注15 min 即C 組持續(xù)灌注105 min（T2）、再灌注30 min 即C 組持續(xù)灌注120 min（T3）各時點的HR、傳導(dǎo)速度（conduction velocity，CV）和電傳導(dǎo)圖。分別記錄并觀察心臟復(fù)跳的時間和再灌注30 min 內(nèi)心律失常發(fā)生的類型及其持續(xù)時間，參照文獻［8］行心律失常評分。再灌注結(jié)束立刻取左心室心肌組織置于液氮凍存，待心肌組織冰凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，另取心肌組織用多聚甲醛溶液（10 g/L）固定后放置于-4 ℃冰箱保存待后續(xù)檢測。

1.4 Western blot 法檢測STIP1 和Cx43 的表達取出-80 ℃冰箱中的心室肌組織，冰上研磨后加入裂解液（RIPA）提取各組心肌組織的總蛋白，通過BCA 試劑盒來檢測各組的總蛋白濃度后定量。在12%的SDS-PAGE 分離膠進行電泳后轉(zhuǎn)膜，洗膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，徹底清洗后分別用抗Cx43兔抗大鼠一抗（1∶1 000，Affinity 公司，美國），抗STIP1 兔抗大鼠一抗（1∶1 000，Affinity 公司，美國）4 ℃孵育過夜。第2 天加入標(biāo)記為HRP 的二抗（1∶1 000，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國）后，置于室溫振蕩器中孵育1 h，隨后ECL 顯影并應(yīng)用全自動化學(xué)放光成像系統(tǒng)（Tanon-5200 上海天能科技有限公司，中國）曝光。通過Image J 圖像軟件分析各組條帶的灰度值，以GAPDH（1∶1 000，Bioword公司，美國）為內(nèi)參并計算其相對的蛋白表達量。

1.5 免疫組化檢測Cx43 蛋白分布 取出-4 ℃冰箱中多聚甲醛溶液固定的心室肌組織，用EDTA 脫鈣液脫鈣，乙醇脫水并石蠟包埋后切片，用滅活內(nèi)源性酶將切片放置在體積分數(shù)為20%H2O2的蒸餾水中5～10 min，隨后在枸櫞酸鹽緩沖液中浸泡，并用高壓鍋將其加熱沸騰修復(fù)抗原后，滴加5%牛血清白蛋白（BSA）的封閉液置于37 ℃的溫箱15 min，之后滴加稀釋的抗Cx43 的一抗（1∶100，Affinity 公司，美國），抗STIP1 的一抗（1∶100，Affinity 公司，美國）置于4 ℃溫箱過夜，次日滴加辣根過氧化物酶的二抗IgG1（1∶1 000，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）置于37 ℃的溫箱中20 min 后，滴加免疫組化試劑SABC 染色，隨后用DAB 顯色劑顯色和蘇木精復(fù)染、然后將其脫水后透明并封片。置于全玻片的光學(xué)顯微鏡下（OLYMPUS SLIDEVIEW VS200，儀景通光學(xué)科技上海有限公司）觀察，其中陽性為棕黃色染色，陰性為不著色。用Image J 圖像分析軟件分析各著色蛋白的平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，各時點組間比較用重復(fù)測量方差分析，P<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心律失常的發(fā)生情況 C 組：持續(xù)灌注期間無心律失常發(fā)生；IR 組：再灌注時8 例在30 s內(nèi)均恢復(fù)心跳，發(fā)生心律失常有7 例，心律失常的發(fā)生類型、持續(xù)時間及心律失常的評分見表1。

表1 兩組大鼠心律失常及評分比較Tab.1 Comparison of arrhythmias and scores between two groups of rats ±s

表1 兩組大鼠心律失常及評分比較Tab.1 Comparison of arrhythmias and scores between two groups of rats ±s

注：IR 組心律失常發(fā)生率為87.5%

組別C 組IR 組例數(shù)8 8復(fù)跳時間（s）0 26.00±6.14室早（例）0 4室顫（例）0 3心律失常持續(xù)時間（min）0 8.74±8.63心律失常評分（分）0 3.13±2.64

2.2 兩組不同時點HR 及CV 的比較 C 組：各時點的HR 及CV 未見明顯的差異（P> 0.05），IR 組：T2與T3時點與T0與T1時點比較，其HR 及CV 出現(xiàn)明顯減慢（P<0.05），見表2、3。

表2 兩組大鼠不同時點HR 的比較Tab.2 Comparison of HR between two groupst rats at different times ±s，次/min

表2 兩組大鼠不同時點HR 的比較Tab.2 Comparison of HR between two groupst rats at different times ±s，次/min

注：與C 組比較，IR 組，T2、T3與T0、T1比較，*P<0.05

組別C 組IR 組P 值例數(shù)8 8 T0 290.4±7.7 302.6±10.9 0.269 T1 302.5±7.9 307.1±9.5 0.193 T2 307.8±7.9 237.0±23.5*0.003 T3 313.4±6.4 278.0±13.9*0.006

表3 兩組大鼠不同時點CV 的比較Tab.3 Comparison of CV between two groups rats at different times ±s，mm/ms

表3 兩組大鼠不同時點CV 的比較Tab.3 Comparison of CV between two groups rats at different times ±s，mm/ms

注：與C 組比較，IR 組，T2、T3與T0、T1比較，*P<0.05

組別C 組IR 組P 值例數(shù)8 8 T0 2.2±0.3 2.5±0.4 0.118 T1 2.4±0.2 2.5±0.1 0.281 T2 2.3±0.1 1.7±0.1*0.001 T3 2.9±0.1 1.9±0.1*0.001

2.3 不同時點左心室肌前壁傳導(dǎo)方向 Mapping Lab 64 矩陣式電生理指標(biāo)測示可見，C 組：與T0時點相比，T1、T2、T3時點傳導(dǎo)方向未見改變。IR 組：與T0時點相比，T1時點傳導(dǎo)方向未見明顯改變，T2、T3時點傳導(dǎo)方向呈發(fā)散改變，見圖1。

圖1 兩組離體心臟不同時點傳導(dǎo)方向Fig.1 The conduction direction of two groups of isolated hearts at different time points

2.4 Western blot 檢測STIP1、Cx43 蛋白表達 與C 組比較，IR 組STIP1、Cx43 蛋白表達均明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 兩組大鼠心室肌Cx43、STIP1 蛋白表達Fig.2 Expression of Cx43 and STIP1 proteins in ventricular muscle of two groups rats

2.5 左心室肌免疫組化檢測STIP1、Cx43 蛋白分布 免疫化學(xué)分析兩組間心肌組織內(nèi)STIP1 和Cx43 陽性著色細胞的平均光密度。呈棕黃色顆粒狀為陽性著色，藍色表示心肌細胞的細胞核。與C 組比較，IR 組STIP1、Cx43 蛋白的陽性分布減少（P<0.05），另Cx43 蛋白的陽性分布有從端端轉(zhuǎn)為側(cè)側(cè)的鏈接情況，并呈凌亂排列，黑色箭頭為閏盤處的Cx43，紅色箭頭為Cx43 的側(cè)偏化。見圖3。

圖3 兩組大鼠心室肌免疫組化染色結(jié)果（×200）Fig.3 Results of immunohistochemical staining in ventricular muscle of two groups rats（×200）

3 討論

在體外循環(huán)下實施心內(nèi)直視手術(shù)過程中，雖對心肌進行了低溫高鉀停跳液等保護措施處理，但心臟復(fù)跳時RA 仍是較常見的并發(fā)癥，使此類手術(shù)的成敗和患者預(yù)后常受到影響［9］。如何改善RA 的發(fā)生，是目前一直研究的熱點。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)［2］：低溫缺血再灌注后，RA 的發(fā)生與Cx43表達減少有關(guān)，但對其機制不清，是否通過改善心肌缺血再灌注后Cx43 下調(diào)，從而減少RA 的發(fā)生，是本實驗預(yù)探究的問題。

位于心肌細胞閏盤（intercalated disc，ID）的Cx43 是哺乳動物心室肌細胞膜上表達最豐富一種特殊的通道連接蛋白［10-11］，大量文獻證實在RA 的發(fā)生發(fā)展中，Cx43 發(fā)揮著重要作用［12］。MAHONEY

等［13］研究報道，小鼠心肌細胞中心室CV 下降與Cx43 的表達下降有關(guān)。JUNG 等［14］研究認為，大鼠心臟的Cx43 基因被敲除后，可致心肌細胞間的電傳導(dǎo)出現(xiàn)障礙，引起惡性心律失常。李偉超等［15］研究認為七氟醚可穩(wěn)定心肌細胞間Cx43 的分布與表達，減輕RA 的發(fā)生。另有研究［16］表明，初生肽蛋白最初由HSP40 和HSP70 形成的復(fù)合物募集，然后在STIP1 的幫助下轉(zhuǎn)移到HSP90 上完成折疊與組裝，而未折疊或錯誤折疊的蛋白易被泛素化降解［17］。在真核生物中，HSP90 作為伴侶蛋白與HSP70 一起控制蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［18］。WEI 等［19］研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素可通過抑HSP70/HSP40 的表達來促進Cx43 的表達，從而改善心肌肥厚。RODRIGUEZ-SINOVAS 等［20］發(fā)現(xiàn)HSP90 與Cx43 結(jié)合，通過TOM20 途徑促進Cx43 線粒體易位，發(fā)揮其心臟保護功能。Cx43 的折疊與組裝也依賴于HSP90［21-22］。STIP1（也稱為HSP70-HSP90 組織蛋白或HOP）作為熱休克蛋白HSP70 和HSP90 之間相互作用的介質(zhì)，參與客戶蛋白形成成熟的結(jié)構(gòu)蛋白［23］，另一項研究［24］表明，STIP1 可防止缺血介導(dǎo)的細胞凋亡，具有神經(jīng)保護作用，XIN 等［6］發(fā)現(xiàn)大鼠心肌H9c2 細胞進行缺氧復(fù)氧處理后，STIP1的表達明顯降低。故本研究通過建立大鼠心臟Langendroff 離體灌注模型，采用Mapping Lab 矩陣式電生理標(biāo)測系統(tǒng)檢測了心室肌表面?zhèn)鲗?dǎo)方向及速度，并應(yīng)用Western blot 和免疫組化檢測STIP1及Cx43 蛋白的表達和分布情況，以探討低溫缺血再灌注心律失常的發(fā)生及Cx43 表達下調(diào)是否與STIP1 有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，C 組8 只大鼠持續(xù)灌注期間均未發(fā)生心律失常，而IR 組，再灌注期間心律失常發(fā)生率較高，室早和室顫均有發(fā)生，該結(jié)果進一步證實再灌注心律失常是缺血再灌注較為常見的并發(fā)癥，與BERNIKOVA 等［25］研究發(fā)現(xiàn)一致。另IR 組在T2、T3的HR 和心室壁CV 均顯著減慢，并伴隨傳導(dǎo)方向的改變，該結(jié)果電傳導(dǎo)的改變可能因缺血再灌注后心肌損傷引起心肌細胞間縫隙連接通道的Cx43 減少使縫隙連接電阻增加所致。通過Western blot 和免疫組化進一步驗證，IR 組相比C 組，STIP1 及Cx43 蛋白水平的表達均明顯下調(diào)，另C 組中，可見Cx43 陽性著色的棕黃色顆粒在心肌閏盤處呈規(guī)律分布并表達量較多，而IR 組Cx43蛋白的分布出現(xiàn)從心肌細胞間的端端轉(zhuǎn)向側(cè)側(cè)連接的偏側(cè)化現(xiàn)象，說明低溫缺血再灌注后STIP1低表達可能影響了Cx43 的表達和分布，從而影響心肌細胞間離子通道功能，引起心室肌電傳導(dǎo)的改變。根據(jù)上述結(jié)果推測低溫全心缺血再灌注后，心室肌電傳導(dǎo)減慢、傳導(dǎo)方向改變，這可能與低溫缺血再灌注后心室肌STIP1 表達下調(diào)致Cx43表達減少有關(guān)。本研究結(jié)果為RA 中Cx43 的低表達提供了一個可能的解釋，其機制仍需進一步研究。

綜上所述，低溫缺血再灌注心律失常大鼠心室肌Cx43 下調(diào)可能與STIP1 的下調(diào)有關(guān)，STIP1 可能通過調(diào)節(jié)Cx43 表達影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導(dǎo)，STIP1 可能是探究再灌注心律失常的新靶點。