虞亙明，王鑫瑋，駱金光，蘇蕭，陶懷祥，聞志遠(yuǎn)，關(guān)翰

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠233030

急性腎損傷(AKI）是一種常見(jiàn)的臨床疾病，以腎小球?yàn)V過(guò)率突然下降為特征，表現(xiàn)為血清肌酐濃度升高或少尿，發(fā)生在各種臨床環(huán)境中，包括敗血癥、腎毒性和急性心力衰竭［1,2］。在臨床實(shí)踐中，盡管AKI這一臨床常見(jiàn)病受到高度重視，但仍是臨床醫(yī)生診治的難題，臨床上仍然無(wú)有效的方法治療或預(yù)防急性腎損傷［3-5］。AKI具有嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病率和死亡率高，對(duì)健康構(gòu)成巨大威脅［6,7］。主要并發(fā)癥包括容量超載、電解質(zhì)失衡、尿毒癥和藥物毒性。AKI發(fā)生時(shí)腎功能突然惡化，伴有含氮廢物滯留、電解質(zhì)和細(xì)胞外容量失調(diào)。臨床表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)腎功能突然或持續(xù)下降，在分子水平上，AKI最常見(jiàn)的形式是急性腎小管壞死，其特征是腎小管上皮細(xì)胞死亡和一個(gè)或多個(gè)腎小管段功能障礙，嚴(yán)重者可發(fā)展至腎功能衰竭甚至死亡［8,9］。其病理生理機(jī)制涉及多種細(xì)胞機(jī)制，如腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞(上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)功能障礙和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)等［10-12］。腎缺血再灌注損傷（IRI）是腎臟在某些條件下經(jīng)歷缺血階段再得到血液灌注，腎臟功能并未改善反而損傷加重的過(guò)程，也是引起急性腎臟損傷的主要原因［13,14］。AKI通過(guò)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡破壞腎小管的結(jié)構(gòu)和功能［15］。IRI的病理生理學(xué)非常復(fù)雜，涉及多個(gè)方面，包括管狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞代謝改變、鈣超載、自由基生成、炎癥和凋亡等最終導(dǎo)致終末期腎病［16］。分泌型磷蛋白-1（SPP1），也稱(chēng)為骨橋蛋白（OPN），是由人染色體4q22.1上編碼的SPPL基因分泌的蛋白質(zhì)，其與許多粘附受體結(jié)合基序相互作用，包括C端CD44v6結(jié)構(gòu)域和凝血酶切割的N端整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域［17］。最近的研究表明SPP1是一種與腫瘤密切相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖、凋亡、和抑制血管生成［18,19］。然而，目前尚未見(jiàn)SPP1在AKI中的系統(tǒng)性研究報(bào)道，其在細(xì)胞和動(dòng)物模型中的表達(dá)及意義也尚不明確。在我們的研究中，從GSE131454數(shù)據(jù)集中鑒定出，我們發(fā)現(xiàn)SPP1是與IRI相關(guān)性。本研究通過(guò)構(gòu)建腎臟IRI大鼠模型及缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型，觀察SPP1表達(dá)變化，并SPP1在腎臟IRI中的作用。

1 材料和方法

1.1 一般材料

健康SD雄性大鼠12只，6～8周齡，體質(zhì)量為180～200 g。飼養(yǎng)條件：恒溫25 ℃，相對(duì)濕度50%，12 h晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（倫動(dòng)科批字[2022]第066號(hào)）。

1.2 造模及分組

將12只大鼠隨機(jī)分為IRI組和假手術(shù)組各6只。大鼠經(jīng)麻醉后，固定于37 ℃恒溫手術(shù)操作臺(tái)上。沿大鼠腹部正中線作長(zhǎng)約2 cm切口，輕柔分離雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，使用無(wú)損傷顯微血管夾鉗夾腎蒂使腎臟缺血30 min，隨后移除血管夾，腎臟恢復(fù)血流后縫合切口，待大鼠自然蘇醒，IRI組再灌注24 h。假手術(shù)組僅做手術(shù)切口和縫合，不做其他處理。

1.3 血肌酐、尿素氮水平檢測(cè)

IRI組大鼠再灌注24 h后與假手術(shù)組大鼠經(jīng)眼眶后靜脈采血后處死，收集血液約0.5 mL，8000 r/min、4 ℃、離心5 min取上清。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐、尿素氮水平。

1.4 腎臟組織PAS染色法

各組大鼠處死后迅速取左側(cè)腎臟，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋，制備3 μm厚石蠟切片；剩余腎臟組織經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存。石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，流水沖洗；過(guò)典酸雪夫染色5 min，流水沖洗；鹽酸乙醇分化，流水沖洗；梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 腎臟免疫組織化學(xué)

取假手術(shù)組及IRI組腎臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定組織48 h后，浸蠟后包埋，石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O室溫孵育10 min，浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)20 min，牛血清封閉20 min，加SPP1、a-SMA I抗4 ℃孵育過(guò)夜。Ⅱ抗孵育1 h后加入ABC復(fù)合物，暗室孵育30 min，沖洗后加入顯色液，室溫孵育顯色10～30 min，加蘇木精染色50 s，梯度乙醇脫水，利用二甲苯透明處理，中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察。

1.6 腎臟組織免疫熒光染色法

取假手術(shù)組及IRI組石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，流水沖洗；檸檬酸鈉抗原修復(fù)20 min，體積分?jǐn)?shù)0.3%Trition X-100 室溫通透15 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%BSAA室溫封閉1h；滴加SPP1抗體（1∶200）、caspase-3抗體（1∶100），LTL-Biotinylated（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜；滴加Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）、TEXAS RED標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶300），室溫孵育1 h；PBS洗滌5 min×3次，滴加熒光封片劑，于高端全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 細(xì)胞的培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

我們使用ATCC細(xì)胞庫(kù)（Manassas,VA,USA）的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)基中并放置在37 ℃含有5%CO2和95%空氣的加濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)使用成熟的小干擾RNA樣本：由GenePharma公司（中國(guó)·上海）合成（si-SPP1）和陰性對(duì)照（si-NC），細(xì)胞按5×105/孔加入含有完全培養(yǎng)基的12孔板中于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Western blot法檢測(cè)si-NC組、si-SPP1組細(xì)胞SPP1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 缺氧復(fù)氧模型（H/R）的建立及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK-2細(xì)胞，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞按5×105/孔加入含有完全培養(yǎng)基的12孔板中，使用成熟的小干擾RNA樣本分為si-NC組、si-SPP1組。經(jīng)200 μmol/L CoCl2處理12 h使細(xì)胞缺氧后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h使細(xì)胞復(fù)氧［20］，分別為Control組、H/R組細(xì)胞。取si-NC組、si-SPP1組經(jīng)200 μmol/L CoCl2處理24 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。分別為si-NC+Control組、si-SPP1+Control組、si-SPP1+H/R組。

1.9 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

分別從Control 組、H/R 組細(xì)胞和si-NC+Control組、si-SPP1+Control組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞中提取蛋白并進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定。加入5×上樣緩沖液（使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配置10%的分離膠，電泳時(shí)的電壓設(shè)置為80 V運(yùn)行約30 min后觀察彩色蛋白分子量標(biāo)志物的條帶分離后將電壓調(diào)增至110 V。轉(zhuǎn)PVDF膜時(shí)電流設(shè)置為200 mA運(yùn)行90～120 min。封閉使用5%的脫脂奶粉，搖床2～3 h。孵育一抗使用的抗體分為：小鼠來(lái)源的（GADPH 1∶1000，碧云天），兔來(lái)源的SPP1（1∶1000，Abcam），兔來(lái)源的Caspase-3（1∶1000，碧云天），兔來(lái)源的Kim-1（1∶5000，Abcam）孵育二抗使用的抗體有：羊抗小鼠（1∶1000，碧云天），羊抗兔（1∶1000，碧云天）。最后使用Bio-Rad公司的曝光儀進(jìn)行條帶發(fā)光顯影。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去沉淀，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SPP1的分泌水平，主要步驟包括稀釋捕獲抗體包被至96孔酶標(biāo)板，室溫靜置過(guò)夜，10%FBS封閉30 min，加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本2 h，加入檢測(cè)抗體1 h，加入HRP 孵育20 min，加入底物TMB 顯色5～10 min，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)

分別為si-NC+Control組、si-SPP1+Control組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞胰蛋白酶消化，PBS洗滌、重懸細(xì)胞，離心1000 r/min，4 ℃、5 min棄上清；PBS洗滌1次，離心后棄上清；加入495 μL AnnexinV結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入1 μLAnnexin V-FITC和1 μL的PI染色液，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育20 min。上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖采用的是GraphPad Prism 6.01(GraphPad Software,Inc.USA)軟件分析，組間的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的差異性分析采用的是獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和One-way ANOVA。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)描述。P＜0.05考慮差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

IR 在鼠腎臟中進(jìn)行了全基因組長(zhǎng)鏈非編碼RNA和mRNA 微陣列分析。腎臟中l(wèi)ncRNA 和mRNA 的表達(dá)譜在Sham 組和IR 組之間存在顯著差異，共有276 個(gè)差異表達(dá)（P＜0.05，log FC＞2）的lncRNA（201 個(gè)上調(diào)，75 個(gè)下調(diào)）和267 個(gè)mRNA（192 個(gè)上調(diào)，75個(gè)下調(diào)）被確定。此外，差異表達(dá)mRNA 的表達(dá)火山圖和熱圖顯示SPP1是顯著上調(diào)的基因（圖1）。

圖1 IRI鼠腎臟全基因組長(zhǎng)鏈非編碼RNA 和數(shù)據(jù)集deg熱圖Fig.1 Heatmap of IRI murine kidney whole genome long chain non-coding RNA and dataset deg.

2.2 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平

與Sham組相比，IRI組血清肌酐、尿素氮水平明顯上升，表明成功構(gòu)建了大鼠缺血再灌注模型（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠血清肌酐及尿素氮的濃度測(cè)定Fig.2 Serum creatinine and urea nitrogen levels in each group.*P＜0.05 vs sham.

2.3 各組大鼠腎臟組織病理水平比較

PAS染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，腎小球及腎小管未見(jiàn)明顯異常改變，細(xì)胞排列較為整齊，無(wú)明顯改變，IRI組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)排列紊亂、松散、腎小管擴(kuò)張、腎小管細(xì)胞壞死和蛋白管型的出現(xiàn)（P＜0.05，圖3）。

圖3 大鼠腎臟組織病理學(xué)改變Fig.3 Histopathological changes in the rat kidney(PAS staining,original magnification:×200).*P＜0.05 vs sham.

2.4 各組大鼠腎臟組織α-SMA、SPP1表達(dá)的免疫組化結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，α-SMA、SPP1在腎缺血再灌注損傷的大鼠腎小球基底膜和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)均有顯著表達(dá)，主要定位在細(xì)胞質(zhì)，與Sham組相比，IRI 組α-SMA 表達(dá)明顯增高，與Sham 組相比，IRI 組SPP1表達(dá)明顯增高（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組大鼠腎臟組織a-SMA、SPP1表達(dá)Fig.4 Expression of α-SMA and SPP1 in rat kidney tissues in the two groups(immunohistochemical staining,×200).*P＜0.05 vs sham.

2.5 各組大鼠腎臟組織Caspase-3、SPP1表達(dá)的免疫熒光結(jié)果

免疫熒光結(jié)果顯示，Caspase-3定位于細(xì)胞質(zhì)，IRI組腎組織中Caspase-3表達(dá)明顯多于Sham組，SPP1定位于細(xì)胞質(zhì)，IRI組腎組織中SPP1表達(dá)明顯多于Sham組（P＜0.05，圖5）。

2.6 CoCl2處理后HK-2細(xì)胞Caspase-3、Kim-1、SPP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較及細(xì)胞上清液ELISA檢測(cè)SPP1的分泌水平

H/R組細(xì)胞Caspase-3、Kim-1、SPP1蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于Control 組（P＜0.05，圖6），H/R 組上清液細(xì)胞ELISA 檢測(cè)蛋白表達(dá)量水平明顯高于Control 組（P＜0.05，圖6）。

圖6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H/R處理后的HK-2細(xì)胞Caspase-3、SPP1、Kim-1蛋白表達(dá)和上清液ELISA檢測(cè)SPP1的蛋白分泌水平Fig.6 Western blotting for detecting caspase-3,SPP1 and Kim-1 protein expressions in HK-2 cells after H/R and ELISA for detecting SPP1 secretion level in the supernatant.*P＜0.05 vs control sham.

2.7 si-SPP1敲低效率驗(yàn)證以及si-NC組、si-NC+H/R組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞Caspase-3、KIM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Western blot結(jié)果顯示，si-SPP1組細(xì)胞SPP1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC組。si-NC+H/R組細(xì)胞Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-NC 組，si-SPP1+H/R 組細(xì)胞Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC+H/R組，si-NC+H/R組細(xì)胞KIM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-NC組，si-SPP1+H/R組細(xì)胞KIM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC+H/R組（P＜0.05，圖7）。

圖7 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-SPP1 組和si-NC 細(xì)胞組SPP1 蛋白表達(dá)的情況和si-NC 組、si-NC+H/R組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞Caspase-3、Kim-1蛋白表達(dá)情況Fig.7 Western blotting for detecting SPP1 protein expression in si-SPP1 and si-NC cell groups and caspase-3 and KIM-1 protein expressions in si-NC,si-NC+H/R and si-SPP1+H/R groups.*P＜0.05.

2.8 各組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，si-NC+H/R組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞凋亡率均高于si-NC組，si-NC+H/R組高于si-SPP1+H/R組凋亡率（P＜0.01，圖8）

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-NC組、si-NC+H/R組、si-SPP1+H/R組的細(xì)胞凋亡Fig.8 Flow cytometry detection of apoptosis in si-NC group,si-NC+H/R group and si-SPP1+H/R group,*P＜0.05.

2.9 si-NC組、si-NC+H/R組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞IκBa、p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

si-NC+H/R組細(xì)胞IκBa蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-NC組，si-SPP1+H/R組細(xì)胞IκBa蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC+H/R組，si-NC+H/R組細(xì)胞p65蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-NC組，si-SPP1+H/R組細(xì)胞p65蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC+H/R組（P＜0.05，圖9）。

圖9 Western blot實(shí)驗(yàn)和si-NC組、si-NC+H/R組、si-SPP1+H/R組細(xì)胞IκBa、p65蛋白表達(dá)情況Fig.9 Western blot experiments and cellular IκBa,p65 protein expression in si-NC group,si-NC+H/R group,si-SPP1+H/R group,*P＜0.05.

3 討論

臨床上，腎IR 損傷常由各種重大手術(shù)和休克引起，是引起AKI 的主要病因之一，腎IR 損傷一般由機(jī)體全身或局部器官血流量供應(yīng)障礙和代謝廢物排出受阻所致、腎臟能量的供需失衡引起嚴(yán)重的組織缺氧［21］雖然近幾年學(xué)者們提出了許多新的治療策略，但在臨床實(shí)踐中使用的價(jià)值十分有限。SPP1被稱(chēng)為骨橋蛋白，由SPP1基因編碼［22］。最初在骨骼中發(fā)現(xiàn)，但現(xiàn)在已知在幾種不同的組織中表達(dá)，例如胃腸道上皮、外分泌腺和遠(yuǎn)端腎小管［23］。該蛋白在腫瘤發(fā)生，侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著重要作用，其可以調(diào)節(jié)宿主免疫，并且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖［24］。己經(jīng)證實(shí)，SPP1在各種類(lèi)型的癌癥中表達(dá)上調(diào)如結(jié)腸癌等［25］。但關(guān)于SPP1與缺血再灌注關(guān)系的研究較少，最近的一項(xiàng)研究表明，SPP1在急性心肌梗死缺血再灌注損傷中的表達(dá)降低，SPP1在心肌梗死缺血再灌注損傷起到可能起到保護(hù)作用［26］。還有文章報(bào)道SPP1參與調(diào)控大鼠腦缺血再灌注急性期炎癥反應(yīng)［27］，在I/R后上調(diào)，SPP1在整個(gè)急性期持續(xù)波動(dòng)，以及一個(gè)必要的microRNAmiR-340-5p下調(diào)，可能參與了腦缺血再灌注急性期。此外，缺血誘導(dǎo)的Spp1表達(dá)降低可損傷新生血管形成，而Spp1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)新生血管生成［28］，推測(cè)SPP1可能與IRI存在一定關(guān)系，但SPP1在腎臟IRI中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究SPP1對(duì)AKI的作用和影響。

目前研究較為常見(jiàn)的急性腎損傷通常由腎臟缺血再灌注的引起，由于細(xì)胞對(duì)損傷刺激的敏感性不同，損傷既可以導(dǎo)致腎臟細(xì)胞死亡，也能夠僅引起細(xì)胞損傷［29］。細(xì)胞對(duì)缺血缺氧高度敏感，缺血性AKI 引起的細(xì)胞凋亡反應(yīng)在急性腎損傷病理生理中發(fā)揮重要作用［30,31］。為明確SPP1在IRI中的表達(dá)意義，參考本研究造模方法［32］，本實(shí)驗(yàn)制備了大鼠腎臟IRI模型和細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，結(jié)果顯示，IRI組大鼠的血清中的肌酐和尿素氮的表達(dá)明顯升高，以及代表腎臟小管損傷標(biāo)志物的Kim-1蛋白均升高，以及PAS染色結(jié)果均顯示IRI組損傷增加，證實(shí)我們成功構(gòu)建了大鼠IRI模型，大鼠腎臟SPP1表達(dá)升高，HK-2細(xì)胞H/R后表達(dá)也升高，初步證實(shí)了在AKI后SPP1在腎臟表達(dá)明顯升高，這提示SPP1可能在腎臟中AKI發(fā)揮重要作用，在此基礎(chǔ)上，我們的免疫熒光染色結(jié)果顯示SPP1 以及代表凋亡程度Caspase-3蛋白顯著增加，以及細(xì)胞缺氧復(fù)氧Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞SPP1，Caspase-3蛋白均升高，本研究表明SPP1可能通過(guò)凋亡途徑作用于AKI。

為進(jìn)一步探討SPP1在腎臟IRI中的作用，本研究通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA 下調(diào)HK-2 細(xì)胞中SPP1 表達(dá)，Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，si-SPP1+H/R組細(xì)胞Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率均低于si-NC+H/R組細(xì)胞，結(jié)果顯示下調(diào)SPP1表達(dá)可抑制H/R腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡，表明SPP1可能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞IRI，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與腎臟IRI的發(fā)生。

NF-κB是一種常見(jiàn)的信號(hào)通路，廣泛參與了細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。研究表明，NF-κB調(diào)節(jié)通路在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中起著重要作用［33］本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎臟IRI后激活了NF-κB信號(hào)通路，干擾SPP1可以下調(diào)NF-κB信號(hào)通路中IκBa和p65的表達(dá)來(lái)減輕腎缺血再灌注組織的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低NF-κB通路表達(dá)有關(guān)，表明SPP1的表達(dá)加重腎缺血再灌注組織損傷。

綜上所述，IRI大鼠腎臟組織及H/R腎小管上皮細(xì)胞HK-2 中SPP1 表達(dá)上調(diào)增加細(xì)胞凋亡，然而下調(diào)SPP1表達(dá)可抑制H/R腎小管上皮細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB通路表達(dá)水平有關(guān)，為臨床治療AKI提供了新的靶點(diǎn)。