龔順航，楊杰，張金濤，吳興林，江山，張譽麟，龔廣斌，吳寧，孫見飛，吳遵秋

貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院化學與生物化學實驗室，貴州 貴陽550025

高脂血癥（HLP）是機體脂質(zhì)代謝紊亂、脂肪轉(zhuǎn)運異常引起的代謝性疾病，表現(xiàn)為血清中的總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平過高或高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平過低［1］，由于起病緩慢、隱匿，難以早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、早治療，易導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心腦血管疾病等［2,3］。目前，治療高脂血癥的藥物主要是他汀類和貝特類，但長期服用會導(dǎo)致橫紋肌溶解，肝腎功能損害等嚴重不良反應(yīng)［4］。中藥治療高脂血癥療效顯著且無明顯機體損害，在血脂代謝異常方面的調(diào)控作用越來越突出，逐漸成為新的研究熱點。

研究表明，雪蓮果（Yacon）具有降血脂、降血糖、抗氧化等作用，但其藥理學研究甚少［5,6］。研究發(fā)現(xiàn)雪蓮果中糖類成分對高脂飲食所致小鼠血脂升高有明顯抑制作用［7］。一定劑量的雪蓮果汁能上調(diào)大鼠肝臟組織中腺苷酸活化蛋白激酶mRNA 和蛋白質(zhì)表達，下調(diào)乙酰輔酶A 羧化酶mRNA和蛋白質(zhì)表達，從而達到降脂作用［8］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)Yacon浸膏能抑制大鼠胰腺中胰脂肪酶、輔脂酶的合成，減少大鼠腸道對小分子脂質(zhì)的外源性吸收［9］。雖然近幾年基于雪蓮果葉和塊根的研究逐漸深入，但對于雪蓮果如何糾正脂代謝異常的具體機制尚未見文獻報道。而過氧化物酶增殖物激活受體α（PPARα）已被證實參與脂質(zhì)代謝的各個方面，包括脂肪攝取、轉(zhuǎn)運、合成、線粒體氧化等［10］；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)是催化膽固醇合成步驟中的關(guān)鍵限速酶，逐漸成為治療肥胖、高脂血癥等代謝性疾病的研究重點［11］。故本課題組通過建立高脂血癥大鼠模型，觀察肝臟系數(shù)、肝臟病理、血脂水平變化以及肝組織中HMGCR、PPARα及其下游分子mRNA和蛋白的表達，探究Yacon浸膏影響高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的分子機制，為中醫(yī)藥治療肥胖、高脂血癥等代謝性疾病提供實驗數(shù)據(jù)和新的方向，也為“藥食同源”果類的開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物：60只7周齡雄性SD大鼠，潔凈級，體質(zhì)量為180～220 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗設(shè)施合格證編號：[SYXF(黔)2018-0001]，環(huán)境溫度22±2 ℃，相對濕度（55±15）%，正常光照12 h，自由攝食飲水。高脂飼料由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，主要成分：普通飼料（72.8%）、豬油（15%）、蔗糖（10%）、膽固醇（2%）及三號膽鹽（0.2%）。

1.2 倫理審查

本動物實驗方案獲得貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審核（NO.1900041）。

1.3 藥物及試劑

總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）試劑盒（深圳子科生物科技有限公司）；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（安徽巧伊生物科技有限公司）；一抗HMGCR、PPARα、β-actin（Bioworld）；CYP7A1、CPT-1（Baijia）；二抗（Bioworld）；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；Yacon種類：云南天山Y(jié)acon；非諾貝特片（0.1 g/片，信宜萬象藥業(yè)）。

1.4 主要儀器

ABI StepOnePlus?實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher），AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，由Vazyme Biotech Co.Ltd.提供，Trizol由Invitrogen提供，PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），購于TaKaRa Biomedical Technology（Beijing）。全功能酶標儀（美國伯樂公司）；4 ℃低溫高速離心機（Thermo Fisher）；凝膠成像系統(tǒng)（Synoptics）；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.5 動物分組及高脂模型的建立

60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機數(shù)表法分為空白組（10只）和高脂模型組（50只），空白組（Normal）用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂模型組采用高脂飼料造模喂養(yǎng)8 周，尾靜脈取血，分離血清進行TG、TC水平檢測，隨后按照體質(zhì)量梯度分為：Yacon浸膏高劑量組（Yacon 5 g/kg）、浸膏中劑量組（Yacon 2.5 g/kg）、浸膏低劑量組（Yacon 1.25 g/kg），非諾貝特陽性對照組（Fenofibrate）、模型組（Model），10只/組，每周固定時間測量并記錄各組大鼠體質(zhì)量變化并定量調(diào)整用藥情況。（本文后續(xù)以FEN組、Mod組、Normal組分別簡稱陽性對照組、模型組、空白組）。

1.6 Yacon浸膏的制備

取2.5 kg新鮮Yacon，洗凈、切片、漂洗0.5 h，于電磁爐連續(xù)浸提3次，1 h/次，合并浸提液，收集濾液后，經(jīng)蒸發(fā)、濃縮、干燥、分裝、滅菌等步驟后，保存至4 ℃冰箱，實驗時備用。

1.7 給藥方案

Yacon浸膏高、中、低劑量組分別以5、2.5、1.25 g/kg劑量給藥（按生藥量計）［9］，加蒸餾水稀釋至4.5 mL進行灌胃，1次/d，持續(xù)8周，給藥劑量參考人與大鼠之間體表面積折算方法，最終基于前期優(yōu)選實驗結(jié)果確定；FEN組以每天27 mg/kg的劑量進行灌胃（人的每日臨床用量300 mg/d，大鼠非諾貝特等效劑量=300×0.018×5=27 mg/kg）［12］，Normal組和Mod組每天定時用等量生理鹽水灌胃1次，連續(xù)給藥8周。

1.8 標本采集

末次給藥后各組大鼠禁食不禁水12 h，稱重后腹腔注射水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血5 mL，4 ℃靜置后3000 r/min離心10 min，血清分離后分裝于無菌EP管內(nèi)，-20 ℃冷藏以備后期生化檢測。大鼠頸椎脫臼法處死，解剖取肝臟組織，去除臟器周圍結(jié)締組織，生理鹽水洗凈后濾紙吸盡表面液體，置于電子天平上稱重并記錄，組織分為兩部分，一部分于4%多聚甲醛溶液中固定；另一部分置于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 測定肝臟系數(shù)

大鼠肝臟完整取出后生理鹽水洗凈并用濾紙吸干液體成分，于電子天平上稱重并記錄臟器濕重數(shù)值，計算臟器系數(shù)。計算公式如下：

1.10 ELISA 法檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C水平

根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟測定各組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C水平含量。

1.11 肝臟組織病理學觀察

大鼠麻醉后充分暴露肝臟，觀察脂肪附著、質(zhì)地軟硬等；另取4%多聚甲醛已固定的肝臟，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后，進行HE染色，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織病理變化并采集圖像。

1.12 qPCR檢測肝臟組織中HMGCR、PPARα、CYP7A1、CPT-1 mRNA表達水平

將實驗器材進行高壓蒸汽滅菌，Trizol法提取大鼠肝臟組織總RNA，實驗樣本RNA溶解于DEPC水，檢測其純度后保存于-80 ℃的冰箱。逆轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，各引物序列見表1。按照試劑盒的說明書進行qPCR反應(yīng)，按以下條件進行基因擴增：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)1 次；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共循環(huán)40 次；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，溶解曲線分析。

表1 各基因的引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers used for real-time PCR

1.13 Western blot法檢測肝臟組織中HMGCR、PPARα、CYP7A1、CPT-1蛋白表達水平

取20 mg肝臟組織于200 μL裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，配置分離膠和濃縮膠后，用SDSPAGE樣品緩沖液1∶4稀釋樣品，95 ℃加熱變性5 min。20 μL上樣量電泳分離，目的蛋白轉(zhuǎn)膜，該膜為聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%的TBST脫脂奶粉封閉，加入一抗后4 ℃冰孵育1晚。再洗膜3次，用辣根過氧化物酶標記二抗，搖動60 min。用ECL混合液浸濕PVDF膜后通過凝膠成像系統(tǒng)顯影、定影、分析，得出其相對表達量。

1.14 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行分析，正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，兩兩比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）法。檢驗水準α=0.05，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義，所有實驗均獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響

造模結(jié)束后（第8周），與Normal組相比，Mod組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），出現(xiàn)脂肪異常蓄積的情況；與Mod組相比，各劑量組體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）。給藥結(jié)束后（第16周），與Normal組相比，Mod組大鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)顯著升高（P＜0.05），脂肪異常蓄積更為嚴重；與Mod組相比，F(xiàn)EN組、Yacon 5 g/kg組、Yacon 2.5 g/kg組體質(zhì)量增加、肝臟系數(shù)均降低（P＜0.05，圖1、表2）。

圖1 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠肝臟系數(shù)的影響Fig.1 Effect of yacon root extract on liver index of hyperlipidemic rats.*P＜0.05 vs Normal group;#P＜0.05 vs Mod group.

表2 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響Tab.2 Effect of yacon root extract on body weight and liver index of hyperlipidemic rats(Mean±SD,n=10)

2.2 Yacon浸膏對大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響

2.2.1 第8周空白組和高脂模型組大鼠血清TG、TC水平 造模喂養(yǎng)8周后，隨機從高脂模型組（50只）中抽取10只大鼠，測定空白組、高脂模型組大鼠TG、TC含量，與空白組相比，高脂模型組血清TG、TC水平明顯升高（P＜0.05，表3）。

表3 造模第8周各組大鼠的血脂指標（TG和TC）Tab.3 TG and TC levels of the rats in each group at 8 weeks of modeling(Mean±SD,mmol/L,n=10)

2.2.2 第16周各組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C水平 給藥8周后，取各組大鼠血清進行ELISA實驗，與Normal組相比，Mod組血清中TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與Mod組相比，Yacon 5 g/kg組血清TG、TC、LDL-C水平降低最顯著，HDL-C水平升高最顯著(P＜0.05)；與FEN組相比，Yacon 1.25 g/kg組降血脂效果則更有限（表4）。

表4 Yacon浸膏對各組大鼠血清中TG,TC,LDL-C 和HDL-C的影響Tab.4 Effect of yacon root extract on serum TG,TC,LDL-C and HDL-C levels of the rats(Mean±SD,mmol/L,n=10)

2.3 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠肝臟組織病理學的影響

光鏡下觀察大鼠肝臟組織病理變化，給藥8周后，Normal組大鼠肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝索排列較為整齊，未見明顯炎性浸潤和變性壞死等，肝竇結(jié)構(gòu)正常；Mod組大鼠肝細胞呈放射狀排列，肝索排列不整齊，細胞間隙增大，可見部分肝細胞胞質(zhì)內(nèi)含不著色、邊緣光滑的圓形脂滴，具有炎性浸潤和病理改變。與Mod組相比，各給藥組大鼠肝細胞脂肪沉積、病變程度均有不同程度減輕，F(xiàn)EN組和Yacon 5 g/kg組肝細胞呈放射狀排列，分葉不明顯，肝索排列整齊；中央靜脈內(nèi)皮完整，肝竇結(jié)構(gòu)正常，未見明顯淤血擴張及炎性浸潤；門管區(qū)小葉間動靜脈及小葉間膽管結(jié)構(gòu)均完整；Yacon 2.5 g/kg組、Yacon 1.25 g/kg組發(fā)現(xiàn)部分輕微脂肪變性伴空泡樣改變（圖2）。

圖2 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠肝臟組織病理變化的影響Fig.2 Effect of yacon root extract on pathological changes of the liver tissue in hyperlipidemic rats(HE staining,original magnification:×400).A-F:Normal control group,Model group,FEN group,Yacon 1.25 g/kg,Yacon 2.5 g/kg,Yacon 5 g/kg,respectively.

2.4 Yacon 浸膏對高脂血癥大鼠肝臟中HMGCR、PPARα、CYP7A1、CPT-1 mRNA表達的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示，與Normal組相比，Mod組中PPARα、CYP7A1、CPT-1 mRNA 表達水平均降低（P＜0.01），HMGCR mRNA表達水平升高（P＜0.01）；與Mod組相比，經(jīng)Yacon 浸膏治療8 周后，Yacon 5 g/kg 組PPARα、CYP7A1、CPT-1mRNA 表達水平升高最顯著（P＜0.001），HMGCR mRNA表達水平降低（P＜0.001）；與FEN 組相比，Yacon 1.25 g/kg 組PPARα、CYP7A1、CPT-1 mRNA 表達水平均降低（P＜0.01），HMGCR mRNA表達水平升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠肝臟中PPARα、CYP7A1、CPT-1、HMGCR mRNA表達水平的影響Fig.3 Effect of yacon root extract on mRNA expression levels of PPARα,CYP7A1,CPT-1 and HMGCR in the liver of hyperlipidemic rats.**P＜0.01 vs Normal group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Mod group;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01 vs FEN group.

2.5 Yacon 浸膏對高脂血癥大鼠肝臟中HMGCR、PPARα、CYP7A1、CPT-1蛋白表達的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，與Normal組相比，Mod組中PPARα、CYP7A1、CPT-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05），HMGCR 蛋白表達水平升高（P＜0.001）；與Mod組相比，經(jīng)Yacon浸膏治療8周后，Yacon 5 g/kg組PPARα、CYP7A1、CPT-1 蛋白表達升高最顯著（P＜0.001），HMGCR蛋白表達水平降低（P＜0.001）；與FEN組相比，Yacon 1.25 g/kg組PPARα、CYP7A1、CPT-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05），HMGCR蛋白表達水平升高（P＜0.001，圖4）。

圖4 Yacon浸膏對高脂血癥大鼠肝臟中PPARα、CYP7A1、CPT-1、HMGCR蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of yacon root extract on expression levels of PPARα,CYP7A1,CPT-1 and HMGCRproteins in the liver of the hyperlipidemic rats.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Normal group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Mod group;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01,▲▲▲P＜0.001 vs FEN group.

3 討論

機體血漿中的脂質(zhì)來源包括外源性小腸消化吸收和內(nèi)源性脂質(zhì)合成，脂肪代謝紊亂、降解通路障礙等均會引起HLP［13,14］，臨床上評價其發(fā)生發(fā)展的主要指標為：血清中TG、TC、LDL-C水平過高或HDL-C水平過低［15］，目前調(diào)脂一線藥物為他汀類、貝特類等，其作用耙點明確，但長期服用會導(dǎo)致肝腎損害、橫紋肌溶解等嚴重不良反應(yīng)，而中醫(yī)藥因其多成分、多耙點、多效應(yīng)的優(yōu)勢，可預(yù)防和治療HLP［16］。Yacon作為常見藥食同源型水果，因國內(nèi)外藥理研究尚不充分而限制其開發(fā)利用，研究表明，Yacon塊根和葉中含有酚酸、黃酮、倍半萜內(nèi)酯類等化合物，具有降血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等作用，但具體機制不清［17］。安磊等［18］發(fā)現(xiàn)Yacon 低聚果糖可改善氧化所致的神經(jīng)退行性疾病，國外學者研究發(fā)現(xiàn)Yacon中有效成分參與機體清除超氧自由基和改善腸道黏膜愈合等過程［19,20］。本課題組前期經(jīng)生物信息學分析后，從腸道外源性脂質(zhì)吸收途徑探究Yacon浸膏影響大鼠腸道脂質(zhì)吸收的機制，本研究擬從內(nèi)源性脂代謝信號通路探究其降脂機制。

中藥干預(yù)高脂血癥涉及肝臟多種信號通路［21］，PPARα是脂質(zhì)代謝中承上啟下的關(guān)鍵靶點［22］；HMGCR是膽固醇生物合成途徑的限速酶，也是臨床上他汀類藥物的主要作用靶點之一［23］。PPARα可調(diào)節(jié)其下游脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（CD36）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）等，促進脂肪酸β氧化和膽汁酸代謝過程，新型PPARα激動劑已被證實可以改善非酒精性脂肪肝患者的糖脂代謝并延緩高脂血癥的發(fā)展［24-26］。本研究結(jié)果顯示：HLP 大鼠較Normal 組肝臟PPARα、CPT-1、CYP7A1表達明顯減少，脂肪酸β氧化、膽汁酸代謝水平降低，導(dǎo)致TG、TC代謝異常，經(jīng)Yacon浸膏干預(yù)后，隨著濃度增加，PPARα、CPT-1、CYP7A1表達水平升高，脂肪酸β氧化、膽汁酸代謝過程加快，TG、TC水平降低，提示Yacon浸膏通過促進肝臟PPARα的表達，上調(diào)CPT-1和CYP7A1水平，加快脂肪酸β氧化、膽汁酸代謝過程來調(diào)控TG、TC代謝。內(nèi)源性膽固醇的合成增加是引起高脂血癥的原因之一，關(guān)鍵步驟為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的過程，HMGCR作為該步驟的限速酶起到重要調(diào)控作用［27,28］。研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶可直接磷酸化甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-2下調(diào)HMGCR的轉(zhuǎn)錄，為治療HLP的重要途徑［29］，本研究結(jié)果顯示：HLP大鼠較Normal組肝臟HMGCR的表達明顯升高，加快TC 的合成過程致其異常蓄積，經(jīng)Yacon浸膏干預(yù)后，HMGCR表達水平明顯降低，TC水平降低，提示Yacon浸膏通過抑制HMGCR的表達，減少了TC的合成過程。

綜上所述，Yacon浸膏可通過調(diào)節(jié)血脂水平來預(yù)防HLP，也能通過其多種有效成分，作用于HMGCR靶點和PPARα信號通路調(diào)控TG、TC代謝，減輕肝臟脂肪變性程度并延緩HLP的發(fā)生發(fā)展。另外，本課題組偶然發(fā)現(xiàn)Yacon浸提液空氣中久置易被氧化成深綠色，這可能與酚酸類物質(zhì)的抗氧化作用相關(guān)，而抗氧化作用對于減輕脂質(zhì)過氧化，改善糖脂代謝也有著重要作用，在趨化性促炎信號啟動后，核因子κB可磷酸化胰島素受體底物1（IRS1）導(dǎo)致胰島素抵抗和過量活性氧生成，而轉(zhuǎn)錄因子核因子κB的活化能誘導(dǎo)抗氧化基因的表達從而降低活性氧水平和緩解炎癥反應(yīng)［30,31］，Yacon和二甲雙胍的水提取物在誘導(dǎo)型糖尿病實驗大鼠中表現(xiàn)為相似的降血糖作用［32］，Yacon塊根能夠使糖尿病大鼠肝腎組織中的谷胱甘肽水平升高［33］。因此我們推測，Yacon也可能通過改善氧化應(yīng)激水平和降低炎癥反應(yīng)來預(yù)防或治療HLP、糖尿病等疾病，課題組后續(xù)也將進一步研究。本實驗結(jié)果不僅揭示了Yacon浸膏通過機體多靶點、多途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的特點，還為其通過抗氧化、抗炎作用干預(yù)代謝性疾病提供了指導(dǎo)方向，為該方臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。