鄧星 韓艷 彭偉 段超群 李清 劉珍 解興興

隨著輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART) 的發(fā)展,胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣成為成功進行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization -embryo transfer,IVFET) 治療的關(guān)鍵因素之一［1］。因此,選擇具有發(fā)育潛力的胚胎移植來實現(xiàn)單胎妊娠及健康活產(chǎn)是IVF-ET 的最終目標(biāo)。近年來單囊胚移植被當(dāng)做在IVF-ET 治療中達到最終目標(biāo)的最有效措施。文獻報道［2,3］在IVFET 中行單囊胚移植不僅可以明顯降低多胎妊娠率,同時可以獲得更好的產(chǎn)科分娩結(jié)局。目前胚胎形態(tài)學(xué)評分系統(tǒng)由于無創(chuàng)方便,一直被用作評估胚胎發(fā)育潛力的主要工具。然而,以往的研究報道,人類雌雄原核的大小幾乎相同［4］。與兩原核(two pronuclear,2PN)直徑相差＜4 μm 的受精卵相比,2PN 直徑相差＞4 μm 的受精卵,其胚胎阻滯率和嵌合率明顯升高［5］。此外,另有兩項研究報道,不同原核大小的合子在第3 天胚胎中導(dǎo)致胚胎分裂停止和嵌合現(xiàn)象的發(fā)生率顯著高于相似大小的原核大小的合子［5,6］。Otsuki 等［7］通過研究2PN 直徑與活產(chǎn)的關(guān)系,認(rèn)為在原核核膜消失之前即時評估每個原核的大小得出2PN 直徑差異越小更有利于健康活產(chǎn)的結(jié)論。因此,本研究通過體外受精(IVF)后20 h 這個特定時間,測量合子胞質(zhì)平均直徑、原核直徑,計算2PN 面積差,并探討合子胞質(zhì)平均直徑和2PN 面積差對活產(chǎn)的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析宜春市婦幼保健院輔助生殖科2017 年7 月～2021 年7 月行助孕治療患者的194 個改良長方案新鮮第5 天(D5)單囊胚移植周期,納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40 歲；②進行D5 新鮮單囊胚移植；③改良長方案促排卵［8］；④宮腔鏡檢查證實無宮腔粘連。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者有甲狀腺功能亢進、高泌乳素血癥、多囊卵巢綜合征等內(nèi)分泌疾?。虎诤喜⒁粋?cè)或雙側(cè)輸卵管積液；③有子宮內(nèi)膜異位癥患者。由于所有數(shù)據(jù)都是匿名的,并且是回顧性資料分析,經(jīng)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會討論免除知情同意。

1.2方法

1.2.1合子胞質(zhì)平均直徑及原核直徑測定 體外受精后20 h,使用激光破膜成像軟件(RI,英國)成像及測量2PN 直徑和合子胞質(zhì)平均直徑。所有胚胎培養(yǎng)5 d,選擇D5 單囊胚移植。從每例患者的存檔移植胚胎圖像中,選擇所移植的胚胎進行原核測量。合子胞質(zhì)平均直徑的測量不包括透明帶。所有操作均由一名經(jīng)驗豐富的胚胎學(xué)家進行形態(tài)學(xué)評估及圖片的測量工作,另一名胚胎學(xué)家進行審核。

原核面積計算方法：S=π×［(A-A)/2］×［(B-B)/2］。其中A-A 為橢圓的短軸長,B-B 為橢圓的長軸長。2PN 面積差為兩個原核面積的差。

1.2.2囊胚評分 按照Gardner 囊胚評分法對D5/D6形成的囊胚進行評分,對于評分≥3BB 級的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚；對于滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團不同時評為CC 級別的囊胚定義為可移植囊胚。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1活產(chǎn)組和未活產(chǎn)組的臨床資料及測量指標(biāo)比較194 個新鮮D5 單囊胚移植周期,活產(chǎn)組 116 個移植周期,未活產(chǎn)組78 個移植周期。兩組女方年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、bFSH、bE2、AFC、bLH、bAMH、Gn 啟動總劑量、Gn 啟動總天數(shù)、HCG 日內(nèi)膜厚度、HCG 日血E2、HCG 日血LH、HCG 日血P、穿卵數(shù)、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN 面積差比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；活產(chǎn)組移植優(yōu)胚數(shù)多于未活產(chǎn)組,合子胞質(zhì)平均直徑長于未活產(chǎn)組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 活產(chǎn)組和未活產(chǎn)組的臨床資料及測量指標(biāo)比較()

表1 活產(chǎn)組和未活產(chǎn)組的臨床資料及測量指標(biāo)比較()

注：與未活產(chǎn)組比較,aP＜0.05

2.2不同合子胞質(zhì)平均直徑的臨床資料及測量指標(biāo)比較 194 個新鮮D5 單囊胚移植周期,根據(jù)合子胞質(zhì)平均直徑不同分為A組(＜115.0 μm,158 個移植周期)和B組(≥115.0 μm,36 個移植周期)。兩組不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、bFSH、bE2、AFC、bLH、bAMH、HCG 日內(nèi)膜厚度、HCG 日血E2、HCG 日血LH、HCG 日血P、穿卵數(shù)、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、總冷凍、凍囊胚、總受精、正常受精、總卵裂、獲卵率、成熟卵率、總受精率、正常受精率、正常卵裂率、D3 優(yōu)胚率、囊胚形成率、優(yōu)囊率、移植優(yōu)胚數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；B組女方年齡、Gn 啟動總劑量、活產(chǎn)率均高于A組,Gn 啟動總天數(shù)長于A組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同合子胞質(zhì)平均直徑的臨床資料及測量指標(biāo)比較［ ,n(%)］

表2 不同合子胞質(zhì)平均直徑的臨床資料及測量指標(biāo)比較［ ,n(%)］

續(xù)表2

3 討論

本研究共納入194 個新鮮D5 單囊胚移植周期,活產(chǎn)組 116 個移植周期,未活產(chǎn)組78 個移植周期,兩組女方年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、bFSH、bE2、AFC、bLH、bAMH、Gn 啟動總劑量、Gn 啟動總天數(shù)、HCG 日內(nèi)膜厚度、HCG 日血E2、HCG 日血LH、HCG日血P、穿卵數(shù)、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN 面積差比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；活產(chǎn)組移植優(yōu)胚數(shù)多于未活產(chǎn)組,合子胞質(zhì)平均直徑長于未活產(chǎn)組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

以往在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)受精卵雄原核的大小一般比雌原核大。然而此前研究報告稱,人類男性和女性原核的大小幾乎相同［9］。在此基礎(chǔ)上,有研究表明,兩個原核大小相似的受精卵囊胚發(fā)育率明顯高于兩個原核大小不等的受精卵［10,11］。另一項研究報道,不等大小的原核與較慢卵裂率和胚胎質(zhì)量下降有關(guān)［12］。也有報道稱,原核大小不同的受精卵產(chǎn)生的胚胎染色體異常發(fā)生率較高［13］。研究表明,受精卵在受精16～18 h后的原核形態(tài)與其后續(xù)的發(fā)育潛能存在相關(guān)性［14］。此外,體外受精胚胎相關(guān)原核期受精卵的形態(tài)和非整倍體的關(guān)系已被報道［15］。有兩項研究表明,兩個原核大小相似的受精卵囊胚發(fā)育率明顯高于兩個原核大小不等的受精卵［10,11］。本研究中活產(chǎn)組與非活產(chǎn)組的2PN面積差比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在2017 的研究中［8］,在原核消失前觀察雌雄原核的大小是相似的,才能導(dǎo)致健康活產(chǎn)。通常觀察原核是在受精后16～18 h,確認(rèn)是否正常受精,這相當(dāng)于原核消失之前的4 h。然而,這項研究發(fā)現(xiàn),成功分娩患者原核直徑的差異在原核消失前立即進行測量時明顯小于原核消失前4 h。因此,在原核消失前,通過時差成像系統(tǒng)測量原核直徑,可以更準(zhǔn)確地預(yù)測哪些胚胎會導(dǎo)致健康嬰兒的出生［8］。因此,本研究在IVF 受精后20 h 對兩組進行了2PN 直徑的精確測量,測量后計算面積差并進行比較,兩組無顯著差異。此外,在以上研究中［8］,原核尺寸的分析僅限于二維測量。本研究也是進行的圖片測量,當(dāng)三維分析成為可能時,就有可能獲得更精確的數(shù)據(jù)。近幾年時差成像系統(tǒng)被用于胚胎的選擇,以期提高活產(chǎn)率。目前,胚胎植入前遺傳學(xué)篩查可以對胚胎的染色體非整倍體進行檢測,但費用較高,臨床中不是所有的胚胎都能進行植入前遺傳學(xué)篩查。臨床中希望掌握預(yù)測活產(chǎn)率的評價指標(biāo),可為單個囊胚挑選移植提供臨床依據(jù)。本研究關(guān)注的是成功活產(chǎn)率,而不僅僅是囊胚發(fā)育和妊娠率［16,17］。由于成功分娩的患者在原核消失之前,2PN 直徑差異很小,所以2PN 直徑的巨大差異可能與染色體異常有關(guān)。此外,無論胚胎如何發(fā)育,在體外受精胚胎中原核的大小可能與染色體的體積有關(guān)。例如,當(dāng)由于染色體分離異常大量的染色體擠進第二個極體時,雌性原核的大小可能會因為受精卵母細(xì)胞中染色體的體積變小而變小。盡管還需要進一步研究來闡明這一假說,但在原核消失之前,雌雄原核的大小差異可能是選擇或排除染色體正?；虍惓Ｅ咛サ囊粋€有用的測量方法。本研究對部分流產(chǎn)患者做了絨毛染色體檢查,結(jié)果多為異常,與以上研究［8］中原核消失之前的大小差異越小,活產(chǎn)率越高的結(jié)果相似,因此測量受精卵原核直徑的差異可以作為早期胚胎發(fā)育潛能的有效參評估考指標(biāo)。在相關(guān)研究中［18］,原核的出現(xiàn)和發(fā)育是一個動態(tài)的過程,在受精之后出現(xiàn)從無到有、從小到大的再到消失的過程。本研究是在IVF受精后20 h 進行測量,不同的原核直徑可能代表原核的不同發(fā)育階段,在一個特定的時間(20 h)進行原核直徑測量,同一時間出現(xiàn)原核不同發(fā)育階段是否可能影響胚胎發(fā)育潛力,同時本研究中移植均為D5 的囊胚,根據(jù)文獻報道原核面積差超過一定范圍與囊胚形成率降低有關(guān)。這些問題均需要后續(xù)進一步的研究。

本研究依據(jù)受精后胞質(zhì)平均直徑將移植周期分為兩組,A組＜115.0 μm,158 個移植周期,活產(chǎn)88 例,活產(chǎn)率為55.7%。B組≥115.0 μm,36 個移植周期,活產(chǎn)28 例,活產(chǎn)率為77.8%。結(jié)果顯示,兩組活產(chǎn)率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。研究表明［19］,胞質(zhì)平均直徑在105.96～118.69 μm 的卵母細(xì)胞更有可能發(fā)育成為高質(zhì)量的D5 囊胚。所提供的預(yù)測模型都沒有考慮到有關(guān)卵母細(xì)胞質(zhì)量的信息,以及它們在受熱和受精后發(fā)育成囊胚的幾率。將卵母細(xì)胞平均直徑與患者年齡相結(jié)合,可以提高預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。卵母細(xì)胞平均直徑可能是胚胎發(fā)育到囊胚期的另一個預(yù)測因素。這種非侵入性的測量方法可以幫助需要生育能力保存的患者卵子冷凍保存決策的制定。如果為了保持生育能力而進行的促排卵周期導(dǎo)致一組卵母細(xì)胞具有不利特征(例如,直徑過大、細(xì)胞質(zhì)暗),則可能建議進行額外的促排卵周期,以提高女性活產(chǎn)的幾率［19］。肥胖婦女卵子胞質(zhì)直徑與妊娠相關(guān),胞質(zhì)直徑較大且透明帶厚度較薄的卵子其妊娠結(jié)局越好［20］。研究［21］發(fā)現(xiàn)直徑較小的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟受到抑制,也就是說在卵母細(xì)胞生長的最后階段,若增加卵母細(xì)胞的大小,卵母細(xì)胞與透明帶(ZP)內(nèi)表面的連接增加了,機體排出和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)使卵母細(xì)胞體積變小。研究認(rèn)為卵母細(xì)胞直徑可用作預(yù)測胚胎卵裂時間的標(biāo)志。本研究結(jié)果也證實受精后合子胞質(zhì)平均直徑與活產(chǎn)率有顯著關(guān)系。所以進一步探討合子胞質(zhì)平均直徑作為獨立因素對活產(chǎn)結(jié)局的影響值得進一步的研究。

本研究局限性主要為：①沒有避免其他潛在的因素；②由于患者樣本數(shù)量限制,所以本研究結(jié)果還需要進一步擴大樣本研究；③本研究為移植D5 囊胚,在受精后第 1 天的原核期,異常的原核大小面積差是否可預(yù)測囊胚形成率值得進一步大樣本的研究。影響IVF 活產(chǎn)的因素有很多,任何單一的因素都很難準(zhǔn)確判斷臨床治療中能否活產(chǎn)。如何權(quán)衡所有的相關(guān)因素,一直是臨床研究的課題。

綜上所述,合子胞質(zhì)平均直徑可納入胚胎評估標(biāo)準(zhǔn)的輔助指標(biāo)中,以期增加患者活產(chǎn)的機會。