徐子龍，張欣剛，顏丙銀，鄭向江

（臨沂大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 臨沂 276000）

啶蟲脒是一種新型廣譜殺蟲劑，廣泛用于水稻、蔬菜、果樹的蚜蟲、飛虱等的防治。雖然其為低毒殺蟲劑，但對人、畜等有毒，而且其廣泛的使用，不可避免地造成在農(nóng)作物中的殘留，經(jīng)由食物鏈的富集作用進入人體，嚴重影響人們的身體健康[1]。國家對于食品安全越來越重視，不斷修訂完善食品安全國家標準[2]，嚴格規(guī)定食品中農(nóng)藥最大殘留限量。但在經(jīng)濟效益的驅(qū)使下，啶蟲脒的超標使用和濫用造成的殘留問題仍然存在，所以加強啶蟲脒農(nóng)藥殘留的分析檢測對于人民群眾的身體健康具有重要的意義。

啶蟲脒的檢測方法有很多種，氣相色譜法[3]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、化學(xué)比色法[5]、免疫分析法[6]等，但這些方法普遍存在前處理過程復(fù)雜、耗時費力、檢測成本高等缺點。近年來，基于適配體電化學(xué)傳感器檢測農(nóng)藥技術(shù)得到廣泛關(guān)注[7,8]。電化學(xué)傳感器能夠通過傳感膜與待測物分子產(chǎn)生化學(xué)信號，再轉(zhuǎn)換成電信號，建立待測物分子濃度與電信號之間的對應(yīng)關(guān)系，實現(xiàn)檢測的目的。經(jīng)過篩選得到的適配體與農(nóng)藥分子能夠特異性結(jié)合，而且制備方便、易修飾、穩(wěn)定性好[9]。本文通過構(gòu)建穩(wěn)定性好、成本低、易操作的電化學(xué)適配體傳感器，實現(xiàn)了對啶蟲脒的高靈敏度、高特異性檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E 型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；JY600 型電泳儀（北京君怡東方電泳設(shè)備有限公司）；WD-9413B 型凝膠成像儀（北京六一儀器廠）；Milli-Q 型超純水機（美國密理博公司）。

啶蟲脒（Ace，乙醇溶液，100μg·mL-1）、亞甲基藍（MB，AR）均來自阿拉丁公司；三（羥甲基）氨基甲烷、丙烯酰胺、6-巰基-1-己醇（MCH）均為分析純，麥克林公司；鹽酸三（2-羧乙基）膦（TCEP，AR）、1×TE 緩沖液、4S Red plus 核酸染色劑來自生工生物；脫氧核糖核酸（DNA）由生工生物合成，具體序列見表1；所有溶液均由Milli-Q 水系統(tǒng)的超純水制備。

表1 DNA 序列Tab.1 DNA sequence

1.2 實驗步驟

所有的DNA 在使用前經(jīng)離心處理，用TE 緩沖溶液配置成溶液。HP1 和HP2 在使用前于95℃保持5min 后逐漸冷卻至室溫，置于-20℃冰箱備用。

金電極在使用前用0.05μm 的Al2O3拋光，用超純水沖洗干凈，分別在水、乙醇、水中超聲3min，用N2吹干，在0.5M H2SO4中以50mV·s-1，在-0.2～1.6V掃描至循環(huán)伏安曲線圖穩(wěn)定。將L1 用TCEP 活化1h 后滴于電極表面，4℃冰箱過夜。將電極取出用超純水沖洗，將1mM MCH 滴于電極表面1h，封閉多余的位點；滴入過量的適體鏈，室溫下進行反應(yīng)1h，再用超純水沖洗電極表面，除去多余的適體鏈。再將不同濃度的啶蟲脒農(nóng)藥滴于電極表面1h，沖洗后將HP1、HP2 及MB 滴于電極表面反應(yīng)90min，在1×PBS 中電壓-0.6～0V 進行差分脈沖伏安法（DPV）測量。三電極系統(tǒng)包括：金電極（Φ=3mm）作為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl）作為參比電極，Pt 絲作為對電極。

將10μL 不同的樣品與2μL DNA 上樣緩沖液（6×）混合均勻，轉(zhuǎn)移到丙烯酰胺凝膠中（10%），在1×TAE 下，電壓為100 V 下跑膠1h，然后將凝膠放置在4S Red plus 核酸染色劑（3×）中進行泡染30min，最后在凝膠成像儀下進行成像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理分析

本文構(gòu)建了基于適配體的電化學(xué)傳感器來檢測啶蟲脒。實驗原理見圖1。

圖1 實驗方案原理圖Fig.1 Schematic diagram

L1 鏈與啶蟲脒適體鏈（Apt）能夠雜交成DNA雙鏈。首先，利用L1 鏈修飾的巰基與金電極反應(yīng)，將L1 鏈固定在電極表面。加入過量的適體鏈（Apt），充分與L1 鏈雜交，用超純水沖走過量的適體鏈。加入啶蟲脒之后，能夠與適配體特異性結(jié)合，從而將L1單鏈暴露出來。繼續(xù)加入HP1 和HP2，L1 單鏈能夠引發(fā)兩個發(fā)夾DNA 之間的雜交鏈式反應(yīng)，延伸成長的雙鏈DNA 提供了豐富的位點用于亞甲基藍的吸附。差分脈沖伏安法（DPV）測量產(chǎn)生電化學(xué)信號。啶蟲脒加入越多，產(chǎn)生的L1 鏈就越多，引發(fā)更多的雜交鏈式反應(yīng)，從而可以得到更高的電化學(xué)信號。由此建立起啶蟲脒濃度與電化學(xué)信號的關(guān)系。

2.2 方法可行性分析

通過丙烯酰胺電泳來分析實驗的可行性，見圖2。條帶1-7 分別為Marker、L1、Apt、HP1、HP2、L1+Apt、L1+Apt +Ace+HP1+HP2。

圖2 丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 Acrylamide gel electrophoresis diagram

由圖2 可見，條帶1 到條帶6 均符合預(yù)期的結(jié)果，條帶7 產(chǎn)生了一個新的條帶，并且該條帶的位置最高，說明分子量大，在丙烯酰胺凝膠里的遷移率最慢，這表明啶蟲脒的存在成功引發(fā)了雜交鏈式反應(yīng)，生成了雙鏈DNA。

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)時間的影響 研究了雜交鏈反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響，在其他條件為最佳條件情況下對雜交鏈反應(yīng)（HCR）的時間進行了優(yōu)化。根據(jù)HCR 反應(yīng)為發(fā)夾DNA 被逐漸打開從而延伸的性質(zhì)將反應(yīng)時間分別設(shè)置為30、60、90、120、150min，結(jié)果見圖3。

圖3 不同反應(yīng)時間的DPV圖Fig.3 DPV diagrams of different reaction time

由圖3 可見，隨著反應(yīng)時間的逐漸增加電流信號也逐漸增強，說明時間延長，使得雜交鏈反應(yīng)的雙鏈長度延伸，更多的電活性物質(zhì)嵌插在雙鏈DNA 上獲得了更強的電化學(xué)信號，當時間增加到90min 后，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，峰電流信號不再增加，反而有一些降低，因此，選擇90min 為最佳反應(yīng)時間。

2.3.2 發(fā)夾DNA 濃度的影響 研究了發(fā)夾DNA 濃度對于反應(yīng)電信號的影響，對發(fā)夾DNA 的濃度進行了優(yōu)化。由于雜交鏈反應(yīng)中兩種發(fā)夾DNA 的量對應(yīng)關(guān)系為1∶1，所以將HP1 與HP2 的濃度設(shè)置為相同，在其他條件為最優(yōu)條件下探究不同濃度的兩種發(fā)夾DNA 濃度對反應(yīng)信號的影響，將發(fā)夾DNA 的濃度由低到高分別設(shè)置為1、1.5、3、5、10μM，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)夾DNA 濃度優(yōu)化柱狀圖Fig.4 Histogram of optimized DNA concentration of hairpin

由圖4 可知，隨著濃度的增加，信號峰也在增加，當濃度為5μM 時達到最大值，繼續(xù)增加濃度，信號峰變化不大，所以選用5μM 為雜交鏈式反應(yīng)的最佳濃度。

2.4 工作曲線

在優(yōu)化條件下，檢測了不同濃度的啶蟲脒，其DPV 曲線見圖5a 和圖5b。

圖5 a.濃度梯度的DPV 圖；b.DPV 信號與啶蟲脒濃度的對數(shù)線性相關(guān)關(guān)系Fig.5 a.DPV diagram of the concentration gradient；b.Linear correlation between DPV signal and log value of acetamiprid concentration

由圖5 可見，隨著啶蟲脒濃度從0μg·mL-1增加到1μg·mL-1，DPV 峰強度也逐漸上升，并且觀察到峰值電流與啶蟲脒濃度對數(shù)值之間存在良好的線性關(guān)系，線性范圍從1μg·mL-1到0.1ng·mL-1。線性回歸方程為IP（100nA）=6.468+0.613lgC（R2=0.995）。利用3σ 法計算，其檢測限為0.028ng·mL-1。

2.5 特異性評估

為評估該方法對于啶蟲脒檢測的特異性，將相同濃度的啶蟲脒（A）與其噻蟲胺（B）、丙溴磷（C）、吡蟲啉（D）和噻蟲嗪（E）在相同的實驗條件下進行檢測對比，結(jié)果見圖6。

圖6 不同農(nóng)藥的特異性檢測Fig.6 Specificity detection of different pesticides

由圖6 可見，相同實驗條件下，啶蟲脒的DPV峰值最高，而其余農(nóng)藥的DPV 信號峰都很低。由此可以得出，該傳感器對于啶蟲脒的檢測有良好的特異性。

3 結(jié)論

利用適配體與啶蟲脒特異性結(jié)合和雜交鏈式反應(yīng)的信號放大作用，建立了電化學(xué)適配體傳感方法來檢測啶蟲脒。結(jié)果表明，該方法在1μg·mL-1到0.1ng·mL-1范圍內(nèi)，電化學(xué)信號與啶蟲脒濃度的對數(shù)值存在線性關(guān)系，檢測限為0.028ng·mL-1。本方法選擇性好，靈敏度高，在食品安全監(jiān)測、環(huán)境分析和生物分析等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。