任 毅，盧金瑩，于露，李宗澤，王高，楊菁

錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121001

糖尿病腎臟疾?。―KD）是糖尿病的常見并發(fā)癥，其發(fā)病人數(shù)占全球糖尿病患者的20%～40%［1］，已成為終末期腎病的第一病因［2,3］。DKD患者在中國(guó)的住院率從2010年的3.58%上升到2017年的4.95%，上升趨勢(shì)明顯［4］，同時(shí)DKD患者發(fā)生不良心血管病、感染和死亡的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，給患者及家庭帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)和精神壓力［5］。DKD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，現(xiàn)研究主要聚焦在氧化應(yīng)激、炎癥和自噬等方面［3,6］。DKD治療方法有限，主要通過(guò)控制血壓和血糖，降低白蛋白尿來(lái)延緩DKD的進(jìn)展，但效果并不理想［7-9］。因此廣泛探索DKD發(fā)病機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上開展相關(guān)藥物研究顯得尤為迫切［8-10］。

肌肽是一種天然的、廣泛存在于各種臟器的水溶性內(nèi)源性二肽，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化等諸多生理功能［11-13］。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，肌肽對(duì)DKD大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制氧化應(yīng)激和NF-κB 信號(hào)通路異常激活有關(guān)［14］。但肌肽對(duì)DKD大鼠Akt/mTOR信號(hào)通路及自噬的影響卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合STZ腹腔注射制備糖尿?。―M）大鼠模型，通過(guò)觀察大鼠的體質(zhì)量和血糖的變化，比較血肌酐（Scr）、尿蛋白、24 h尿量及組織學(xué)變化，探討肌肽對(duì)DKD的保護(hù)作用，同時(shí)進(jìn)一步觀察腎臟組織中AKT、mTOR、LC3、p62蛋白表達(dá)的趨勢(shì)變化，探討肌肽的作用機(jī)制，為DKD的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～160 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度22±2 ℃，濕度（55±2）%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)錦州醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)審批（No.2022032101）。

1.2 主要試劑和儀器

肌肽，純度99.9%以上（蘇州富士萊醫(yī)藥）；高糖高脂飼料、普通飼料（北京博愛港生物技術(shù)）；鏈脲佐菌素（Sigma）；Akt、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3、p62、βactin抗體（武漢愛博泰克生物科技）；HE染色試劑盒、SOD、MDA試劑盒、BCA試劑盒（北京索萊寶科技）；肌酐和尿蛋白定量試劑盒（南京建成生物）。顯影液、RIPA裂解液（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物）；快速制膠試劑盒（蘇州新賽美生物科技）。倒置顯微鏡（Olympus）；石蠟切片機(jī)，德國(guó)萊卡；電泳儀、凝膠成像儀、轉(zhuǎn)膜機(jī)（Bio-Rad）。MK3酶標(biāo)分析儀（上海賽默飛世爾）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和大鼠DM模型建立 將70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組（CON，n=14）和高糖高脂組（n=56）。CON組普通飼料喂養(yǎng)，高糖高脂組高糖高脂飼料喂養(yǎng)。高糖高脂喂養(yǎng)4周后禁食不禁水12 h，一次性注射30 mg/kg STZ，72 h后Onetouch血糖儀測(cè)血糖，共有51只大鼠血糖≥16.7 mmol/L，視為造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)進(jìn)一步分為DM組（n=12只）及肌肽低（Car-L，n=13）、中（Car-M，n=13）、高劑量組（Car-H，n=13），各組分別按照每日0 mg/kg、100 mg/kg、300 mg/kg和900 mg/kg肌肽灌胃，各組依然高糖高脂飼料喂養(yǎng)繼續(xù)喂養(yǎng)12周直到取材。

1.3.2 樣本采集 飼養(yǎng)大鼠期間，7 d/次測(cè)定體質(zhì)量，定期測(cè)量血糖值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，收集24 h尿液。收集血清后，處死大鼠后取腎臟，一側(cè)腎臟儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，另一側(cè)腎臟擦干水分放入10%多聚甲醛中進(jìn)行固定。

1.3.3 血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白含量測(cè)定 隨機(jī)取8個(gè)樣品，采用肌氨酸氧化酶法測(cè)定血肌酐。CBB法，測(cè)定尿蛋白。具體按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.4 HE染色檢測(cè)大鼠腎臟組織病理形態(tài)變化 將浸泡在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定的腎組織取出，經(jīng)過(guò)脫水、二甲苯透明后進(jìn)行液體石蠟包埋，等待石蠟冷卻至室溫后進(jìn)行修剪蠟塊、制作切片，石蠟切片厚度約為4 μm。將準(zhǔn)備進(jìn)行染色的蠟塊進(jìn)行二甲苯常規(guī)脫蠟和梯度酒精水化后，進(jìn)行染色。染色后的切片經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 試劑盒檢測(cè)大鼠腎臟組織SOD、MDA 嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，隨機(jī)取凍存8個(gè)腎臟組織，破碎后取上清液，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；將數(shù)據(jù)按照公式進(jìn)行計(jì)算，檢測(cè)大鼠腎臟組織SOD活性、MDA含量。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)大鼠腎臟組織中T-AKT、p-AKT、T-mTOR、p-mTOR、p62、LC3蛋白的表達(dá) 取凍存腎臟組織，提取蛋白，測(cè)定濃度，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別用T-AKT、p-AKT、T-mTOR、pmTOR、p62、LC3、β-actin抗體孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗，ECL成像。Image J 軟件分析并計(jì)算相應(yīng)的蛋白條帶與β-actin的灰度比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肌肽對(duì)DM大鼠狀態(tài)、血糖和體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，DM組大鼠的反應(yīng)較為遲鈍、不喜運(yùn)動(dòng)、弓背卷體、多飲多尿明顯、毛色發(fā)黃光澤差。與DM組相比，Car各組大鼠毛發(fā)清潔程度有改善，精神狀態(tài)恢復(fù)。與CON組相比，DM組注射STZ后血糖水平顯著升高，體質(zhì)量顯著降低，該趨勢(shì)一直維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與DM組相比，Car各組血糖略有下降，體質(zhì)量升高，但只有Car-H組體質(zhì)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 肌肽對(duì)DM大鼠血糖和體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of carnosine on blood glucose and body weight of the diabetic rats(Mean±SD,n=12-14).##P＜0.01 vs CON group;*P＜0.05 vs DM group.

2.2 肌肽對(duì)DM大鼠Scr、尿蛋白、24h尿量和腎臟質(zhì)量的影響

與CON 組相比，DM 組的大鼠Scr、尿蛋白含量、24 h尿量和腎臟質(zhì)量均有所升高（P＜0.01）。與DM組相比，CAR-M和Car-H組大鼠的尿蛋白含量、24 h尿量均顯著降低（P＜0.05），腎臟質(zhì)量與Scr下降有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 肌肽對(duì)DM大鼠的生理指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of carnosine on renal indexes of DM rats(Mean±SD,n=8-14).##P＜0.01 vs CON group;**P＜0.01 vs DM group.

2.3 肌肽對(duì)DM大鼠腎臟組織形態(tài)的影響

CON組大鼠腎臟細(xì)胞均勻分布，腎小球形態(tài)圓潤(rùn)飽滿，腎小管結(jié)構(gòu)正常，基底膜系膜形態(tài)規(guī)則無(wú)增生。DM組大鼠腎臟組織細(xì)胞紊亂，腎小球腫脹變形，形狀不規(guī)則，伴隨基底膜增厚，系膜增生，腎小管出現(xiàn)狹窄現(xiàn)象。CAR組腎小球內(nèi)系膜增生和基底膜增厚程度略有降低，腎小球形狀逐漸圓潤(rùn)規(guī)整，空泡狀腎小管上皮細(xì)胞有所恢復(fù)，尤其以高濃度組效果更佳（圖3）。

圖3 各組大鼠的腎臟HE染色結(jié)果Fig.3 HE staining of renal tissue in each group(Original magnification:×400).A:CON group.B:DM group.C:Car-L group.D:Car-M group.E:Car-H group.

2.4 肌肽對(duì)DM大鼠腎臟組織SOD和MDA的影響

與CON組相比，DM組的大鼠的腎臟組織SOD活性下降，MDA含量上升（P＜0.05）。與DM組相比，Car各組大鼠腎臟組織中的SOD含量上升，MDA含量下降（P＜0.05），并且呈現(xiàn)劑量依賴性（圖4）。

圖4 肌肽對(duì)DM大鼠腎臟中氧化應(yīng)激的影響Fig.4 Effect of carnosine on SOD activity and MDA content in the kidney of the rats with DM.##P＜0.01 vs CON group;**P＜0.01 vs DM group.

2.5 肌肽對(duì)DM大鼠腎臟組織AKT、mTOR、P-AKT、pmTOR、LC3 I、LC3 II、p62的影響

與CON組相比較，DM組的大鼠腎臟組織中AKT和mTOR 蛋白總量無(wú)明顯差異，但p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR的比值明顯降低（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值明顯升高（P＜0.01）。與DM組進(jìn)行比較，Car各組p-AKT/AKT與p-mTOR/mTOR比值均有所上升，p62蛋白表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值均下降，尤其以Car-M和Car-H組更明顯（P＜0.01，圖5）。

圖5 Western blot檢測(cè)AKT、mTOR、P-AKT、p-mTOR、LC3、p62蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Renal expression of AKT,mTOR,P-AKT,LC3,and p62 proteins in the rats detected by Western blotting.A:Representative image of AKT,mTOR,P-AKT,LC3,p62 proteins detected by Western blots.B:The ratio of p-AKT/AKT protein expression.C:The ratio of p-mTOR/mTOR protein expression.D: The ratio of LC3 II/I protein expression.E: Relative expressions of P62 protein.##P＜0.01 vs CON group;**P＜0.01 vs DM group.

3 討論

DKD是目前糖尿病最為常見也是最為嚴(yán)重的一種慢性微血管并發(fā)癥，30%～40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展成DKD。采用高糖高脂飼養(yǎng)同時(shí)配合STZ腹腔注射建立了DM大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CON組相比較，DM組的大鼠體質(zhì)量明顯的減輕（P＜0.05）、血糖、Scr、尿蛋白及24 h尿量升高明顯（P＜0.05），腎小球出現(xiàn)基底膜增生、系膜增厚和腎小球腫脹變形等，說(shuō)明DKD模型制備成功，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。與DM組相比，肌肽各組可見以上各指標(biāo)不同程度的減輕，其中肌肽高劑量組的效果最為明顯，說(shuō)明肌肽對(duì)DM腎臟病變具有保護(hù)作用。

血糖升高可產(chǎn)生過(guò)量自由基，同時(shí)清除能力下降，其導(dǎo)致的氧化應(yīng)激失衡在DKD 中起重要作用［16,17］。SOD的主要功能是清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)最終產(chǎn)物，其含量可以反映機(jī)體過(guò)氧化的程度，是常用的過(guò)氧化損傷的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，DM組的大鼠血清中SOD活性下降，MDA含量上升，說(shuō)明DM組大鼠氧化應(yīng)激損傷明顯。灌胃肌肽后，肌肽提高DM組大鼠SOD活性及降低MDA含量，因此推斷肌肽可通過(guò)提升大鼠機(jī)體的抗氧化能力，從而對(duì)DM腎臟病變產(chǎn)生保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激與AKT/mTOR 途徑密切相關(guān)［18,19］，而AKT/mTOR 途徑又在DKD 中發(fā)揮重要作用［20,21］。AKT的蘇氨酸和絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化后，直接或間接通過(guò)結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體激活mTOR 蛋白，調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子S6K1 和4E-BP1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和自噬等生理活動(dòng)［18,22］。在腎臟中，mTOR活性的生理水平是支持腎細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、維持腎細(xì)胞完整性和正常腎單位功能，包括電解質(zhì)、水和葡萄糖的運(yùn)輸所必需的，其活性失調(diào)會(huì)導(dǎo)致腎臟疾病［21］。結(jié)果顯示，與CON 組相比，DM 組p-AKT/AKT 和pmTOR/mTOR比值降低，與文獻(xiàn)結(jié)果一致［23］。同時(shí)也應(yīng)該注意到不同種屬、模型制備方法和時(shí)間不同的DM模型，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值的變化趨勢(shì)并不一致［24,25］，具體原因仍需進(jìn)一步研究。灌胃肌肽后p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值升高，而以高濃度肌肽效果更明顯，推測(cè)肌肽可通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR途徑發(fā)揮其保護(hù)作用。

Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)自噬過(guò)程具有重要調(diào)節(jié)作用［26,27］，可以抑制自噬體的合成［28,29］。自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑，對(duì)于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用［30］，其調(diào)節(jié)失控在DKD的進(jìn)展中起著重要作用［6,31,32］。微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）是一種可溶性蛋白質(zhì)，通過(guò)對(duì)其C末端切割產(chǎn)生LC3-I，進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺結(jié)合產(chǎn)生LC3-II。LC3-II反映細(xì)胞自噬體相對(duì)數(shù)量，可作為自噬活性和DKD 進(jìn)展的標(biāo)志物［33］。P62是自噬受體蛋白，與可作為自噬降解指標(biāo)，與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，DM組p62蛋白表達(dá)及LC3-II/I比值明顯均明顯升高（P＜0.05），而肌肽灌胃后，隨著肌肽濃度增加，p62蛋白表達(dá)及LC3-II/I比值逐漸降低，以上結(jié)果說(shuō)明DM大鼠腎臟自噬過(guò)程受到干擾，而肌肽可以調(diào)節(jié)DM大鼠自噬恢復(fù)正常。

綜上所述，肌肽可通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR 信號(hào)通路，改善自噬發(fā)揮對(duì)DM腎臟病變的保護(hù)作用。