解學芳，焦玲，田斌，常曉雨

肝細胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型，占89%～90%，其死亡率約占相關癌癥死亡原因的第三位[1-2]。我國是肝癌的高發(fā)國家，肝癌死亡率僅次于肺癌，排第二位，給我國人民健康帶來嚴重威脅[3]。HCC早期無特異性臨床表現(xiàn)癥狀，一旦出現(xiàn)乏力、黃疸、疼痛相關癥狀來醫(yī)院就診時大多處于中晚期，從而喪失了早期最佳手術、介入等治療機會，患者預后極差。超聲、CT是肝癌常規(guī)影像學檢查方法，但對于小肝癌容易造成誤診和漏診[4]。血清腫瘤相關標志物檢查在惡性腫瘤的早期診斷及預后隨訪中越來越受到臨床關注。甲胎蛋白(AFP)一直作為診斷HCC最為經(jīng)典、應用最為廣泛的標志物，但仍有20%～30%HCC患者血清呈陰性；甲胎蛋白異質(zhì)體L3(AFP-L3)為肝癌細胞所特有，診斷HCC特異性高，但仍有15%～30%的HCC患者表達陰性[5]。miRNAs是一類非編碼單鏈小RNA分子，在機體生理、病理等生命活動中發(fā)揮著重要生物學作用，其表達異常嚴重影響細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，致使細胞增殖和分化異常從而失去控制，最終導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]。微小RNA-21(miRNA-21)是發(fā)現(xiàn)和研究較早的miRNA之一，研究表明[7]miRNA-21異常表達與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關，可作為新型標志物用于HCC診斷。本研究擬選擇血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項標志物聯(lián)合檢測，評價其在HCC診斷與預后評估中的價值。

1 臨床材料與方法

1.1 臨 床 材 料 收 集2016 年1 月 至2018 年12 月101例來日照市人民醫(yī)院就診的HCC患者為研究對象列為HCC組，均經(jīng)病理組織學確診。男58例，女43例；年齡39～82歲，平均年齡(58.97±15.46)歲。另選取50例肝臟良性病變患者作為對照組，包括乙肝、丙肝、肝硬化等，男33例，女17例；年齡36～85歲，平均年齡(59.26±14.37)歲，均經(jīng)影像學、血清學、病理組織學排除癌變。兩組人群性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 選取標準 納入標準：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》診斷標準[8]；均為首次確診者；研究所需資料齊全；患者知情同意，全程配合該項研究。排除標準：排除非原發(fā)性肝癌患者；排除伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者；排除研究所需資料不全者。

1.3 方法 早06：00—09：00時空腹抽取兩組患者肘靜脈血8 mL，自凝后離心分離血清待檢。miRNA-21采用實時定量熒光聚合酶鏈反應法檢測，抽提總RNA試劑盒(Molecular Research Centre公司，美國)，合成第一鏈cDNA試劑盒(Fermentas公司，以色列)，qRT-PCR引物(miR-21和miR-16)(上海英駿生物公司)，PCR儀購于美國Bio-Rad公司，以miRNA-16作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt的方法計算血清miRNA-21 相對表達量；AFP 采用德國羅氏公司ELecsys-2010 及配套試劑電化學發(fā)光法檢測；AFP-L3采用親和吸附離心管法檢測，試劑盒由北京熱景生物技術有限公司提供，以2005年美國FDA設定AFP-L3/AFP≥10%作為陽性判斷標準。

1.4 結果判定 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3單項檢測超過臨界值即判定為診斷HCC陽性，等于或低于臨界值即判定為診斷HCC陰性；血清miRNA-21、AFP、AFP-L3聯(lián)合檢測有一項或一項以上指標超過臨界值即判定為診斷HCC陽性，均等于或低于臨界值即判定為診斷HCC陰性。

1.5 預后隨訪 患者出院后對其定期追蹤回訪，隨訪時間3～36個月。囑患者自初次治療結束后定期來醫(yī)院復查，復查頻率為每3個月一次，復查內(nèi)容包括血清學及影像學檢查。隨訪過程中發(fā)現(xiàn)有復發(fā)灶、新的轉(zhuǎn)移灶或死亡均被定義為“事件”，隨時停止隨訪；至隨訪終點未發(fā)現(xiàn)新的復發(fā)灶、無發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶或無死亡均被定義為“無事件”。記錄每次患者復查資料。

1.6 統(tǒng)計學方法 研究所得數(shù)據(jù)應用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計處理，以均數(shù)±標準差(±s)表示計量資料，行t檢驗；以率[n(%)]表示計數(shù)資料，行χ2檢驗；生存分析利用Kaplan-Meier 法及Log-rank檢驗；以病理診斷結果為金標準，用四格表法統(tǒng)計計算血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 單項、兩兩組合及三項聯(lián)合檢測診斷HCC價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC組與對照組血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水 平 比 較 HCC 組 患 者 血 清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明顯高于良性對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 HCC組與對照組血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平比較(±s)

表1 HCC組與對照組血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平比較(±s)

注：miRNA-21=微小RNA-21，AFP=甲胎蛋白，AFP-L3=甲胎蛋白異質(zhì)體L3，下同；與對照組比較，aP＜0.01。

組別 例數(shù) miRNA-21 AFP/(ng·mL-1) AFP-L3/(%)HCC組 101 13.06±4.23a 298.26±96.87a 16.44±5.23a對照組 50 1.26±0.47 17.39±3.12 7.69±2.98 t值 19.631 20.452 10.972 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 HCC 不同臨床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 表達水平比較 HCC組患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達水平與性別、年齡、腫瘤部位無明顯相關性(均P＞0.05)；與腫瘤直徑、臨床分期、肝功能分級、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、治療明顯相關，腫瘤直徑＞5 cm、臨床高分期、肝功能C級、轉(zhuǎn)移、復發(fā)及治療前血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達水平明顯高于腫瘤直徑≤5 cm、臨床低分期、肝功能A/B級、無轉(zhuǎn)移、無復發(fā)及治療后血清水平(均P＜0.01)，見表2。

表2 HCC不同臨床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達水平比較(±s)

表2 HCC不同臨床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達水平比較(±s)

注：組內(nèi)分別比較，bP＞0.05，cP＜0.01。

臨床病理因素 例數(shù) miRNA-21 t值 P值 AFP/(ng·mL-1) t值 P值 AFP-L3/% t值 P值性別 0.708 ＞0.05 1.522 ＞0.05 1.968 ＞0.05男58 13.34±4.15b 312.54±101.36b 17.32±5.73b女43 12.68±5.21 281.33±95.47 15.27±4.31年齡/歲 0.544 ＞0.05 1.277 ＞0.05 1.723 ＞0.05≤60 45 12.77±3.79b 284.59±102.33b 15.34±5.06b＞60 56 13.29±5.44 309.25±98.76 17.32±6.23腫瘤發(fā)生部位 1.901 ＞0.05 0.633 ＞0.05 0.702 ＞0.05左肝 53 12.20±5.47b 304 48 14.01±3.87 291 5.467 ＜0.01 40 10.06±2.32 210 61 15.23±5.67c 356 11.172 ＜0.01 60 8.35±3.12 211 41 20.13±7.26c 413.52±110.35b 16.03±6.57b右肝 .35±97.62 16.89±5.64腫瘤直徑/cm 6.942 ＜0.01 4.481 ＜0.01≤5 .34±79.35 13.01±4.37＞5 .28±116.32c 18.69±7.21c臨床分期 9.168 ＜0.01 10.123 ＜0.01Ⅰ+Ⅱ .16±65.19 10.82±4.21Ⅲ+Ⅳ .62±152.13c 24.67±9.32c肝功能分級 9.506 ＜0.01 10.213 ＜0.01 9.061 ＜0.01 A級+B級 79 10.53±3.97 221.16±75.23 12.11±4.69 C級 22 22.13±7.89c 465.27±159.34c 25.79±10.16c淋巴結轉(zhuǎn)移 8.673 ＜0.01 3.431 ＜0.01 4.687 ＜0.01無36 7.36±2.88 248.22±73.61 12.13±4.66有65 16.23±5.74c 326.29±125.63c 18.67±7.21c遠處轉(zhuǎn)移 9.441 ＜0.01 10.523 ＜0.01 8.565 ＜0.01無82 10.71±4.03 254.16±77.65 13.62±5.17有19 23.19±8.67c 532.69±179.82c 28.37±11.46c復發(fā) 14.470 ＜0.01 13.452 ＜0.01 8.290 ＜0.01無80 10.53±4.12 222.14±82.43 13.49±4.89有21 22.69±6.64c 596.33±192.14c 27.69±12.13c治療 22.231 ＜0.01 27.106 ＜0.01 14.335 ＜0.01前101 13.06±4.23c 298.26±96.87c 16.44±5.23c后101 3.27±1.32 35.27±5.69 7.23±3.79

2.3 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平對HCC患者預后的影響 隨訪3年，HCC患者血清腫瘤標志物高水平表達組(miRNA-21＞18.13、AFP＞432.15 ng/mL、AFP-L3＞23.86%) 無事件發(fā)生率明顯低于低水平表 達 組(miRNA-21 ≤18.13、AFP ≤432.15 ng/mL、AFP-L3≤23.86%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2＝11.867、18.929、9.666，P＝0.001、＜0.001、0.002)，P＜0.01，見圖1～3。

圖1 血清miRNA-21水平與HCC治療后3年生存狀況關系

圖2 血清AFP 水平與HCC治療后3年生存狀況關系

圖3 血清AFP-L3水平與HCC治療后3年生存狀況關系

2.4 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項聯(lián)合檢測

診斷HCC的價值比較 繪制ROC曲線求取血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 診斷HCC臨界值。血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 診斷HCC的曲線下面積(AUC)分別為0.869(95%CI：0.761，0.892)、0.789(95%CI：0.717，0.860)、0.763(95%CI：0.695，0.843)；約登指數(shù)分別為0.776、0.654、0.603；診斷HCC臨界 值 分 別 為miRNA-21：2.78，AFP：22.69 ng/mL，AFP-L3：10.98%。

血 清miRNA-21、AFP、AFP-L3 診 斷HCC實 驗室結果與病理診斷結果對照，見表3；以病理診斷為金標準，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3單項及聯(lián)合檢測診斷HCC價值，見表4。血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項聯(lián)合檢測診斷HCC的敏感性、準確性、陰性預測值與各單項及兩兩組合比較明顯提高(P＜0.01)。

表3 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3診斷HCC實驗室結果與病理診斷結果對照(n)

表4 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3單項及聯(lián)合檢測診斷HCC的價值比較 單位：%

3 討論

血清腫瘤標志物檢測是具有標本采集方便、可定量及動態(tài)測定等特點的一項無創(chuàng)性篩查惡性腫瘤的體外診斷實驗[9]。相關研究報道[10]，血清腫瘤標志物在惡性腫瘤早期就有升高現(xiàn)象，往往比影像學改變及患者出現(xiàn)臨床癥狀提前4～6個月，其檢測適合惡性腫瘤高危人群篩查、早期診斷及預后隨訪[11]。由于惡性腫瘤基因及發(fā)病機制的復雜性，一種惡性腫瘤可以產(chǎn)生多種與之相關的標志物，或一種標志物可以在多種惡性腫瘤表達，它們的敏感性、特異性不盡相同，有選擇的數(shù)種標志物聯(lián)合檢測，可有效提高診斷惡性腫瘤的準確性[12]。miRNA-21、AFP、AFP-L3等與HCC發(fā)生、發(fā)展密切相關，它們都可作為HCC診斷的生物學指標。

多種惡性腫瘤如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等發(fā)生發(fā)展與miRNAs密切相關，miRNA在其過程中通過對蛋白編碼基因的調(diào)控發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的作用[6]。miRNA-21 作為miRNAs 一員，其在HCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)控等多方面發(fā)揮著重要生物學作用[13]。miRNA-21作為癌基因促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，在HCC早期血清miRNA-21升高現(xiàn)象比AFP明顯，可以作為診斷HCC 早期診斷的預警標志物[14]。外周血miRNA-21水平與HCC的生物學行為如腫瘤大小、肝功能分級、臨床分期、復發(fā)轉(zhuǎn)移等高度相關，有效治療后隨著瘤體負荷減少或瘤體消失，血清miRNA-21水平與治療前比較明顯下調(diào)，可以作為監(jiān)控預后的指標[7]。AFP是一種糖蛋白，由妊娠期胎兒肝臟和卵黃囊產(chǎn)生的，出生后外周血含量一般小于20 ng/mL[15]。當肝組織細胞發(fā)生癌變時，肝癌細胞內(nèi)AFP合成基因被激活而大量產(chǎn)生和分泌AFP，釋放到外周血液中，外周血液含量增高，甚至超過1 000 ng/mL[16]。我國《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》 要求AFP作為原發(fā)性肝癌篩查、診療中必查的血清學指標[8]。高濃度AFP抑制機體正常免疫應答，從而促進肝癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[17]。AFP-L3稱為AFP異質(zhì)體，為肝癌細胞特有產(chǎn)生，一般以AFP-L3%代表血清表達量，AFP-L3%是指AFP-L3 占AFP 總量的百分比，AFP-L3%是HCC生物學惡性程度的一個標志[18]。2005年美國FDA把AFP-L3%≥10%作為肝癌的預警臨界值，如果患者血清AFP-L3%≥10%提示罹 患HCC 的 可 能 性 很 大[19]。 早 期HCC 血 清AFP-L3%出現(xiàn)升高現(xiàn)象要早于影像學改變，因此AFP-L3%的測定對HCC的早期診斷具有重要意義，如果術后AFP-L3%水平變化不明顯，提示癌組織有殘留[20]。

本研究結果顯示，HCC組患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明顯高于對照組(P＜0.01)；腫瘤直徑≥5 cm、臨床高分期、肝功能C級、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、治療前血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明顯高于腫瘤直徑≤5 cm、臨床低分期、肝功能A/B級、無轉(zhuǎn)移、無復發(fā)、治療后血清水平(均P＜0.01)。雖然miRNA-21、AFP、AFP-L3都可以作為診斷HCC血清學指標，但單獨性檢測價值有限，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3聯(lián)合檢測做到相互印證、相互補充，診斷HCC敏感性、準確性明顯提高，從而減少誤診、漏診；依據(jù)生存曲線評估預后。

綜上所述，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項聯(lián)合檢測有利于HCC早期診斷、監(jiān)控病情及預后評估。