賈仕玉，劉 勤,，張娜娜，錢美伶，楊 君

0 引言

近視作為目前世界范圍內最為常見的人類眼部疾病之一，嚴重威脅患者的視力及生活質量。流行病學研究顯示，至2030年預計全球近視人口數(shù)目將達到33.61億，約占全球總人口數(shù)的39.9%[1-2]，而到了2050年，全球近視人口數(shù)目預計達到47.58億人，約占據(jù)全球人口數(shù)目的49.8%[3]。近視會引起患者發(fā)生視網膜脫落、脈絡膜新生血管以及黃斑萎縮等并發(fā)癥的發(fā)生，甚至導致患者出現(xiàn)不可逆性的視力喪失[4]。因此，明確近視的發(fā)生機制并從根本上抑制近視的發(fā)生發(fā)展是目前研究的熱點。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)是位于視網膜光感受器細胞和脈絡膜血液供應之間的有絲分裂細胞，主要起了維持視網膜穩(wěn)態(tài)的重要作用。研究表明，在近視患者的RPE細胞層中存在著RPE細胞的丟失，同時單個RPE細胞的面積較正常人眼中所含RPE細胞的面積明顯增大[5]。而RPE細胞在近視過程中的病理變化是一個復雜的過程，它受到細胞內多種信號的調控。本文主要通過對近視發(fā)生發(fā)展過程中RPE細胞的分子調控機制進行歸納總結，從而為探究近視發(fā)病過程中的具體分子機制提供有效參考。

1近視發(fā)生過程中RPE細胞內信號傳導的變化

1.1mTOR信號通路雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)作為高分子量絲氨酸-蘇氨酸激酶、磷酸肌醇3-激酶相關激酶的家族成員之一，其包含特征性的羧基激酶同源區(qū)[6]。mTOR的主要功能為控制細胞的生長、活性與功能改變、細胞周期變化、DNA損傷的檢查以及端粒的重組與修復[7]。Rohrer等[8]通過建立RPE線粒體缺陷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠RPE細胞內氧化磷酸化被明顯抑制，而RPE細胞內mTOR信號通路也同時被激活。Wu等[9]通過建立單眼形覺剝奪性近視小鼠模型，從單眼形覺剝奪和對側眼正常的小鼠模型的鞏膜中分離出93個單細胞，并對他們進行轉錄組的分析，結果發(fā)現(xiàn)差異表達基因明顯聚集于mTOR信號和心血管系統(tǒng)中的缺氧信號通路，這些信號通路均在缺氧中發(fā)揮調節(jié)作用，這提示缺氧相關的信號通路可能在形覺剝奪的眼中被激活。通過在形覺剝奪性近視小鼠結膜下注射mTOR信號通路特異性抑制劑后，發(fā)現(xiàn)小鼠近視程度明顯加重，具體表現(xiàn)為小鼠的眼軸延長加快，屈光度增大。這一研究結果顯示，RPE細胞損傷可能通過mTOR信號通路介導近視的發(fā)生發(fā)展。同時，為了明確mTOR信號通路在近視形成過程中的具體作用機制，Li等[10]通過胰島素處理RPE后發(fā)現(xiàn)，胰島素處理后RPE細胞內mTOR信號通路被明顯激活，而RPE內生長因子、MMP-2的表達水平也明顯提高，電鏡下觀察到RPE細胞內可見內質網擴張以及泡沫化，提示RPE細胞變性明顯。而加入了mTOR通路抑制劑后，生長因子的表達、細胞活性也相應的降低。RPE的自噬與其自身的細胞活性與功能變化有著密切聯(lián)系，自噬是一種機體內吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，在維持細胞功能活性以及穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，細胞可以通過自噬機制消除損傷的蛋白質分子或者細胞器，從而確保維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。Feng等通過高糖誘導RPE細胞后發(fā)現(xiàn)，RPE細胞炎癥反應明顯提升，凋亡事件的發(fā)生情況也明顯增加[11]。而通過調控細胞自噬后RPE細胞的炎癥得到明顯控制，細胞活性也得以恢復。Chang等[12]通過過氧化氫處理人RPE細胞后發(fā)現(xiàn)氧化細胞死亡事件明顯提升，通過減弱氧化誘導的過度磷酸化細胞的活性，提升細胞自噬能力后，得以恢復細胞mTOR通路的水平，上調血紅素加氧酶-1的表達，對過氧化氫誘導的氧化細胞死亡發(fā)揮細胞保護作用。以上研究均表明，RPE細胞的功能活性與細胞自噬密切相關。而mTOR信號通路可能是調控RPE細胞活性及功能變化的主要信號通路。Go等[13]通過在RPE細胞內敲除mTOR上游轉錄抑制因子(tuberous sclerosis 1, TSC1)的表達后顯示，mTOR的活性明顯提升，細胞內糖代謝和脂肪代謝能力明顯提升。因此，mTOR也可能通過調控RPE的細胞代謝水平從而引起RPE細胞功能的改變。

1.2多巴胺信號通路以往的研究顯示，在形覺剝奪性近視動物模型中，視網膜多巴胺(dopamine, DA)的含量明顯減少，而通過對近視動物局部注射多巴胺受體激動劑后，動物的近視進展程度被明顯抑制[14-15]。因此說明多巴胺在近視發(fā)病過程中起著重要的調控作用。

多巴胺主要通過D1和D2兩個受體家族發(fā)揮其作用效果[16]。D1受體主要位于雙極細胞、水平細胞、神經節(jié)細胞內。D2受體主要位于視網膜感光細胞、RPE細胞內。D1受體的作用效應為激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)，繼而增加第二信使磷腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的含量；而D2受體的作用效果與D1受體相反，D2受體可以抑制AC的活性，減少cAMP的含量[17-18]。既往研究顯示，多巴胺受體激動劑主要通過激活D2受體從而實現(xiàn)其對于近視進展程度的抑制作用。而由于D2受體主要位于視網膜感光細胞、RPE細胞內，因此RPE細胞就成為了多巴胺靶向作用位點之一[19]。Seko等[20]通過在有/無RPE細胞共培養(yǎng)的條件下分別培養(yǎng)鞏膜軟骨細胞，并于細胞環(huán)境下添加多巴胺非選擇性受體激動劑(apomorphine, APO)。結果顯示，當存在RPE細胞共培養(yǎng)時，APO顯著抑制了鞏膜軟骨細胞的生長、增殖；而當無APO共培養(yǎng)時，APO對于鞏膜軟骨細胞的增殖、生長能力無明顯抑制作用。以上結果表明，APO主要通過調控RPE細胞內多巴胺的合成、分泌、釋放，從而調節(jié)鞏膜軟骨細胞的生長、增殖。

1.3乙酰膽堿信號通路在近視的發(fā)生發(fā)展過程中，RPE細胞可以分泌多種細胞因子、蛋白如轉化生長因子-β(transforming growth factor beta, TGF-β)，TGF-β由RPE細胞分泌并作用于鞏膜組織，促進鞏膜成纖維細胞的增生以及膠原的產生，最終導致鞏膜重塑，進一步促進了近視的發(fā)展[21-22]。

研究發(fā)現(xiàn)低濃度阿托品可以有效地緩解近視進展[23]。阿托品作為乙酰膽堿M受體拮抗劑，主要通過與內源性乙酰膽堿競爭性受體結合，從而抑制乙酰膽堿的釋放。乙酰膽堿作為中樞和外周神經常見的遞質之一，與近視的形成密切相關[24]。乙酰膽堿受體分為代謝型毒蕈堿乙酰膽堿受體(M型受體)和離子型煙堿乙酰膽堿受體(N型受體)。Shang等[25]通過反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技術檢測人RPE細胞內M受體mRNA的表達情況，同時通過免疫組化檢測細胞內M受體蛋白的表達情況，結果顯示人RPE細胞內存在M受體。研究通過于小雞近視動物模型玻璃體內以及球結膜下注射乙酰膽堿受體拮抗劑阿托品后發(fā)現(xiàn)近視的進程被明顯抑制[26]。上述研究均提示，在近視的發(fā)生發(fā)展過程中，乙酰膽堿可能通過促進RPE細胞分泌TGF-β等蛋白因子的分泌、釋放，促進鞏膜成纖維細胞增生以及膠原生成，引起鞏膜重塑，最終導致了近視病程的進展。

1.4γ-氨基丁酸信號通路He等[27]通過對近視小鼠RPE細胞進行單細胞測序后發(fā)現(xiàn)，近視小鼠的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)相關通道蛋白的表達量明顯降低，提示近視過程中GABA受體可能也存在相應的調控作用。研究顯示，由于近視的發(fā)生發(fā)展，鞏膜細胞外基質蛋白多糖發(fā)生重構，使得鞏膜GABA的合成減少，最終導致了近視的加重[28]。

目前研究顯示GABA受體主要位于鞏膜成纖維細胞、軟骨細胞以及RPE細胞內，而局部注射GABA后可以直接與鞏膜成纖維細胞相互作用，改變細胞內DNA含量，從而對鞏膜的生長、增殖產生相應的影響[29]。而在動物實驗中也顯示局部應用GABA受體拮抗劑后近視的程度明顯加重[30]。上述實驗結果顯示，GABA信號通路可能在近視的病程進展中也起到了一定的調控作用。Platzl等[31]通過細胞實驗顯示在近視發(fā)生發(fā)展過程中，通過RPE介導GABA對于鞏膜的刺激作用后發(fā)現(xiàn)鞏膜細胞內糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)含量明顯增加，提示我們GABA可能通過RPE細胞對鞏膜成纖維細胞發(fā)揮作用。當鞏膜成纖維細胞與RPE細胞共培養(yǎng)時，GABA對鞏膜的刺激作用效果明顯提升[32]。上述研究結果表明，GABA可能通過RPE細胞調控鞏膜成纖維細胞的增殖、分泌，從而引起細胞外基質的重構，最終導致了近視病程的發(fā)生發(fā)展。

1.5全反視黃酸通路研究顯示，全反視黃酸(all-trans retinoic acid, ATRA)的表達情況與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關。Mertz[33]通過用ATRA喂養(yǎng)豚鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠眼軸明顯增加，近視程度明顯加重。張未娟等[34]于培養(yǎng)基中加入40×10-6mol/L的ATRA后培養(yǎng)RPE細胞，結果顯示RPE細胞的增殖能力受到了明顯的抑制作用。而加入10×10-6mol/L ATRA后，RPE細胞分泌的TGF-β含量也明顯增加。有關形覺剝奪性近視模型的研究發(fā)現(xiàn)，在近視模型的眼球后壁中，TGF-β和視黃酸及其受體的含量都可因近視的發(fā)生發(fā)展而改變。TGF-β作為重要的近視因子，可通過刺激鞏膜成纖維細胞的增殖、分泌，從而導致鞏膜細胞外基質的重構，最終促進了近視的發(fā)生發(fā)展[35]。Zhang等[36]通過進一步分析不同濃度、不同作用時間下ATRA對于RPE細胞的作用效果，結果顯示ATRA作用于RPE細胞后，RPE細胞內TGF-β的表達和分泌呈劑量依賴式和時間依賴式增加。而在抑制了磷脂酶C信號通路后，TGF-β的分泌量明顯降低。上述研究結果表明，在近視的發(fā)生過程中，ATRA可能通過刺激RPE細胞分泌TGF-β，從而促進鞏膜成纖維細胞細胞外基質(ECM)的重構，最終導致了近視的加速。

2 近視發(fā)生過程中RPE細胞內microRNA的變化

2.1microRNA-328 microRNA-328作為細胞內源性微小RNA，其成熟產物主要由約23個核苷酸組成，主要通過與蛋白質編碼基因的mRNA相互配對從而抑制mRNA的翻譯進程，最終實現(xiàn)其自身的翻譯調控作用[37-38]。Chen等[39]在細胞實驗中證實，ATRA可以通過提升RPE細胞內microRNA-328的增加從而抑制細胞內PAX6(paired-box gene 6, PAX6)的表達。PAX6基因作為中樞神經系統(tǒng)以及眼球發(fā)育過程中的重要基因，在視網膜分化誘導過程中起著重要作用[40]。Edita等通過對112例近視患者(34例中度近視、8例重度近視以及70例健康成年人)進行全血采樣檢測，結果顯示隨著microRNA-328表達量的增加，RPE細胞的光密度明顯降低[41]。以上結果均顯示，microRNA-328可能在近視發(fā)生發(fā)展過程中起到了主要的調控作用。

2.2microRNA-29a microRNA-29家族主要由microRNA-29a、microRNA-29b、microRNA-29c三個亞家族組成，其中microRNA-29a作為ECM所產生的調節(jié)劑，可通過經典的RNA沉默機制對細胞內的信號傳導產生影響，從而發(fā)揮其作用效果[42]。在調節(jié)眼球生長的過程中，鞏膜ECM的重塑可導致眼軸長度及屈光狀態(tài)發(fā)生變化。Chen等[43]通過在RPE細胞內分別沉默/過表達microRNA-29a后發(fā)現(xiàn)，沉默microRNA-29a后MMP-2蛋白的表達明顯上調，細胞增殖能力也明顯好轉。Martins等[44]提出脈絡膜新生血管形成過程中，其機制可能是RPE細胞中信號傳導通路的活動增強，從而抑制了microRNA-29a的表達，此過程會導致MMP-2蛋白水平的上調從而有利于新生血管形成。這進一步為本研究探討microRNA-29a對RPE細胞分泌MMP-2的調控作用提供理論依據(jù)。Emily等發(fā)現(xiàn)在中國高度近視人群存在microRNA-29a中rs157907A/G的基因多態(tài)性現(xiàn)象[45]。因此，microRNA-29a可能通過調控細胞內MMP-2蛋白的表達從而調控RPE細胞的功能變化，最終導致近視的發(fā)生發(fā)展。RPE細胞分泌MMP-2的變化從而引起ECM含量的改變，可能是視網膜正常功能出現(xiàn)病理變化的核心環(huán)節(jié)。RPE細胞內MMP蛋白表達失衡是近視發(fā)生發(fā)展的主要病理變化。曾愛萍等[46]通過用TGF-β刺激人RPE細胞后，MMP-2表達明顯提升，引起MMP-2/1比例失衡，最終引起RPE細胞功能障礙。Yuan等[47]通過上調RPE細胞內MMP-2的表達后發(fā)現(xiàn)，RPE細胞的上調可以促進RPE ECM的重塑，進一步削弱RPE細胞之間的鏈接。上述研究顯示，MMP-2含量是近視發(fā)生過程中的重要分子機制，而microRNA-29a可以通過調控細胞內MMP-2的表達進一步調控近視的發(fā)生發(fā)展。

3 小結

通過對既往研究的歸納總結，本研究發(fā)現(xiàn)RPE細胞內復雜的信號通路轉導與近視的發(fā)生發(fā)展都具有密不可分的聯(lián)系。mTOR主要通過調控RPE的代謝水平從而調控近視的發(fā)生發(fā)展；RPE細胞合成、分泌DA增加后主要通過調節(jié)鞏膜軟骨細胞增殖調控近視病程；乙酰膽堿可以促進RPE分泌TGF-β從而引起鞏膜重塑，最終調控近視病程發(fā)展；而GABA和ATRA可以通過RPE促進鞏膜成纖維細胞的功能活性最終調控近視病程進展。同時，RPE內microRNA的差異表達變化與近視的發(fā)生發(fā)展也密切相關。microRNA-328可以通過抑制RPE細胞內PAX6的表達從而抑制視網膜的誘導分化，最終促進近視的病程發(fā)展；而microRNA-29a可以通過調控RPE細胞內MMP-2的表達實現(xiàn)對于RPE ECM分泌的調控，最終實現(xiàn)對于近視的調控。本項綜述通過總結既往RPE在近視中的分子機制研究，為后期基于RPE細胞有效防控近視提供充足的參考依據(jù)。