葉 瀟，宋迎香，趙瑜，朱大龍

1南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210008；2浙江省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院），浙江 杭州310014

超重乃至肥胖已經(jīng)成為危害人類健康的重要因素，與心血管疾病、2型糖尿病、高血壓和高血脂等多種慢性疾病密切相關(guān)，給個人和社會帶來巨大的健康和經(jīng)濟負擔(dān)［1,2］。脂肪組織與肥胖的發(fā)病密切相關(guān)，它主要包括負責(zé)能量貯存的白色脂肪組織和負責(zé)在寒冷環(huán)境產(chǎn)熱的棕色脂肪組織兩種［3,4］。在寒冷的刺激下，白色脂肪組織內(nèi)會出現(xiàn)線粒體上高表達UCP-1蛋白的脂肪細胞，被稱為棕色脂肪細胞，這一現(xiàn)象也被稱為白色脂肪棕色化［5］。白色脂肪棕色化能明顯提高機體的能量消耗水平，因此是近年來肥胖研究中的重要方向和干預(yù)靶點。

近年來，免疫細胞對脂肪組織功能調(diào)節(jié)的重要性逐漸得到認識［6,7］。免疫細胞對脂肪棕色化的調(diào)控主要依賴于以IL-4/IL-5/IL-13為中心，ILC2、嗜酸性粒細胞、M2型巨噬細胞為效應(yīng)細胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［8,9］。黏膜相關(guān)恒定T（MAIT）細胞最初被發(fā)現(xiàn)定植于人類、小鼠和牛的組織黏膜表面，屬于固有免疫細胞的新亞群［10,11］。研究證實，MAIT細胞也參與了自身免疫性代謝疾病的發(fā)生［12-14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，人體脂肪組織內(nèi)也存在MAIT細胞，而肥胖人群脂肪組織內(nèi)MAIT細胞數(shù)量顯著減少［15］。然而，MAIT細胞是否參與脂肪組織功能的調(diào)控乃至肥胖的發(fā)生發(fā)展仍不清楚。本研究擬通過基因敲除動物模型，在細胞和動物水平進行研究，探究MAIT細胞在脂肪棕色化過程中的作用，并闡明其調(diào)控脂肪細胞棕色化的方式及相關(guān)信號通路，為進一步理解肥胖發(fā)生的原因以及探尋治療肥胖的方法提供幫助。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8～10周齡健康雄性C57BL/6小鼠、Mr1-/-小鼠（蘇州賽業(yè)公司及南京集萃藥康公司）。按照最佳飼養(yǎng)空間將小鼠隨機分籠，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，濕度55%～63%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，定期更換墊料，保證所有小鼠可自由飲食。動物實驗的所有操作均由浙江省人民醫(yī)院實驗動物福利委員會批準（批準號2022-145）。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gbico），Lymphoprep 淋巴細胞分離液（Stem cell），F(xiàn)ACS緩沖液（BD Biosciences），F(xiàn)oxp3固定/滲透試劑盒（Thermo Fisher Scientific），胰蛋白酶、青鏈霉素、RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、4%多聚甲醛組織固定液（生工生物），Trizol 裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）；IL-4 mab（BD Biosciences），實時熒光定量PCR試劑盒（Thermo），Seahorse XF細胞線粒體壓力測試試劑盒（安捷倫）；FACS Aria II流式細胞儀（BD Bioscience）,超聲破碎儀，Seahorse XF分析儀（安捷倫）。

1.3 實驗方法

1.3.1 流式細胞術(shù) 在表面染色前，使用CD16/32抗體（Biolegend）阻斷Fc受體的非特異性結(jié)合。表面染色時，將細胞重懸于含有抗體雞尾酒的100 μL FACS緩沖液中，在4 ℃避光條件下染色30 min。細胞內(nèi)染色：使用Foxp3固定/滲透試劑盒（Thermo Fisher Scientific）在4 ℃下固定和滲透45 min，用100 μL含抗體混合的滲透緩沖液在4 ℃避光條件下染色45 min。

1.3.2 Western blotting 采用超聲破碎儀將組織在冰上充分均漿，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液中冰上裂解30 min。將懸液置于4 ℃以10 000g離心5 min，取上清先測定蛋白濃度后再加入Loading buffer，充分混合后煮沸10 min。變性后的蛋白經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，先4 ℃孵育一抗過夜后，再室溫孵育二抗1 h，顯影分析。

1.3.3 mRNA的抽提以及RT-PCR RNA提取按照10 μL體系，參照說明書使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，使用Light Cycler480II定量PCR儀檢測，采用βactin作為內(nèi)參基因。定量RT-PCR在40個重復(fù)的熱循環(huán)中進行，使用SYBR green（94 ℃30 s，57 ℃20 s，72 ℃20 s），隨后在72 ℃下進行最后的延伸5 min。

1.3.4 冷刺激小鼠模型的建立 構(gòu)建冷刺激的小鼠模型：6周齡C57BL/6雄鼠，分為正常對照組和寒冷刺激組，6只/組，均提供足量的飲水和食物。正常對照組飼養(yǎng)環(huán)境為25 ℃；寒冷刺激組每日25 ℃飼養(yǎng)20 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃環(huán)境中飼養(yǎng)4 h，以適應(yīng)寒冷刺激，4 d后將小鼠轉(zhuǎn)移至4 ℃環(huán)境中，持續(xù)寒冷刺激1周。

1.3.5 免疫組化 組織經(jīng)固定、脫水后包埋，制成冰凍切片。4 ℃孵育對應(yīng)的一抗過夜，PBS 漂洗3次；室溫孵育二抗1 h，PBS 漂洗3次。DAPI 染核，ddH2O漂洗，封片后光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.6 脂肪組織細胞分離及培養(yǎng) 將脂肪組織稱重后在冰上剪成小塊，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，用1640 RPMI培養(yǎng)基定容至8 mL，加入0.2%的1型膠原酶，37 ℃水浴消化30～40 min，期間每5 min上下顛倒離心管使組織與酶溶液充分接觸。消化結(jié)束后加1640 RPMI培養(yǎng)基至15 mL終止消化，室溫下500 g離心5 min，吸去最上層油脂和中層培養(yǎng)基。采用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基復(fù)懸細胞，接種至培養(yǎng)皿中。細胞因子及抗體直接按照目標(biāo)濃度加入培養(yǎng)基中。

1.3.7 Seahorse 脂肪細胞在XF96微孔板中培養(yǎng)并分化。分化第7 天，細胞洗1 次，置于37 ℃室溫恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h（XF 基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L谷氨酸和2%不含脂肪酸的牛血清白蛋白，pH 7.4）。將試劑盒內(nèi)對應(yīng)濃度的寡霉素5 μmol/L、FCCP 1 μmol/L、魚藤酮2.5 μmol/L、抗霉素A 5 μmol/L的濃度裝入傳感器的注射口。上機記錄數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

全部試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0及R軟件上完成統(tǒng)計分析。體外實驗均重復(fù)3次，采用t檢驗或單因素方差分析。非正態(tài)分布的計量資料采用兩獨立樣本Mann-Whitney秩和檢驗進行比較；率的比較采用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗；相關(guān)分析采用Pearson 或Spearmen相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷刺激促進脂肪組織MAIT細胞分泌IL-4

經(jīng)過冷刺激處理后，小鼠白色脂肪的棕色化水平上調(diào)，體現(xiàn)為棕色化標(biāo)志物的上調(diào)（P＜0.05，圖1A、B）。通過流式細胞術(shù)檢測小鼠脂肪組織內(nèi)MAIT細胞的數(shù)量及CD69的表達水平，發(fā)現(xiàn)相比于未接受冷刺激的小鼠，冷刺激后的小鼠脂肪組織內(nèi)MAIT細胞數(shù)量無明顯變化（P＞0.05，圖1C），而MAIT細胞表面CD69的表達水平上調(diào)（P＜0.05，圖1D）。冷刺激后小鼠脂肪組織內(nèi)MAIT細胞分泌IL-4的能力較對照組上升（P＜0.05，圖1E）。

2.2 冷刺激后MAIT細胞通過分泌IL-4促進脂肪棕色化

對照組小鼠脂肪細胞與冷刺激后小鼠MAIT細胞共培養(yǎng)后棕色化相關(guān)標(biāo)志上調(diào)（P＜0.05，圖2A、B）。在脂肪細胞培養(yǎng)體系中加入IL-4或IL-4聯(lián)合IL-4的阻斷抗體（IL-4處理濃度均為10 ng/mL，IL-4 mab為10 μg/mL，處理時間均為24 h）處理后，IL-4抗體聯(lián)合處理組棕色化相關(guān)指標(biāo)低于IL-4單獨處理組（P＜0.05，圖2C、D）。

2.3 MAIT細胞缺陷會導(dǎo)致脂肪棕色化受損

給予MAIT細胞功能缺陷模型鼠Mr1-/-小鼠冷刺激后，基因敲除小鼠的能量消耗水平低于野生型小鼠（圖3A）；免疫組化以及Western blotting也顯示，同樣長時間冷刺激后基因敲除小鼠的脂肪棕色化水平低于野生型小鼠（圖3B、C）。由于棕色化脂肪細胞的代謝特征與白色脂肪存在顯著差異，我們通過Seahorse的方法檢測了冷刺激后野生型/基因敲除小鼠脂肪細胞的代謝特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠脂肪細胞的OCR水平下降（圖3D、E），其棕色化程度下降。

3 討論

免疫系統(tǒng)與肥胖和2 型糖尿病的發(fā)病有關(guān)，而MAIT細胞作為一群新發(fā)現(xiàn)的免疫細胞在其中的作用還不完全清楚［16］。脂肪細胞棕色化的過程被認為是影響肥胖發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，該過程中免疫細胞及其效應(yīng)分子也起到了重要的調(diào)控作用。本研究利用MAIT細胞功能缺陷小鼠模型，首次探索MAIT細胞在脂肪組織棕色化過程中的作用。結(jié)果提示在肥胖發(fā)生發(fā)展的過程中伴隨著MAIT細胞功能的受損，MAIT細胞在肥胖的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到保護性作用。

為了更深入地探究MAIT細胞在脂肪棕色化的過程中的作用，我們開展了多種動物模型以及體外實驗。研究表明，冷刺激能直接促進小鼠白色脂肪組織的棕色化［17］。因此本研究也采用冷刺激的模型，結(jié)果顯示冷刺激后小鼠白色脂肪的棕色化標(biāo)志物明顯上調(diào)，MAIT的功能也伴隨出現(xiàn)顯著的變化，體現(xiàn)為數(shù)量不變的基礎(chǔ)上活化相關(guān)的表面標(biāo)志CD69的表達上調(diào)。研究表明，多種細胞分泌的效應(yīng)因子參與了脂肪棕色化的調(diào)控，最新研究提示ILC2細胞可以被IL-33激活，分泌Met-enk在白色脂肪組織中促進棕色化；傳統(tǒng)觀點則認為，IL-4是關(guān)鍵的調(diào)控因子［18］。而MAIT細胞也被報道可以在相應(yīng)的刺激下分泌IL-4［19］。本研究也發(fā)現(xiàn)，冷刺激后小鼠脂肪組織中的MAIT細胞分泌IL-4的能力顯著上調(diào)。以上實驗說明，冷刺激能夠促進MAIT細胞的活化以及其效應(yīng)細胞因子的分泌，進一步提示MAIT細胞可能通過分泌IL-4參與了脂肪棕色化的調(diào)控。

為了直接證明MAIT細胞能夠通過分泌IL-4直接促進脂肪細胞細胞的棕色化，本研究將小鼠冷刺激后的MAIT細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后的脂肪細胞棕色化標(biāo)志物表達上調(diào)。為了驗證這一過程中是否存在IL-4的作用，我們在利用IL-4抗體阻斷這一信號，結(jié)果顯示沒有IL-4信號的情況下，MAIT細胞將不能促進脂肪細胞棕色化，表明冷刺激后MAIT細胞可以通過分泌IL-4促進脂肪細胞棕色化。

研究指出，MAIT細胞發(fā)育的過程依賴于MR1分子遞呈的信號，敲除這一分子將會導(dǎo)致MAIT細胞發(fā)育異常，因此MRI基因敲除小鼠是經(jīng)典的MAIT細胞功能缺陷小鼠模型［20］。為了進一步驗證我們的結(jié)論，我們對Mr1-/-小鼠進行了冷刺激，通過體內(nèi)實驗多角度的探究MAIT細胞的功能。我們發(fā)現(xiàn)，Mr1-/-小鼠冷刺激后能量代謝異常，提示其脂肪棕色化可能存在異常。免疫組化和Western blot實驗也證明MAIT細胞缺陷后冷刺激將不能正常地促進脂肪細胞棕色化。研究指出，棕色化后脂肪細胞的氧化磷酸化水平顯著上升，因此脂肪細胞的氧化磷酸化水平也被認為是評估脂肪細胞棕色化的重要指標(biāo)［21,22］；而本實驗發(fā)現(xiàn)，MAIT細胞缺陷小鼠的脂肪細胞氧化磷酸化的水平也存在缺陷。這說明在體內(nèi)水平上，MAIT細胞功能缺陷會導(dǎo)致冷刺激促進脂肪細胞棕色化的能力降低，即MAIT細胞是調(diào)控脂肪棕色化的重要調(diào)控者。

綜合我們基因敲除小鼠模型實驗，我們的研究證明了MAIT細胞可以通過分泌IL-4促進脂肪細胞的棕色化，而MAIT細胞功能受損會導(dǎo)致脂肪細胞棕色化異常進而導(dǎo)致肥胖的發(fā)生發(fā)展。但本研究也存在一定局限性：本研究僅發(fā)現(xiàn)脂肪組織中MAIT細胞對棕色化存在效應(yīng)，并未探索MAIT細胞上游的調(diào)控機制；另外，除IL-4外，MAIT細胞是否存在其他調(diào)控脂肪組織棕色化的通路也未能發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，探索脂肪組織中MAIT細胞為探索干預(yù)肥胖發(fā)生發(fā)展提供了新的機制，同時也為肥胖的治療提供了潛在靶點。