王啟航，王 偉，王偉周，商 微

(1.中國解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心生殖醫(yī)學(xué)科，北京 100700;2.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心生殖中心，北京 100037;3.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)醫(yī)學(xué)部，北京 100700)

線粒體是真核細(xì)胞中必不可少的細(xì)胞器，主要通過氧化磷酸化(oxidative phosphrylation,OXPHOS)產(chǎn)生細(xì)胞能量[1]。線粒體疾病是指線粒體基因組和(或)核基因組突變，導(dǎo)致細(xì)胞OXPHOS障礙引起的一類疾病，目前尚無方法治愈[2]。在大多數(shù)病例中，臨床表現(xiàn)往往各不相同，疾病譜重疊[3]。兒童每10萬人中5～15人患病[4]，成年人每10萬人中12.5人患病，在所有致病性突變中每10萬人中23人患病[5]。目前預(yù)防重線粒體DNA(mtDNA)疾病遺傳的常規(guī)方法包括產(chǎn)前診斷和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)。產(chǎn)前診斷是一種對不同妊娠早期階段的細(xì)胞進(jìn)行采樣的技術(shù)，可用于降低嚴(yán)m(xù)tDNA疾病地風(fēng)險，并可在突變負(fù)荷高時選擇終止[6]。產(chǎn)前診斷的主要困難是mtDNA突變負(fù)載在不同組織之間可能不同，也可能取決于取樣時的胎兒發(fā)育階段[7]。PGD技術(shù)開發(fā)于30年前[8]，最近幾年才應(yīng)用于減少或消除mtDNA疾病。該技術(shù)是從早期胚胎中取出的一個或多個細(xì)胞進(jìn)行基因檢測，并選擇無突變或低突變負(fù)荷的胚胎移植到子宮[9-10]。但PGD并不適合所有攜帶致病性mtDNA突變的患者，包括具有同源mtDNA突變或僅產(chǎn)生高突變負(fù)荷的患者。然而，女性患者必須生產(chǎn)出突變水平低于疾病表達(dá)臨界閾值的胚胎，才有可能生育一個健康的嬰兒。這就有了對替代技術(shù)的需要，以減少mtDNA疾病的遺傳風(fēng)險，如核質(zhì)置換技術(shù)[3]。核質(zhì)置換技術(shù)是從攜帶mtDNA突變的卵母細(xì)胞或受精卵中取出細(xì)胞核，然后轉(zhuǎn)移到的去核供體卵母細(xì)胞或受精卵中。該技術(shù)包括生發(fā)泡移植[11-12]、極體移植[13-14]、紡錘體移植[15-16]、原核移植[17-18]等。其中紡錘體移植是迄今為止研究最充分的核質(zhì)置換技術(shù)。有大量數(shù)據(jù)顯示該技術(shù)安全性最強，最具臨床轉(zhuǎn)化及臨床推廣潛力。本研究小鼠紡錘體移植，采用不同濃度的細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,CB)處理，通過檢測重構(gòu)卵母細(xì)胞骨架和統(tǒng)計重構(gòu)胚胎發(fā)育情況，篩選出更優(yōu)CB濃度，為人類紡錘體移植技術(shù)提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 小鼠品系為C57BL/6清潔級小鼠，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。雌鼠周齡為6～8周，雄鼠月齡為6～7個月。CB(Sigma，德國)、仙臺病毒(Hemagglutinating virus of japan,HVJ)(ISK，日本)、PMSG(寧波三生，中國)、絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)(寧波三生，中國)、4%多聚甲醛(Sigma，德國)、小鼠抗β-微管蛋白抗體(Sigma，德國)、Triton X-100(Sigma，德國)、FITC-山羊抗鼠抗體(Sigma，德國)、FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Solarbio，中國)、DABCO聚乙烯醇封片劑(Sigma，德國)

1.2實驗方法

1.2.1卵子準(zhǔn)備 雌性C57BL/6小鼠腹腔注射PMSG 10 U,48 h后注射hCG 10 U誘導(dǎo)超排，注射hCG14～16 h后取卵，挑選形態(tài)正常的MⅡ期卵母細(xì)胞(形態(tài)飽滿，光亮)，用體外操作液洗3次。再轉(zhuǎn)移到過夜平衡的受精液中，置于培養(yǎng)箱中待用。

1.2.2紡錘體移植(spindle transfer，ST)及分組 ST是指從MII期卵母細(xì)胞中取出紡錘體-染色體復(fù)合物，并將其轉(zhuǎn)移到另一個已去核的MII期卵母細(xì)胞中的過程。將準(zhǔn)備好的卵子放在含有不同濃度CB操作液中孵育,時間均為5 min。用持卵針固定住卵，在偏振光鏡下將紡錘體擺放成梭形，置于12～1點鐘位置，再用激光打透紡錘體對應(yīng)部分的透明帶，去核針經(jīng)透明帶缺口輕輕地吸出紡錘體-染色體復(fù)合物，注意盡量少帶紡錘體周圍的胞漿。然后把取出的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到HVJ-E中浸泡10 s左右，再將帶有HVJ-E的細(xì)胞核注入另外已經(jīng)去核的卵母細(xì)胞的卵周間隙中，最后將其轉(zhuǎn)入受精液中繼續(xù)孵育，觀察融合情況。分組：CB濃度7.5 mg/L為常規(guī)組、CB濃度3.5 mg/L為低劑量組、CB濃度10 μg/mL為中劑量組、CB濃度12.5 mg/L 高劑量組。

1.2.3精子獲能 成年健康的公鼠斷頸處死，迅速分離出附睪尾和輸精管，剪下附睪尾(盡可能去除脂肪)，在體式鏡下用精細(xì)剪將附睪尾剪 2～3 下，用鑷子輕輕擠出精子，然后將其轉(zhuǎn)移到過夜平衡的精子獲能液中，再置于CO2培養(yǎng)箱中獲能,獲能1 h后行體外受精(in vitro fertilization,IVF)。獲能好的精液呈云霧狀，雜質(zhì)少。

1.2.4IVF 各組重構(gòu)卵，洗滌后分別置于過夜平衡的20 μL受精液中(每滴放小于或等于10枚)， 然后將1 μL已獲能的精液加入到有卵母細(xì)胞的受精液滴中，放入37 ℃/ 6%CO2/5%O2培養(yǎng)箱，IVF 6 h后觀察受精情況，并轉(zhuǎn)移到卵裂液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5囊胚細(xì)胞計數(shù) 各組挑選出20枚左右擴(kuò)張期囊胚，分別用4%多聚甲醛固定，室溫30 min；1%PVA/PBS液清洗3次，5 min/次；將囊胚放入配制好的10 mg/L Hoechst 33342中染核，室溫避光孵育15 min；1% PVA/PBS液再清洗3次，5 min/次；將處理好的囊胚轉(zhuǎn)移到載玻片上，用DABCO聚乙烯醇防熒光淬滅封片劑封片；在熒光顯微鏡下觀察，用紫外光激發(fā)藍(lán)色熒光，統(tǒng)計囊胚細(xì)胞總數(shù)。

1.2.6微管β-Tubulin蛋白和微絲的免疫熒光染色 本實驗對各組重構(gòu)卵母細(xì)胞融合后0.5 h、1 h、2 h進(jìn)行取樣固定。簡單介紹染色過程如下：各組重構(gòu)卵母細(xì)胞通過連續(xù)激光打孔方式去除透明帶，清洗，用 4%多聚甲醛中固定半小時，轉(zhuǎn)移到0.5%TritonX 100中，清洗，轉(zhuǎn)移到含有1%BSA的封閉液中。處理好的卵放入1∶200封閉液稀釋的小鼠抗β-微管蛋白抗體中，4 ℃冰箱過夜；然后轉(zhuǎn)入1∶1 000封閉液稀釋的二抗(山羊抗鼠抗體)中，室溫避光1 h；再轉(zhuǎn)移到1∶100封閉液稀釋的TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽液中，室溫避光1 h；最后轉(zhuǎn)移到1∶200清洗液稀釋的DAPI中，室溫避光5～10 min。根據(jù)蓋玻片的大小，把凡士林/石蠟混合物，滴在干凈的蓋玻片上做4個小柱，在4個小柱中間滴上1%PVA/PBS液1 μL，將處理好的卵轉(zhuǎn)到1%PVA/PBS液中，小心蓋壓，使樣品位置固定，用DABCO聚乙烯醇防熒光淬滅封片劑封片。低溫保存，盡快用共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

1.3Aipathwell免疫熒光分析

1.3.1分析方法 采用AI深度學(xué)習(xí)原理，基于海量數(shù)據(jù)進(jìn)行算法訓(xùn)練并集成為自動化圖像分析軟件。具體過程如下，①循跡：自動定位并沿待測組織圈定待測區(qū)域，可根據(jù)具體要求手動定位；②選色：根據(jù)HSI自動進(jìn)行陽性判斷，可根據(jù)具體情況手動修正；③運算：根據(jù)需求，軟件自動定位細(xì)胞核并擴(kuò)展胞質(zhì)范圍；計算陽性細(xì)胞數(shù)量以及面積；累積光密度 (integrated optical density,IOD)；組織面積等不同參數(shù)；④分析：高倍下逐步計算待測區(qū)域。完成后根據(jù)原始基礎(chǔ)數(shù)據(jù)以及算法公式自動對各個項目進(jìn)行計算得出分析結(jié)果。

1.3.2評價項目 陽性強度，個陽性點顏色深淺的平均值：反應(yīng)整個片子或者某個區(qū)域陽性的平均深淺度。明場為平均光密度，暗場為平均強度，數(shù)值越大陽性程度越強。平均光密度值=累積光密度值陽性像素面積。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1比較各組移植效率 低劑量組、中劑量組、高劑量組與常規(guī)組相比，注核率、融合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即小鼠紡錘體移植效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組移植效率比較Table 1 Comparison of transplantation efficiency in each group (株數(shù)，%)

2.2比較各組胚胎發(fā)育情況 高劑量組的受精率低于常規(guī)組(P<0.05)；高劑量組的囊胚率、孵化率低于常規(guī)組(P<0.05)。見表2。

表2 各組胚胎發(fā)育情況比較Table 2 Comparison of embryonic development in each group (株數(shù)，%)

2.3比較不同濃度CB重構(gòu)小鼠囊胚細(xì)胞總數(shù) 為了避免胚胎級別對實驗結(jié)果的影響,所有實驗均選擇擴(kuò)張期囊胚進(jìn)行實驗。高劑量組的囊胚細(xì)胞總數(shù)少于常規(guī)組(P<0.05),中劑量組的囊胚細(xì)胞總數(shù)多于常規(guī)組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 各組囊胚細(xì)胞總數(shù)比較Table 3 Compared the total number of blastocysts in each group

圖1 各組囊胚免疫熒光染色A.常規(guī)組；B.低劑量組；C.中劑量組；D.高劑量組Figure 1 Immunofluorescence staining of blastocysts in each group

2.4免疫熒光染色比較重構(gòu)小鼠卵母細(xì)胞骨架恢復(fù)情況 融合后0 h觀察，微絲出現(xiàn)在紡錘體周圍；融合后1 h觀察，逐漸出現(xiàn)在皮質(zhì)區(qū)域；融合后2 h觀察，各組基本恢復(fù)正常。低劑量組、中劑量組、高劑量組和常規(guī)組相比，不同時間重構(gòu)小鼠卵微絲陽性比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但不同時間各組微絲的平均光密度值，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，時間點間比較有差異(P<0.05)，組間的時間變化趨勢差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即不同濃度CB和不同觀察時間對小鼠重構(gòu)卵細(xì)胞骨架恢復(fù)情況均有影響，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4,5和圖2～4。

圖2 各組融合后0 h細(xì)胞骨架恢復(fù)情況Figure 2 Cytoskeletal recovery in each group at 0 h after fusion

表4 不同時間各組微絲的陽性比率比較Table 4 Comparison of the positive ratio of microfilaments in each group at different time points (個數(shù)，%)

表5 不同時間各組微絲的平均光密度值比較Table 5 Comparison of the average optical density of microfilaments in each group at different time points

圖3 各組融合后1 h細(xì)胞骨架恢復(fù)情況Figure 3 Cytoskeletal recovery in each group at 1 h after fusion

圖4 各組融合后2 h細(xì)胞骨架恢復(fù)情況Figure 4 Cytoskeletal recovery in each group at 2 h after fusion

3 討 論

線粒體病是因遺傳缺陷引起線粒體代謝酶的缺陷導(dǎo)致APT合成障礙，能量產(chǎn)生不足而出現(xiàn)的一組系統(tǒng)疾病，目前臨床不能治愈。核質(zhì)置換技術(shù)的優(yōu)勢是可以有效預(yù)防突變mtDNA向子代傳遞，已在人類和動物模型上得到了證實。雖然臨床上已有通過核質(zhì)置換技術(shù)出生的嬰兒，但是實驗過程中重構(gòu)囊胚效率及質(zhì)量較低，且可用于移植的囊胚極少。因此，現(xiàn)階段提升核質(zhì)置換技術(shù)效率和重構(gòu)囊胚的質(zhì)量，已本領(lǐng)域研究的重點、難點和熱點。1983年McGrath和Solter開發(fā)了小鼠原核移植，并獲得子代，由此奠定了核質(zhì)置換技術(shù)的基礎(chǔ)。即從一個受精卵中取出原核，注入到另一個去核的胞質(zhì)中，細(xì)胞骨架抑制劑(CB和秋水酰胺)的前提下，使得原核很容易被取出，從而提高了受精卵的存活率。96%的重組受精卵發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段，移植到假孕雌鼠后產(chǎn)生活的后代(活出生率:16%)。該研究中CB濃度為5 mg/L，原核移植效率為90% 左右[19]。2013年，Tachibana等[20]發(fā)表了第一篇人類卵紡錘體移植的文章，該研究進(jìn)一步證實核質(zhì)置換技術(shù)的可行性，同時報道卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后，出現(xiàn)相當(dāng)比例的受精異常。與正常組比較，人類重構(gòu)卵的異常受精率更高(分別為13%、52%)，但在非人類靈長類紡錘體移植后受精卵中未觀察到，這可能是由于摘除和轉(zhuǎn)移過程中卵母細(xì)胞過早激活或紡錘體損傷所致。在本研究中未觀察到小鼠重構(gòu)卵異常受精，考慮可能與細(xì)胞融合方式或受精方式有關(guān)。該研究人紡錘體移植使用的CB濃度為5 mg/L，重構(gòu)卵正常受精的囊胚率是62%，對照組囊胚率是76%；而且重構(gòu)胚胎中核相關(guān)的mtDNA含量很低。2017年，張進(jìn)教授等報道了世界第一例人紡錘體移植活體嬰兒出生。由張進(jìn)教授等在墨西哥操作完成，并順利活產(chǎn)一名健康男嬰。患者為一名36歲的女性，經(jīng)歷了四次流產(chǎn)，活產(chǎn)兩名兒童，但由于母親遺傳的mtDNA突變(>95%)水平過高而死亡，已知這種突變可導(dǎo)致Leigh綜合征(m.8993T>G)。該研究人紡錘體移植，使用的CB濃度為7.5 mg/L，重構(gòu)卵中受精5枚，有4枚發(fā)育至囊胚。選擇胚胎移植的重構(gòu)囊胚中，mtDNA突變負(fù)荷的平均水平為5.73%，而出生后采集的多個組織中mtDNA突變負(fù)荷的平均水平為(1.60±0.92)%[21]。以上研究均未提及不同CB濃度對移植效率及胚胎發(fā)育情況的探討，本課題發(fā)現(xiàn)不同濃度CB對小鼠紡錘體移植效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是會影響重構(gòu)囊胚質(zhì)量。

2011年，Hu等[22]研究了CB對ICSI胚胎存活和體外發(fā)育的影響，該研究結(jié)果顯示，與未經(jīng)CB處理的對照組相比，用5 mg/L CB處理的ICSI胚胎的存活率顯著提高，但2組的受精率、卵裂率和囊胚率均沒有顯著差異。 該研究發(fā)現(xiàn)正常卵母細(xì)胞經(jīng)過5 mg/L CB處理后，紡錘體立即與質(zhì)膜平行，并且微絲無法檢測到。CB處理后0.5 h，在紡錘體周圍觀察到微絲(31/34，91.2%)；1 h后，逐漸出現(xiàn)在皮層區(qū)域(31/33，93.9%)；2 h后，已完全恢復(fù)(34/34，100%)， 該研究表明CB處理對微絲無影響。本研究通過免疫熒光染色，觀察小鼠卵的細(xì)胞骨架，并進(jìn)行定量分析，比較不同時間重構(gòu)小鼠卵微絲陽性比率及光密度值，結(jié)果顯示重構(gòu)小鼠卵微絲陽性比率無差別，但是不同濃度CB和不同觀察時間對重構(gòu)小鼠卵細(xì)胞骨架恢復(fù)情況均有影響，且有統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，在本研究選取的CB濃度范圍內(nèi)，中劑量組優(yōu)于常規(guī)組。CB在紡錘體移植中的作用是松弛細(xì)胞骨架，在胞質(zhì)完整的前提下，細(xì)胞核更容易取出，探討不同濃度CB在核移植過程中對重構(gòu)卵母細(xì)胞骨架及胚胎發(fā)育的影響，旨在增加紡錘體移植的安全性，降低核移植對重構(gòu)卵細(xì)胞骨架的影響，促進(jìn)重構(gòu)胚胎的發(fā)育，獲得更優(yōu)質(zhì)囊胚。