蔡思杰， 張書衍， 王曉微， 郭顯陽， 詹 碩

(1. 沈陽大學 生命科學與工程學院， 遼寧 沈陽 110044;2. 沈陽雙鼎制藥有限公司， 遼寧 沈陽 110179)

1 前 言

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(TALE)是黃單胞菌分泌的針對特定DNA 序列的蛋白質(zhì)[1-2]。TALE 家族成員包含一個高度保守和重復的區(qū)域，其與DNA 的結(jié)合能力取決于每個模塊重復的第12 和第13 個氨基酸殘基(即重復可變雙氨基酸殘基(RVD))。每個RVD 中都有一個簡單的代碼，用來指定對特定堿基的識別，這決定了TALE 核苷酸結(jié)合的特異性。例如，NI(Asn/Ile)對應(yīng)A，NG(Asn/Gly)對應(yīng)T，HD(His/Asp)對應(yīng)C，NH(Asn/His)對應(yīng)G[3-5]。人工構(gòu)建的帶有功能域的DNA 結(jié)合域(DBD)補充的TALE 可應(yīng)用于基因工程的許多方面，包括用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(TALE-TF)[6-9]和用于基因組編輯的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)[10-12]。因此，TALE 在基因工程領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。

TALE 的脫靶率比目前熱門的 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)[13-15]要低，識別DNA 長度也較長；基因調(diào)控和編輯的位置不受前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)的限制；具有更低的非靶點結(jié)合能力，更低的細胞毒性，基于TALE 具有高靶向能力[16]，所以，已由法國Cellectis 公司用于生產(chǎn)通用嵌合抗原受體T 細胞[17]，并已被批準用于癌癥免疫療法。接受該基因編輯療法的患者已顯示出顯著的治療效果[18]。最重要的是，在設(shè)計和構(gòu)建TALE 時，理論上可以靶向任何DNA序列。但是構(gòu)建TALE 的方法比較繁瑣復雜，而且構(gòu)建的TALE 長度有限，容易脫靶。并且，大多數(shù)研究人員仍然使用軟件來預測TALE 靶向的目標區(qū)域，然后構(gòu)建一個有針對性的TALE。在這種情況下，需要構(gòu)建更多的TALE，構(gòu)建周期太長，效率偏低[19-21]。

本研究發(fā)明了一種新的簡單的TALE 文庫的構(gòu)建方法，設(shè)計了一種可以輕松實現(xiàn)靶向較長DNA 序列的TALE 文庫的方法。該組裝方法是快速且標準化的，能夠精確控制產(chǎn)生的RVD 和整體DNA 結(jié)合域的組成。而且研究人員可以直接將其作為實驗材料，為TALE 研究人員節(jié)省了大量的時間。

2 材料與方法

2.1 材料

金門組裝試劑盒來自Addgene；限制酶BsaI、牛血清白蛋白(BSA)、T4 DNA 連接酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)來自NEB 公司；質(zhì)粒核酸安全酶來自Epicentre 公司；BsmBI 來自Thermo Scientific 公司；DH5α感受態(tài)細胞、壯觀霉素、卡那霉素、X-gal、IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，異丙基硫代半乳糖苷)來自南京源恩浩生物試劑；PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 高保真聚合酶混合液來自Takara 公司。

2.2 方法

采用基于金門組裝試劑盒優(yōu)化改進的新方法構(gòu)建了18 bp-TALE-VP64 文庫(bp 表示堿基對)。

第1 部分：構(gòu)建含10 個串聯(lián)重復序列(RVDs：NH1-NH10)組合的PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒。

步驟1(第1 天，3 h)：第1 次金門酶切連接反應(yīng)。將10 個RVD 構(gòu)建模塊質(zhì)粒(NH1 到NH10)各加入150 ng 于0.5 mL 離心管中。然后，加入150 ng pFUS-A 質(zhì)粒、1 μL BsaI、1 μL BSA、1 μL T4 DNA 連接酶、2 μL T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液。然后加入蒸餾水，使總反應(yīng)體積達到10 μL。

步驟2(第1 天，10 min)：上述反應(yīng)體系混合并短暫旋轉(zhuǎn)，渦旋混勻30 s。

步驟3(第1 天，3 h)：將反應(yīng)體系在PCR 儀上孵育。孵育條件為37 ℃、5 min 和16 ℃、10 min 共計10 個循環(huán)，然后50 ℃、5 min；80 ℃、5 min。

步驟4(第1 天，1 h)：反應(yīng)體系(10 μL)加入1 μL 質(zhì)粒核酸安全酶和1 μL 10 mmol·L-1ATP 在37 ℃下孵育1 h。

步驟5(第1 天，4 h)：將步驟4 的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化到100 μL DH5α 中，加入溶菌肉湯(LB)液體培養(yǎng)基得到1 mL 該細胞懸液，涂布于LB 瓊脂細菌培養(yǎng)皿(含有壯觀霉素50 μg·mL-1和20 mg·mL-1X-gal) (X-gal是β-半乳糖苷酶的顯色底物)以及0.1 mol·L-1IPTG，由于PFUS-A+10×NH，PFUS-B7+7×NH 和pLR-NH骨架質(zhì)粒都具有壯觀霉素抗性，所以，培養(yǎng)微生物大腸桿菌細胞DH5α，有抗性的說明質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)染成功，沒有轉(zhuǎn)染成功的沒有抗性，不會生長出菌落。

步驟6(第2 天，6 h)：從培養(yǎng)皿上挑選幾個白色菌落，并使用引物pCR8-F1 和pCR8-R1(表1)進行菌落PCR 檢驗。PCR 程序：96 ℃預變性3 min；96 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環(huán)；72 ℃總延伸3 min，4 ℃保存。PCR 檢測正確的菌落經(jīng)過培養(yǎng)、提取，得到PFUS-A+10×NH質(zhì)粒。

表1 質(zhì)粒突變體和菌落PCR的引物Table 1 Primers for plasmid mutation and colony PCR

第2 部分：構(gòu)建含有7 個串聯(lián)重復序列(RVDs：NH1-NH7)組合的PFUS-B7+7×NH質(zhì)粒。

步驟1(第1 天，3 h)：取7 個RVD 構(gòu)建質(zhì)粒模塊(NH1 到NH7)各加入150 ng，加入pFUS-B7 質(zhì)粒150 ng、1 μL BsaI、1 μL BSA、1 μL T4 DNA 連接酶、2 μL T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液。然后加入蒸餾水，使總反應(yīng)體積達到10 μL。

步驟2(第1 天，10 min)：反應(yīng)體系短暫旋轉(zhuǎn)混合，渦旋混勻30 s。

步驟3(第1 天，3 h)：將反應(yīng)體系在PCR 儀上孵育，孵育條件為37 ℃、5 min 和16 ℃、10 min 共計10 個循環(huán)；然后50 ℃、5 min；80 ℃、5 min。

步驟4(第1 天，1 h)：反應(yīng)體系(10 μL)加入1 μL 質(zhì)粒核酸安全酶和1 μL 10 mmol·L-1ATP 在37 ℃下孵育1 h。

步驟5(第1 天，4 h)：將步驟4 的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化到100 μL DH5α 感受態(tài)細胞。然后加入LB 培養(yǎng)基得到1 mL 細胞懸液涂布于LB 瓊脂細菌培養(yǎng)皿(含有壯觀霉素50 μg·mL-1和20 mg·mL-1X-gal 以及0.1 mol·L-1IPTG)。

步驟6(第2 天，6 h)：從培養(yǎng)皿中挑選幾個白色菌落，使用引物pCR8-F1 和pCR8-R1(見表1)進行菌落PCR 檢測。PCR 程序：96 ℃預變性3 min；96 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃總延伸3 min，4 ℃保存。PCR 檢測正確的菌落經(jīng)過培養(yǎng)、提取，得到PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒。

第3 部分：PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒突變體、PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒突變體及pLR-NH 質(zhì)粒突變體的構(gòu)建。

步驟1(第3 天，3 h)：PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒突變體、PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒突變體、pLR-NH 質(zhì)粒突變體均采用PCR 擴增得到，引物如表1 所示。利用HD-C、NH-G、NG-T 和NI-A 這4 種特殊引物(表1)對PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒、PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒、pLR-NH 質(zhì)粒分別進行PCR 擴增。3 個PCR反應(yīng)(240 μL)均包含1 ng 質(zhì)粒、10 μmol·L-1HD-C、10 μmol·L-1NH-G、10 μmol·L-1NG-T、10 μmol·L-1NI-A 和PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 高保真聚合酶混合液。PCR 程序：96 ℃預變性3 min；96 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸3 min，進行28 個循環(huán)；72 ℃總延伸3 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物經(jīng)苯酚/氯仿萃取法純化，用無水乙醇沉淀。PCR產(chǎn)物在水中重懸，3 種PCR 產(chǎn)物即PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒突變體、PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒突變體、pLR-NH質(zhì)粒突變體。

第4 部分：構(gòu)建TALE-VP64 文庫(RVDs：NH1-NH17 和pLR-NH)。

步驟1(第3 天，3 h)：在20 μL 反應(yīng)體系中，包括150 ng PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒突變體，150 ng PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒突變體，150 ng pLR-NH 質(zhì)粒突變體和75 ng TALE-backbone-VP64。加入1 μL BsmBI，1 μL T4 DNA 連接酶、2 μL T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液。最后加入蒸餾水使總反應(yīng)體積為20 μL。

步驟2(第3 天，10 min)：該反應(yīng)體系短暫旋轉(zhuǎn)混合，渦旋混勻30 s。

步驟3(第3 天，3 h)：將反應(yīng)體系在熱循環(huán)PCR 儀上孵育。熱循環(huán)條件為37 ℃、5 min 和16 ℃、10 min，共計10 個循環(huán)；然后37 ℃、15 min；80 ℃、5 min。

步驟4(第3 天，4 h)：將20 μL 的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化到200 μL DH5α 感受態(tài)細胞中。加入LB 培養(yǎng)基得到1 mL細胞懸液涂布于LB 瓊脂細菌培養(yǎng)皿(含有卡那霉素50 μg·mL-1和20 mg·mL-1X-gal 以及0.1 mol·L-1IPTG)。

步驟5(第4 天，4 h)：利用引物TAL-F 和TAL-R(表1)進行菌落PCR 實驗，根據(jù)電泳條帶鑒定陽性菌落。最后PCR 檢測正確的菌落，過夜培養(yǎng)。

步驟6(第5 天，2 h)：提取培養(yǎng)的菌液中的質(zhì)粒為18 bp-TALE-VP64 文庫質(zhì)粒表達載體。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 TALE 文庫構(gòu)建流程的建立

經(jīng)過對金門法的優(yōu)化構(gòu)建了TALE 文庫，詳細流程見圖1，此流程顯示了構(gòu)建TALE-VP64 文庫的示例，該質(zhì)粒文庫可以結(jié)合18 bp DNA 長度的目標靶向位點。其中PFUS-A+10×NH 是一種由10 個單體質(zhì)粒和一個骨架質(zhì)粒PFUS-A 在第1 次酶切連接反應(yīng)中制備的質(zhì)粒；PFUS-B7+7×NH 是一種由7 個單體質(zhì)粒和1 個骨架質(zhì)粒PFUS-B7 在第1 次酶切連接反應(yīng)中制備的質(zhì)粒。因此，PFUS-A +10×NH 是表達與N1-N10 核苷酸結(jié)合的氨基酸的質(zhì)粒載體，PFUS-B7+7×NH 是表達與N11-N17 核苷酸結(jié)合的氨基酸的質(zhì)粒載體。編碼與最后一個核苷酸(N18)結(jié)合的氨基酸的序列包含在另一個單體質(zhì)粒(pLR-NH)中。第2 次酶切連接反應(yīng)包含 4 個質(zhì)粒，包括PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒突變體(PFUS-A+10×(NH，HD，NG，NI))、PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒突變體(PFUS-B7+7× (NH，HD，NG，NI))、pLR-NH 質(zhì)粒突變體(pLR-NH/HD/NG/NI)和TALE 骨架載體(TALE-backbone-VP64)(見圖2，圖中bp 為堿基對)。

圖1 利用金門法基于4 種特異性引物構(gòu)建TALE-VP64 文庫的流程Fig.1 Flowchart of the construction of TALE-VP64 libraries by the Golden-Gate method based on new specific primers pipeline

圖2 質(zhì)粒圖譜及其組成Fig.2 Plasmids maps and their elements

另外，在構(gòu)建過程中所使作的各種骨架質(zhì)粒圖譜(即突變前質(zhì)粒)見圖2 中PFUS-A+10×NH、PFUS-B7×NH、pLR-NH質(zhì)粒。最后，預計構(gòu)建成功的TALE-VP64 質(zhì)粒文庫具有轉(zhuǎn)染各種細胞的能力，并可以激活下游基因的表達(見圖3)，Zhang 等[21]單獨構(gòu)建的TALE-VP64 質(zhì)料轉(zhuǎn)染293T 細胞，確實激活了綠色熒光基因ZsGreen，使綠色熒光蛋白高表達。TALE-VPR 質(zhì)料轉(zhuǎn)染HepG2細胞和PANCl 細胞，分別使得內(nèi)源基因HNF4a 和E47 基因上調(diào)， 從而證實了TALE-VP64/VPR 強大的靶向和激活功能。TALE-VP64 文庫中每個DNA 結(jié)合模塊由34個氨基酸組成，其中每個模塊的第12 和13 位氨基酸變化較大，其他氨基酸高度保守，這2 個不保守的氨基酸被命名為重復可變殘基(RVD)，RVD 氨基酸對應(yīng)DNA 堿基之間的分子密碼是NI 對應(yīng)A、HD 對應(yīng)C、NG 對應(yīng)T、NH 對應(yīng)G，所有的TALE 由N 末端的轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(AD)組成(圖3)。TALE 的末端轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域以及C末端的核定位信號和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，不同成員之間互換這些功能區(qū)域并不影響其正常發(fā)揮作用。TALE-DNA 結(jié)合域與合成的VP64 轉(zhuǎn)錄激活因子融合，該激活因子募集RNA 聚合酶和啟動轉(zhuǎn)錄所需的其他因子，激活下游基因的表達(見圖3)。

圖3 用于基因組工程的TALE-VP64 文庫Fig.3 The TALE -VP64 libraries for genome engineering

3.2 質(zhì)粒和文庫的菌落PCR 檢測

第1 部分和第2 部分中從每個平板上選取白色菌落，使用引物pCR8-F1 和pCR8-R1 進行菌落PCR檢驗。條帶應(yīng)達到預期大小(PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒約12 kb、PFUS-B7+7×NH 載體約0.8 kb (kb 表示1 000 堿基對))，但一般不可能得到單一的條帶，一般條帶“階梯”從約200 bp 開始，這是正確克隆的標志，是克隆中重復的結(jié)果[22](見圖4 中1 和2 泳道)。

圖4 質(zhì)粒和菌落 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Results of agarose gel electrophoresis of plasmid and colony PCR products

第 3 部分中用 4 種特異引物和長鏈高保真 DNA 聚合酶分別擴增 PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒、PFUS-B7+7×NH 和pLR-NH 質(zhì)粒(見圖4 中4、6、8 泳道)，獲得各個質(zhì)粒載體突變體(見圖4 中3、5、7泳道)，由于質(zhì)粒突變體實際是PCR 產(chǎn)物，并且主要是各種質(zhì)粒的混合物，但是也不排除有短鏈的一些PCR 產(chǎn)物，所以，從電泳圖觀察，質(zhì)粒突變體主要條帶的分子量與對應(yīng)的質(zhì)?；疽恢?。

第4 部分中挑取4 個白色菌落用菌落PCR 檢測最終18 bp-TALE-VP64 文庫。全長PCR 產(chǎn)物通常不太突出，大約是2 051 bp，從結(jié)果觀察，主條帶確實在2 051 bp 左右，但是不明顯。而“階梯效應(yīng)”是成功組裝的有力指標[22](見圖4 中9 泳道)。

PFUS-A+10×NH、PFUS-B7+7×NH、pLR-NH 骨架質(zhì)粒分別與各自的質(zhì)粒突變體不同，3 種質(zhì)粒突變體是各自以3 種質(zhì)粒(PFUS-A+10×NH、PFUS-B7+7×NH 和pLR-NH 骨架質(zhì)粒)為模板，加入4 種特異性引物經(jīng)過PCR 反應(yīng)后得到3 種PCR 產(chǎn)物，PFUS-A+10×NH 質(zhì)粒突變體就是PFUS-A+10× (NH，HD，NG，NI 不同排列組合)的混合物，即410種質(zhì)粒的混合物；PFUS-B7+7×NH 質(zhì)粒突變體就是PFUS-B7+7× (NH，HD，NG，NI 不同排列組合)的混合物，即47種質(zhì)粒的混合物；pLR-NH 質(zhì)粒突變體就是pLR-NH、pLR-HD、pLR-NG、pLR-NI 的混合物，即4 種質(zhì)粒的混合物。

3.3 TALE 文庫質(zhì)粒的基因測序

將最后提取的18bp-TALE-VP64 質(zhì)粒文庫送基因公司測序，最后得到的測序結(jié)果見圖5，圖中有6 個核苷酸的重復序列(RVDs)，顯示“噪聲”信號。RVD結(jié)構(gòu)域預期核苷酸組成與構(gòu)建的18 bp-TALE-VP64 文庫一致(圖5)。通過基因測序驗證了該文庫的所有序列是正確的，并且包含所有可能的DNA 靶點的序列組合，該TALE-VP64 質(zhì)粒文庫對18 個堿基(ATCG)的排列組合都有靶向性，所以就是418，共計68 719 476 736個組合。所以涵蓋了可能的核苷酸DNA 靶點。因為也有很多研究者構(gòu)建針對11 個堿基或者12 個堿基的TALE 文庫質(zhì)粒，由于靶向的堿基越多，脫靶的可能性越小，此處主要是體現(xiàn)該質(zhì)粒文庫的高靶向性。另外從測序結(jié)果觀察，雖然NH 對應(yīng)的序列較多，但是也存在HD、NG、NI 對應(yīng)的序列，由于測序的質(zhì)粒文庫實際是多種質(zhì)粒的混合物，里面相當于418的各種排列組合的質(zhì)粒的混合物。注意觀察峰圖，RVD 對應(yīng)有幾個是雙峰、三峰，所以從測序結(jié)果得出，構(gòu)建的文庫涵蓋了預期的RVD 組成。

圖5 18-bp TALE-VP64 文庫的DNA 測序圖譜Fig.5 DNA sequencing profiles of the 18 bp-TALE-VP64 libraries

4 討 論

先前文獻報道中的構(gòu)建TALE 的方法都是構(gòu)建獨立個體的方法，無論用什么方法來單獨構(gòu)建若干TALE 質(zhì)粒，都不可能形成一個巨大的文庫，這些方法是低效和耗時的。在本研究中，建立了一種基于獨特引物組裝完整、高效的TALE 文庫構(gòu)建的方法，與其他技術(shù)相比[23-24]，TALE 靶向DNA 目標的長度可以控制。增加DNA 靶標的長度將獲得更高的特異性，然而，構(gòu)建TALE 文庫的成本和時間也將大大增加；另一種增加文庫靶向DNA 目標長度的方法，不增加額外的實驗負擔或增加復雜性，包括利用RVD特異性。例如，已知RVD-NN 可以同時靶向A 和G，因此，只有4 個模塊(即NH、NI、NG 和HD)可用于組裝完整的TALE 文庫。所以，研究構(gòu)建的這4 個模塊的18 bp-TALE 文庫將產(chǎn)生最多68 719 476 736種組合。靶向DNA 長度更大的TALE 文庫的組裝在實驗上可能很麻煩，在某些情況下，實際上是無法實現(xiàn)的。另一個問題在于，在破譯給定的RVD 序列的TALE-DNA 結(jié)合方面存在一定程度的不確定性，這可能也會使全基因組分析中潛在目標序列的識別復雜化，這個問題可以通過染色質(zhì)免疫共沉淀-測序技術(shù)(ChIP-seq)[25]進行進一步研究。總之，本研究成功建立了一種基于TALE 的多功能文庫的組裝方法，構(gòu)建成功的TALE 文庫可以利用酵母單雜交試驗探索其功能完整性[26]。進一步說明，TALE-DBD 可以完全定制，以靶向任何核苷酸含量(如GC 含量豐富的DNA 區(qū)域)、核苷酸限制(如轉(zhuǎn)錄因子基序)或其他修飾[27-28]。最后，TALE 蛋白的編碼序列易于分離和測序，便于快速識別其靶基因。總之，考慮到該組裝方法的高度模塊化的特性，控制其靶向DNA 長度大小從而調(diào)整其文庫特異性的能力，以及構(gòu)建的文庫的多功能性和方便性，預計未來將有更廣泛的應(yīng)用。

5 結(jié) 論

在本研究中，使用TALE 試劑盒和獨特設(shè)計的引物，建立了一種快速構(gòu)建TALE 文庫的新方法。利用該方法構(gòu)建了可靶向18bp-DNA 序列的TALE 文庫，并對其進行了DNA 測序驗證，滿足預期結(jié)果。為基因組調(diào)控和基因組編輯技術(shù)提供了簡單高效的方法和實驗工具。