孫建華，張逸，楊麗萍，周立，盧喜洋，李久現(xiàn)，陳萍

1河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州450099

異位妊娠是婦產(chǎn)科常見的急腹癥，也是導(dǎo)致妊娠早期孕婦出血性死亡的主要原因，發(fā)病率約2%，其中輸卵管妊娠（TP）最為常見［1,3］。做為二氫葉酸還原酶抑制劑，甲氨蝶呤可以抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，破壞絨毛活性，是目前治療TP的一線用藥，但存在肝、腎功能損害、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)［1］。因此，深入了解TP發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，探索新的治療靶點仍至關(guān)重要。

LncRNA是一種長度大于200 nt的RNA分子，不參與蛋白質(zhì)編碼，但可以調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移、凋亡等多種生物學(xué)功能的發(fā)揮［4,5］，LncRNA表達(dá)異常和胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生有關(guān)［6-8］，還可引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇等婦產(chǎn)科疾?。?-13］。尿路上皮癌抗原1（UCA1）是一種首次在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)并得名的lncRNA，其表達(dá)失調(diào)不僅可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［8,14］，還和子癇前期、妊娠期高血壓、妊娠丟失等多種婦產(chǎn)科疾病的發(fā)生有關(guān)［15-18］。研究表明，UCA1低表達(dá)可使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移能力減弱，造成滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，從而導(dǎo)致流產(chǎn)等疾病發(fā)生［17,18］。而輸卵管妊娠破裂導(dǎo)致的急腹癥卻和滋養(yǎng)細(xì)胞不斷向輸卵管侵襲密切相關(guān)。然而，UCA1是否介導(dǎo)了TP的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

本研究擬制備TP滋養(yǎng)細(xì)胞模型探討UCA1表達(dá)變化，觀察UCA1對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)功能的作用，并對其潛在分子機(jī)制進(jìn)行評價，以期為TP藥物治療的靶點探索提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料細(xì)胞株

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 主要試劑耗材與儀器

無水乙醇、甲醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胎牛血清、雙抗（青鏈霉素、鏈霉素）、RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、基質(zhì)膠（Gibico），多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫（白鯊生物科技公司），Lipofectamine3000（Thermo），UCA1 siRNA、UCA1 陰性對照（廣州達(dá)弘生物科技有限公司），實時熒光定量PCR試劑盒（Promega），RIPA蛋白裂解液（弗德生物科技有限公司），Trizol、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），PVDF膜（Merck Millipore），兔抗E-cadherin 抗體（SAB），兔抗Vimentin 抗體（Abcam），兔抗N-cadherin抗體、兔抗integrin β3抗體、山羊抗兔熒光二抗（CST），細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell培養(yǎng)小室（Corning），離心機(jī)（Eppendorf），倒置光學(xué)顯微鏡（AxioObserver），Real time PCR引物序列由擎科生物科技有限公司合成，酶標(biāo)儀（Tecan），電泳儀、轉(zhuǎn)膜電泳槽（Bio-rad）、逆轉(zhuǎn)錄儀、qPCR 儀名稱（BIO-RAD）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞模型制備 行劃痕實驗（具體見1.3.4）后加入IL-6干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞，使其終濃度為5 ng/mL。根據(jù)是否采用IL-6干預(yù)將兩組細(xì)胞分別命名為IL-6組及其空白對照NC組。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HTR-8/SVneo細(xì)胞以RPMI 1640培養(yǎng)基（10%FBS、1%青鏈霉素雙抗）于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿表面75%～85%時，以0.25%的胰酶消化傳代。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種于六孔板后以10%FBS（不含抗生素）培養(yǎng)，貼壁過夜使細(xì)胞密度達(dá)30%～50%。用125 μLOpti-MEM稀釋5 μLlipo3000，125 μLOpti-MEM稀釋2 μg siRNA，把稀釋的lipo3000和siRNA輕輕混勻，室溫孵育15 min，加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中。根據(jù)是否轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA 將兩組細(xì)胞分別命名為si-UCA1組及其陰性對照NC組。

1.3.4 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 顯微鏡下觀察細(xì)胞融合約90%時，用200 μL的槍頭垂直于6孔板板底用力劃痕。用PBS 將細(xì)胞輕輕漂洗后吸棄，加入2 mL 1%FBS 并于顯微鏡下拍照（×40），繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察HTR-8/SVneo 細(xì)胞遷移情況并拍照記錄及觀察比較。

1.3.5 Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲 Matrigel基質(zhì)膠溶解稀釋后鋪于Transwell小室，37 ℃孵育過夜使膠凝固。細(xì)胞消化后以無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌并重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，每小室加入200 μL細(xì)胞懸液，20%的FBS加入下室，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h取出，PBS漂洗后用4%多聚甲醛固定、100%甲醇透化、0.1%結(jié)晶紫染色液染色，棉簽輕輕擦去上室內(nèi)細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察并記錄各組穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照（×100），每個小室隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行拍照。

1.3.6 RT-qPCR 檢測細(xì)胞mRNA 及UCA1 表達(dá)水平按Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。按試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃10 min進(jìn)行變性；45℃1 min退火；95 ℃5 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH基因為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法對目標(biāo)基因進(jìn)行檢測。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.3.7 Western blot 檢測各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平將處理完成的細(xì)胞以PBS漂洗3次，加入RIPA緩沖液進(jìn)行充分裂解，提取總蛋白，檢測濃度后加入loading buffer并煮沸變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后加一抗4 ℃孵育過夜，加二抗常溫孵育1 h，TBST沖洗后進(jìn)行顯影并于凝膠成像系統(tǒng)曝光取像。使用Image J軟件分析條帶灰度值，根據(jù)內(nèi)參GAPDH進(jìn)行灰度值校正，再以對照組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，GraphPad prism7軟件進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗進(jìn)行比較，P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6 對HTR-8/SVneo 細(xì)胞遷移及UCA1 表達(dá)的影響

與空白組比較，IL-6處理組細(xì)胞遷移距離明顯增加，UCA1表達(dá)含量顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1）。

圖1 IL-6對HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移及UCA1表達(dá)的影響Fig.1 Effect of IL-6 on HTR-8/SVneo cell migration and UCA1 expression.A:Wound healing assay of the cells(Original magnification:×40).B:UCA 1 expression level in control and IL-6-treated cells.**P＜0.01 vs negative control(NC)group.

2.2 將UCA1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞對UCA1表達(dá)進(jìn)行下調(diào)

將UCA1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞，qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，UCA1 siRNA轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞UCA1表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA后兩組HTR-8/SVneo細(xì)胞UCA1表達(dá)Fig.2 Changes in expression level of UCA1 in HTR-8/SVneo cells after transfection with UCA1 siRNA.**P＜0.01 vs NC group.

2.3 下調(diào)UCA1表達(dá)抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲

采用劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移，Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲，結(jié)果顯示，si-UCA1組細(xì)胞遷移距離明顯小于對照組，細(xì)胞侵襲個數(shù)明顯少于對照組（P＜0.01，圖3）。

圖3 兩組HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移、侵襲能力比較Fig.3 Changes in migration and invasion abilities of HTR-8/SVneo cells after transfection with UCA1 siRNA.A:Wound healing assay of the cells(×40).B:Transwell invasion assay of the cells(×100).C:Number of invasion cells in NC and si-UCA1 group.**P＜0.01 vs NC group.

2.4 下調(diào)UCA1表達(dá)抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特性

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA 后，HTR-8/SVneo 細(xì)胞EMT 上皮標(biāo)志物Ecadherin mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），間質(zhì)標(biāo)志物integrin β3、Vimentin、N-cadherin mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA后，HTR-8/SVneo細(xì)胞EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），間質(zhì)標(biāo)志物integrin β3、Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，圖4）。

圖4 兩組HTR-8/SVneo細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)Fig.4 Expression levels of mRNA or proteins of EMT markers in HTR-8/SVneo cells transfected with UCA1 siRNA.A: mRNA expressions of the markers.B,C: Relative protein levels of Ecadherin,integrinβ3,vimentin and N-cadherin in HTR-8/SVneo cells in NC and si-UCA1 group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs negative control group.

3 討論

UCA1是一種人類特異性lncRNA，已有報道顯示其參與子癇前期的發(fā)病機(jī)制。通過促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞局部缺氧適應(yīng)，UCA1可通過循環(huán)外泌體將胎盤應(yīng)激與內(nèi)皮損傷聯(lián)系起來［19］。與此同時，UCA1高表達(dá)也被報導(dǎo)和多種腫瘤細(xì)胞侵襲及疾病進(jìn)展相關(guān)［20-22］。眾所周知，在胚胎著床過程中滋養(yǎng)細(xì)胞介導(dǎo)的侵襲、遷移的特點和腫瘤細(xì)胞具有高度的相似性［23］。胚胎在子宮內(nèi)正常著床時，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲受到精準(zhǔn)調(diào)控，使得滋養(yǎng)細(xì)胞最終穿透蛻膜層侵襲至肌層內(nèi)1/3［23］。而發(fā)生輸卵管妊娠時這種“有控”的調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)紊亂，滋養(yǎng)細(xì)胞不斷向輸卵管肌層及漿膜層過度侵襲可導(dǎo)致輸卵管破裂［24］。因此，研究滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移功能的調(diào)控機(jī)制，對于發(fā)現(xiàn)異位妊娠的潛在治療靶點具有重要的意義。本研究中，我們通過IL-6干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞模擬輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞模型，分別用遷移實驗和transwell侵襲實驗檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力，并檢測模型條件下UCA1表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IL-6處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲及遷移能力均顯著增強，且細(xì)胞UCA1表達(dá)含量明顯提高，提示TP滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及遷移能力增強可能和UCA1 高表達(dá)相關(guān)。因此，我們采用小RNA干擾技術(shù)敲低UCA1在HTR-8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá)，通過實時熒光定量PCR法檢測UCA1表達(dá)以驗證轉(zhuǎn)染效果，transwell侵襲及遷移實驗檢測UCA1敲低后HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲、遷移能力。結(jié)果提示，siRNA干擾后UCA1表達(dá)明顯下調(diào)，HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲及遷移能力均明顯下降，反向證明了UCA1對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)作用。Shao 及Xu 等團(tuán)隊研究了UCA1 在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病中的作用，結(jié)果表明敲低UCA1能夠抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞活力并減弱細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力，這和我們下調(diào)UCA1 表達(dá)抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲、遷移的研究結(jié)果一致［17,18］。不同的是，我們首次探討了UCA1在TP中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用。

腫瘤細(xì)胞的EMT是一種上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程。在腫瘤進(jìn)展過程中EMT路徑激活可致細(xì)胞間連接斷裂、細(xì)胞極性喪失、基底膜降解及細(xì)胞外基質(zhì)重組，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和耐藥［25］。EMT發(fā)生后上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin、integrin β3、Vimentin 表達(dá)上調(diào)［23］。這些標(biāo)志蛋白除介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT外，還在其他細(xì)胞的粘附及侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，特別是在滋養(yǎng)細(xì)胞的介導(dǎo)的胚胎著床中也充當(dāng)重要角色。雖然以往文章報道了UCA1通過調(diào)控HIF-1a影響胚胎對缺氧環(huán)境的適應(yīng)性，但并未涉及其侵入肌層的功能，且在異位妊娠中的作用亦不明確［19］。既往研究表明，在膀胱癌、乳腺癌等疾病中UCA1表達(dá)失調(diào)和腫瘤EMT及疾病進(jìn)展有一定的相關(guān)性［26,27］。本研究發(fā)現(xiàn)UCA1表達(dá)增強可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及遷移能力，然而UCA1是否介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞EMT 仍不清楚，因此我們采用qRT-PCR 及Western Blot 檢測UCA1 沉默后HTR-8/SVneo細(xì)胞EMT 上皮及間質(zhì)標(biāo)志物mRNA 及蛋白的表達(dá)含量，結(jié)果顯示，上皮標(biāo)志分子E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo) 志分子N-cadherin、integrin β3、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，提示在滋養(yǎng)細(xì)胞中UCA1可以通過影響EMT相關(guān)分子促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移。本研究首次揭示了UCA1可以通過調(diào)控EMT促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移。然而，本研究未能將UCA1直接調(diào)控的miRNA及下游作用靶點進(jìn)行完整闡述。

綜上所述，在發(fā)生胚胎著床過程中，LncRNA UCA1可能發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控功能，其通過介導(dǎo)EMT相關(guān)蛋白高表達(dá)，增強滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移能力，從而導(dǎo)致其不斷侵襲輸卵管的嚴(yán)重危害。本研究初步闡釋了UCA1對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移功能的影響及UCA1與EMT相關(guān)蛋白的關(guān)系，為TP藥物治療突破提供了初步實驗依據(jù)。