孫雨航，王嘉琦，崔曉倩，王清龍，常賀強(qiáng)，代玲敏，韓國民*

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

乙醛是一種強(qiáng)烈的揮發(fā)性化合物，源于植物新陳代謝，廣泛存在于各種食物（如水果、蔬菜、乳制品）與自然環(huán)境中。研究表明，人們接觸乙醛的主要途徑是飲用酒精飲料，其次是吸煙和食用含有調(diào)味劑的各種食品[1]。葡萄酒是一種以葡萄或葡萄汁為原料經(jīng)全部或部分發(fā)酵形成的酒精飲料，乙醛是影響其感官質(zhì)量的重要羰基化合物之一，在不同種類葡萄酒中含量有所不同。在紅白葡萄酒中乙醛含量分別為4～212 mg·L-1和11～494 mg·L-1；在加強(qiáng)型葡萄酒中，如雪莉酒中的乙醛含量（90～500 mg·L-1）明顯高于紅白葡萄酒[2]。葡萄酒中乙醛含量能明顯改變葡萄酒風(fēng)味特征。Arias-Pérez等[3]研究表明，低濃度乙醛可以帶來一些水果等令人愉快的香氣特征，高濃度乙醛則會(huì)帶來類似青草或青蘋果等不良氧化氣味[4]。此外，當(dāng)含量較高時(shí)，會(huì)增強(qiáng)其他醛類（飽和、不飽和和Strecker醛類）的“綠色蔬菜”味以及與高濃度異戊醇相關(guān)的“灼燒”效果[3]。同時(shí)，在葡萄酒陳釀過程中，乙醛介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)是酚類物質(zhì)演變的重要途徑之一[5]。酒中乙醛形成途徑通常被認(rèn)為有3種：微生物新陳代謝[2]，芬頓反應(yīng)作用下乙醇被羥基自由基氧化[6]，乙醇被高度氧化的硫酸鹽自由基氧化[7]。

乙醛在葡萄酒中的形成貫徹整個(gè)工藝環(huán)節(jié)且來源途徑多樣，已經(jīng)被證明具有高度的化學(xué)反應(yīng)性，參與眾多葡萄酒陳釀反應(yīng)，其含量嚴(yán)重影響葡萄酒的質(zhì)量[8]。因此，了解生產(chǎn)各階段乙醛來源對(duì)合理控制其含量至關(guān)重要。本文旨在概述乙醛在葡萄酒生產(chǎn)中各階段的主要來源，包括酒精發(fā)酵（AF）、蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）、微氧陳釀及瓶貯陳釀，為減少或避免乙醛的產(chǎn)生，提高葡萄酒安全質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 酒精發(fā)酵階段的乙醛

在酒精發(fā)酵過程中，乙醛主要來自酵母的新陳代謝，是酒精發(fā)酵過程的中間產(chǎn)物，不同酵母菌株的乙醛產(chǎn)生能力有很大差異，且在不同發(fā)酵時(shí)期的產(chǎn)生量也各不相同。相關(guān)研究對(duì)葡萄酒中10種常見酵母菌產(chǎn)乙醛的能力進(jìn)行了分析，認(rèn)為釀酒酵母與葡萄酒中乙醛水平緊密相關(guān)，釀酒酵母產(chǎn)乙醛量為0.5～286 mg·L-1，而德爾布有孢圓酵母產(chǎn)乙醛量僅為0.5～5 mg·L-1[2]。近年對(duì)26株酵母產(chǎn)生和降解乙醛能力的研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母和釀酒酵母表現(xiàn)出相似的代謝動(dòng)力學(xué)，在發(fā)酵開始時(shí)乙醛含量達(dá)到初始峰值，然后部分再利用；并且相比釀酒酵母來說，非釀酒酵母之間的乙醛殘留量變化較大，為0～50 mg·L-1不等[9]。

酒精發(fā)酵過程中，乙醛的動(dòng)態(tài)變化可以分為3個(gè)階段。首先在發(fā)酵開始的延滯期（圖1），葡萄糖通過協(xié)助擴(kuò)散的方式進(jìn)入酵母細(xì)胞，經(jīng)糖酵解途徑轉(zhuǎn)化成丙酮酸；丙酮酸在硫胺素焦磷酸（Thiamine-PP）和丙酮酸脫羧酶（Pyruvatedecarboxylases）的作用下生成乙醛和CO2，乙醛在酒精發(fā)酵的早期階段積累起來[10]，達(dá)到最大濃度，隨后乙醇脫氫酶基因（Adh1p）同工酶的激活導(dǎo)致乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇，從而影響乙醛和酒精的積累[11-12]。乙醛的含量緩慢降低，同時(shí)NADH被氧化為NAD+，一直持續(xù)到酒精發(fā)酵結(jié)束。在此過程中，有少量的乙醛被乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸酯，所以乙醛脫氫酶在葡萄酒發(fā)酵中對(duì)乙醛的含量同樣具有重要影響[13]。其次在酵母生長階段，所添加的SO2通過與產(chǎn)生的乙醛強(qiáng)烈結(jié)合，基本上去除了酒精發(fā)酵的末端電子受體[9]；為了維持氧化還原平衡，酵母通過增加乙醛的形成來回應(yīng)SO2，打破平衡狀態(tài)，使平衡移動(dòng)，由此促進(jìn)了酒精發(fā)酵過程中乙醛的積累。最后，到達(dá)酒精發(fā)酵末期后，在酵母的穩(wěn)定期乙醛濃度下降[8]，此時(shí)乙醛被酵母本身或乳酸菌相繼降解[14]，而糖酵解產(chǎn)生的部分丙酮酸會(huì)通過丙酮酸脫羧酶（PDC）最終轉(zhuǎn)化為乙醛和CO2。

發(fā)酵條件也同樣影響酒精發(fā)酵過程中乙醛的積累。在模式酒體系下和葡萄汁中的研究表明，各類酵母菌株在發(fā)酵初期乙醛的生成量迅速升高，當(dāng)酵母生長到對(duì)數(shù)末期時(shí)，乙醛生成量達(dá)到最大值。對(duì)數(shù)期結(jié)束后，發(fā)酵葡萄汁中的乙醛含量迅速降低[15]。試驗(yàn)證明，緩沖液pH的增加會(huì)增加S.pombe靜息細(xì)胞的乙醛峰值和最終濃度，將發(fā)酵溫度升到30 ℃時(shí)，加速了葡萄糖的降解速率，促進(jìn)了乙醛的生成速率[16]；另外，在酒精發(fā)酵階段厭氧條件、較低pH、高糖和高SO2添加量等都可使酵母產(chǎn)生更多乙醛[17]，并使其在葡萄酒中維持較高的含量。

2 蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段的乙醛

葡萄酒中還涉及乳酸菌參與的蘋果酸-乳酸發(fā)酵，幾乎所有的紅葡萄酒在酒精發(fā)酵之后都會(huì)進(jìn)行該過程[18]。MLF中微生物以蘋果酸為發(fā)酵底物[19]，經(jīng)蘋果酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為L-乳酸和CO2，起到降低酸度、優(yōu)化香氣[20]、增強(qiáng)生物穩(wěn)定性的作用，還可降低酒體變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)[19]。此外，酒精發(fā)酵積累的乙醛在該過程中可被進(jìn)一步代謝，但在MLF發(fā)酵初期還會(huì)生成一定量的乙醛。在葡萄酒pH較低的情況下（pH＜3.5），酒酒球菌（Oenococcus oeni）占據(jù)主導(dǎo)地位，同時(shí)產(chǎn)生乙醛、雙乙酰、乙酸、乙炔和2,3-丁二醇等風(fēng)味化合物，也有報(bào)道[21]認(rèn)為乳酸菌通過對(duì)乙醛的分解代謝改善葡萄酒的香氣。在MLF過程中，乳酸菌能夠降解結(jié)合態(tài)SO2，增加游離態(tài)SO2[22]，降低乳酸菌活性，從而使MLF過程漫長，導(dǎo)致乙醛大量積累。此外，大量研究表明，在MLF過程中酒酒球菌會(huì)代謝乙醛，乳酸菌在葡萄酒中的乙醛還原中起著重要作用[12,23-24]。近期研究證明了另一種與O.oeni功能相似的乳桿菌(L.plantarum)，在MLF過程中提高了葡萄酒的乙醛水平[25]。對(duì)比這兩種菌在模擬葡萄酒培養(yǎng)基產(chǎn)生的乙醛濃度，由于L.plantarum相對(duì)O.oeni來說乙醛消耗率更低，因此接種L.plantarum的培養(yǎng)基中含有更高濃度的乙醛。研究還表明，當(dāng)基質(zhì)中存在足夠能量時(shí)，L.plantarum在MLF過程中可能具有產(chǎn)生乙醛的能力[23]。但是，目前尚不明確乳酸菌在葡萄酒中是否具有合成乙醛的作用[4]。盡管乳酸菌以及MLF環(huán)節(jié)很重要，但目前很少有研究此過程中乙醛含量變化的報(bào)道，在MLF中酒精和乙醛的轉(zhuǎn)化需要更多的研究來證實(shí)[15]。

在MLF期間大多數(shù)釀酒師都不希望使用微氧處理（Mox），但MLF的自然觸發(fā)性往往無法避免這種情況。在MLF的不同階段進(jìn)行Mox，會(huì)產(chǎn)生不同程度的乙醛積累。在MLF前進(jìn)行Mox，可以使乙醛的化學(xué)轉(zhuǎn)化率更高，此時(shí)涉及氧氣與酚類物質(zhì)的反應(yīng)[26]，對(duì)葡萄酒結(jié)構(gòu)的改善能起到更好的效果[27]。此外，Dai等[15]在模擬酒系統(tǒng)中的試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸菌在微氧化處理的起始階段會(huì)產(chǎn)生乙醛，而乙醛隨微生物的作用而變化，一旦觸發(fā)MLF，乳酸菌就會(huì)消耗乙醛，無論Mox如何，乙醛都可以被乳酸菌代謝。

3 微氧處理對(duì)陳釀階段乙醛的影響

Mox可用于釀酒過程的不同階段。釀酒師通過提供可控水平的氧氣，以產(chǎn)生所需的葡萄酒感官效果。在酒精發(fā)酵過程中應(yīng)用Mox的目的是幫助酵母產(chǎn)生膜脂，從而提高酵母活力和乙醇耐受性，在AF之后以及MLF前后應(yīng)用Mox的主要目的是穩(wěn)定顏色和改變香氣特性，在此過程中對(duì)乙醛的產(chǎn)生和消耗會(huì)產(chǎn)生一定影響。Mox過程中發(fā)生的典型化學(xué)反應(yīng)是葡萄酒主要氧化產(chǎn)物乙醛介導(dǎo)酚類物質(zhì)發(fā)生的縮合和聚合反應(yīng)[28]。

化學(xué)氧化是葡萄酒在微生物發(fā)酵后產(chǎn)生乙醛的主要途徑。在沒有微生物消耗氧氣的情況下，乙醛會(huì)隨著Mox時(shí)間的推移不斷增加[15]。葡萄酒化學(xué)氧化形成乙醛主要通過3個(gè)步驟：首先氧氣在金屬離子（Fe/Cu）催化作用下，將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)，同時(shí)氧氣被還原為過氧化氫；然后過氧化氫與Fe（II）和Cu（I）一起啟動(dòng)芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基[29]；羥基自由基是氧自由基中已知氧化活性最強(qiáng)的氧化劑，幾乎可以氧化葡萄酒中所有成分，但是它的壽命很短，作用半徑很小，僅能和它鄰近的分子發(fā)生反應(yīng)，將除水外含量最高的乙醇，氧化生成乙醛[30]。其反應(yīng)速率主要取決于SO2的濃度[31]、其他抗氧化劑（如谷胱甘肽[5]）的濃度和葡萄酒中可用活性多酚的水平[30]。

氧氣的消耗和乙醛積累的關(guān)系對(duì)于科學(xué)管理葡萄酒陳釀，獲得更高品質(zhì)的葡萄酒有著重要的意義。Almudena等[32]比較了外源乙醛和過度氧化對(duì)葡萄酒陳釀中乙醛變化的影響，結(jié)果表明過度氧化葡萄酒中沒有積累較多的乙醛不是因?yàn)樯傻囊胰﹨⑴c了陳釀反應(yīng)，而是化學(xué)氧化不會(huì)快速產(chǎn)生較多的乙醛，認(rèn)為大部分不參與氧化SO2的H2O2并沒有全部用于氧化乙醇生成乙醛，而是可能氧化了葡萄酒中的其他主要成分。

氧氣可以提高酵母的活力和乙醇耐受性[12]。有研究表明，發(fā)酵后微氧處理一段時(shí)間后，會(huì)使葡萄酒重新出現(xiàn)有活力的釀酒酵母[33]。該階段存在的酵母進(jìn)行有氧呼吸的耗氧率遠(yuǎn)大于化學(xué)氧化，并且酵母有氧代謝會(huì)比化學(xué)氧化更快地積累乙醛[15,34]。

4 瓶貯陳釀階段的乙醛

新鮮葡萄酒在感官方面往往存在一些不足，通常在瓶中儲(chǔ)存一段時(shí)間后會(huì)達(dá)到最佳飲用期。在瓶儲(chǔ)過程中，葡萄酒內(nèi)部發(fā)生一系列氧化反應(yīng)，乙醇通過化學(xué)氧化形成的乙醛有助于改善葡萄酒的香氣，乙醛可以作為瓶裝葡萄酒發(fā)生氧化的標(biāo)志[35]。

瓶儲(chǔ)過程中，在Fe2+/Fe3+催化作用下氧氣通過芬頓反應(yīng)形成H2O2和HO-，從而使乙醇氧化生成乙醛[35]，此過程產(chǎn)生的H2O2會(huì)促進(jìn)芬頓反應(yīng)中乙醛的積累。瓶儲(chǔ)葡萄酒中乙醛的產(chǎn)生和積累很大程度上取決于葡萄酒中氧氣的可用性，高濃度的氧氣有利于揮發(fā)性化合物的積累[36]，因此，瓶塞對(duì)乙醛的產(chǎn)生與積累也會(huì)有一定影響，水平放置的葡萄酒酒液與瓶塞接觸，會(huì)減緩氣體傳輸速率，避免乙醛的過量積累，從而影響葡萄酒品質(zhì)。此外，瓶塞類型（透氧性）也會(huì)通過影響自由態(tài)SO2含量進(jìn)而對(duì)葡萄酒顏色參數(shù)（耐亞硫酸鹽漂白色素）產(chǎn)生影響[37]，較高透氧量的瓶塞，可以使更多的氧氣進(jìn)入葡萄酒，而葡萄酒氧化產(chǎn)生的乙醛可以介導(dǎo)花色苷與單寧生成聚合色素[38]，這些色素能耐亞硫酸鹽漂白并不受pH變化的影響，能夠穩(wěn)定存在于葡萄酒中，對(duì)葡萄酒顏色穩(wěn)定性具有積極作用。瓶貯陳釀階段時(shí)葡萄酒中SO2含量高，會(huì)抑制葡萄酒中乙醛的產(chǎn)生[37-39]，游離SO2通過與酚類氧化產(chǎn)物反應(yīng)，阻斷乙醇被酚類物質(zhì)氧化從而抑制乙醛的生成。當(dāng)然，如果發(fā)生過度氧化，瓶中的醋酸菌，會(huì)代謝乙醛生成醋酸，這是葡萄酒變質(zhì)的標(biāo)志。

研究表明，溫度、曝光和放置方式均會(huì)影響到葡萄酒氧化速率，從而影響瓶儲(chǔ)過程中乙醛的產(chǎn)生和積累[35]。溫度高于20 ℃時(shí)，葡萄酒會(huì)加速氧化。光照（尤其是紫外線）是葡萄酒發(fā)生氧化及產(chǎn)生反應(yīng)性氧化物質(zhì)的重要條件，因此葡萄酒在儲(chǔ)存過程中的曝光也會(huì)加速其氧化，進(jìn)而促進(jìn)乙醛的產(chǎn)生。

5 其他來源的乙醛

除了酵母，在葡萄和釀酒設(shè)備中存在的重要污染微生物醋酸菌也會(huì)產(chǎn)生乙醛[2]。在氧氣參與下，醋酸菌可以先將乙醇氧化成乙醛，進(jìn)一步將乙醛氧化成乙酸。當(dāng)乙酸濃度達(dá)250 mg·L-1[24]，已遠(yuǎn)高于葡萄酒中揮發(fā)性香氣化合物的感官閾值。如果此時(shí)處于低氧或乙醇濃度高于10%的情況下，則會(huì)阻止乙酸的轉(zhuǎn)化，從而造成乙醛的積累，影響葡萄酒品質(zhì)。

不同葡萄酒中乙醛含量不同。與紅葡萄酒相比，雪莉酒的乙醛含量要高很多。其中，菲諾型雪莉酒經(jīng)歷了生物陳釀[40]，當(dāng)乙醇含量低于15%（Vol）時(shí)，葡萄酒表面的flavor酵母進(jìn)行生物陳釀，產(chǎn)生大量乙醛。乙醛作為生物陳釀過程中產(chǎn)生的最主要的揮發(fā)性化合物之一[41]，對(duì)雪莉酒獨(dú)特的感官特性有重要的貢獻(xiàn)。菲諾雪莉酒的生物陳釀發(fā)生在酒精發(fā)酵結(jié)束后，酵母由發(fā)酵代謝變成氧化代謝，在酒液表面形成一層白色生物膜，保護(hù)葡萄酒免受過度氧化[42]。此時(shí)，乙醛由酵母產(chǎn)生，主要生成途徑是乙醇被ADH II氧化。有研究表明，在使用不同釀酒酵母菌種生產(chǎn)的雪莉酒研究中發(fā)現(xiàn)，具有高乙醇脫氫酶II活性的酵母菌種最能體現(xiàn)雪莉酒典型的感官特性。因?yàn)檫@類菌株在薄膜中緩慢而持久的生長使得乙醛在葡萄酒中能夠持續(xù)積累[42]，并且可以加速乙醇、甘油和揮發(fā)性酸的消耗[40]。

6 總結(jié)與展望

在過去的幾十年里，葡萄酒中的乙醛已被廣泛研究。酒精發(fā)酵、蘋果酸-乳酸發(fā)酵、微氧陳釀及瓶貯陳釀等生產(chǎn)階段都會(huì)形成乙醛。適量乙醛在干紅葡萄酒陳釀期間促進(jìn)酚類化合物反應(yīng)形成聚合色素，穩(wěn)定葡萄酒的顏色，但過量乙醛會(huì)加速葡萄酒的老化，并帶來不愉悅的氣味，嚴(yán)重影響葡萄酒的品質(zhì)。

乙醛形成和積累途徑的多樣化及其較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)能力，給葡萄酒的生產(chǎn)實(shí)踐帶來了很大的考驗(yàn)。因此，葡萄酒生產(chǎn)中應(yīng)精確控制工藝條件，及時(shí)追蹤乙醛變化，以進(jìn)一步提升和穩(wěn)定葡萄酒的品質(zhì)。