郭巍巍，趙萍萍，于露露，李 明*

南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬濱?？h人民醫(yī)院 1.介入與血管外科； 2.檢驗(yàn)科，江蘇 鹽城 224500

深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)是指血液在深靜脈腔內(nèi)異常凝結(jié)，常引起遠(yuǎn)端靜脈高壓、肢體腫脹甚至肺栓塞等[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但血管內(nèi)皮細(xì)胞活化后高表達(dá)的黏附分子如細(xì)胞間黏附分子(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、P-選擇素(P-selectin)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)等介導(dǎo)炎性細(xì)胞和血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，是DVT形成的重要因素[2]?？扇苄訡D40配體(soluble CD40 ligand, sCD40L)是CD40L的可溶性形式，是血小板激活的標(biāo)志物，可活化血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]。白細(xì)胞介素-35(interleukin-35, IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制因子，可抑制Th17細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞活化[4]，但其對sCD40L刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的影響缺乏報道。本次研究通過檢測DVT患者外周血清IL-35、sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF的表達(dá)，并通過體外細(xì)胞模型探討IL-35對sCD40L刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：選取2020年1月至2020年12月于濱?？h人民醫(yī)院介入與血管外科診治的下肢深靜脈血栓急性期患者30例作為實(shí)驗(yàn)組(DVT組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第3版《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》[5]，排除標(biāo)準(zhǔn)：非急性期深靜脈血栓患者、合并自身免疫性疾病、血管畸形者、接受過治療的深靜脈血栓患者等。同時選取30例健康體檢者作為對照組(HC組)，兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次研究經(jīng)濱?？h人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2020/01)，所有受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞及試劑：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVECs)及細(xì)胞完全培養(yǎng)基(湖北武漢豐暉生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞因子IL-35(Sigma-Aldrich公司)；可溶性CD40配體(sCD40L)(PeproTech公司)；IL-35、sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF ELISA試劑盒、羊抗鼠、羊抗兔二抗(南京翼飛雪生物技術(shù)有限公司)；抗VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素、vWF、NF-κB p65、pNF-κB p65抗體(Abcam公司)；DioC(6)熒光染料(亞科因生物技術(shù)有限公司)；鈣黃綠素試劑盒(日本同仁生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集：患者均于剛?cè)朐何丛盟幹委熐安杉瘶?biāo)本，所有受試者采集外周靜脈血2 mL置于肝素抗凝管，1 500 r/min離心10 min后，收集血清置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ELISA檢測血清中IL-35、sCD40L及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中內(nèi)皮細(xì)胞黏附相關(guān)因子的濃度：使用ELISA試劑盒檢測血清中IL-35、sCD40L及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF的濃度，按試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組： 將HUVECs接種至含有10%胎牛血清及細(xì)胞生長因子的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其增殖至80%匯合時進(jìn)行傳代。將HUVECs以1×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL。實(shí)驗(yàn)分為對照組(加入磷酸鹽緩沖液)、sCD40L組(加入25 μg/mL sCD40L)和IL-35組(加入20 ng/mL IL-35和25 μg/mL sCD40L)，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液。

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)：使用RIPA裂解液收集蛋白，通過10% SDS-PAGE進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h后，TBST搖床上清洗3次，每次10 min，加入抗VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素、vWF、NF-κB p65抗體、pNF-κB p65、GAPDH抗體于4 ℃過夜，TBST搖床上清洗3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育1 h后，TBST搖床清洗3次，每次10 min，加入發(fā)光顯影液后使用Bio-Rad凝膠成像儀顯影拍照。

1.2.5 免疫熒光法檢測血小板對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附：使用血小板分離試劑盒分離全血中的血小板，加入終濃度為2 μmol/L DioC(6)染色液標(biāo)記血小板，室溫30 min后離心棄上清，PBS重懸，使其濃度為1×109個/mL，將其與刺激后的HUVECs共培養(yǎng)，2 h后吸棄上清，使用PBS洗除未黏附的血小板后加入適量的Hank’s液，使用熒光顯微鏡拍照，最后加入細(xì)胞裂解液，使用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度。

1.2.6 免疫熒光法檢測外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附：采集健康人外周靜脈血5 mL置于肝素鈉抗凝管，采用聚蔗糖密度梯度離心法分離PBMCs，用PBS將其重懸，加入5 μmoL/L的鈣黃綠素標(biāo)記PBMCs，置于37 ℃孵育1 h后，離心棄上清，PBS重懸使其為2×105/mL，將其與刺激后的HUVECs共培養(yǎng)30 min后，吸棄上清及未黏附的PBMCs，PBS洗滌2次，加入1 mL的Hank’s液，熒光顯微鏡下拍照，最后加入細(xì)胞裂解液，使用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2組外周血清IL-35、sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF濃度的比較

與對照組相比，DVT組IL-35濃度顯著下降(P<0.05)，sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF濃度顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 兩組外周血清IL-35、sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF濃度比較

2.2 3組HUVECs培養(yǎng)上清中VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF水平的比較

與對照組比較，sCD40L組細(xì)胞培養(yǎng)上清VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF水平顯著升高(P<0.05)；與sCD40L組比較，IL-35組VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 3組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF水平比較

2.3 3組HUVECs中VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF蛋白表達(dá)的比較

與對照組比較，sCD40L組HUVECs中VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與sCD40L組比較，IL-35組HUVECs中VCAM-1、 ICAM-1、P-選擇素和vWF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with sCD40L group

2.4 3組HUVECs黏附血小板熒光強(qiáng)度比較

可溶性CD40配體(sCD40L)組熒光強(qiáng)度為(446±115)，顯著高于對照組(221±101)(P<0.05)；IL-35組熒光強(qiáng)度為(373±132)，顯著低于sCD40L組(446±115)(P<0.05)(圖2)。

圖2 3組HUVECs黏附血小板的熒光圖

2.5 3組HUVECs黏附外周血單個核細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較

可溶性CD40配體(sCD40L)組熒光強(qiáng)度為(202±87)，顯著高于對照組(76±13)(P<0.05)；IL-35組熒光強(qiáng)度為(134±75)，顯著低于sCD40L組(202±87)(P<0.05)(圖3)。

圖3 3組HUVECs黏附PBMCs的熒光圖

2.6 3組HUVECs中NF-κBp65及pNF-κBp65蛋白表達(dá)的比較

與對照組比較，sCD40L組HUVECs pNF-κB p65/NF-κB p65吸光度比值顯著升高(P<0.05)；與sCD40L組比較，IL-35組HUVECs pNF-κBp65/NF-κB p65吸光度比值顯著降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with sCD40L group

3 討論

深靜脈血栓形成是動態(tài)變化過程，主要與血流停滯、內(nèi)皮細(xì)胞活化、血液細(xì)胞募集等相關(guān)，其中內(nèi)皮細(xì)胞的活化是DVT形成的中心環(huán)節(jié)。在靜息狀態(tài)下，完整的內(nèi)皮細(xì)胞主要是抗血栓形成，但在病理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活，釋放趨化因子、黏附因子等促進(jìn)血小板、白細(xì)胞等黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，暴露血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜，為凝血系統(tǒng)激活提供了“表面”，促進(jìn)血栓的形成和生長[6]。其中，VACM-1、ICAM-1、P-選擇素主要介導(dǎo)單個核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，血管性血友病因子(vWF)暴露于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面與血小板受體GPIba結(jié)合，將血小板招募至受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞下，是連接血小板和內(nèi)皮下組分的分子橋梁[7]。

可溶性CD40配體(sCD40L)是一種促炎性細(xì)胞因子，主要通過活化的血小板釋放入血液循環(huán)，與內(nèi)皮細(xì)胞CD40受體結(jié)合后活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子、黏附分子等，在炎性反應(yīng)和血栓中發(fā)揮作用[8]。本次研究結(jié)果顯示DVT患者外周血清IL-35濃度顯著降低，sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF的濃度顯著升高，與報道的相似[9]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sCD40L刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF顯著升高，促進(jìn)外周血單個核細(xì)胞和血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，報道表面sCD40L促進(jìn)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用[10]。

IL-35是一種有效的免疫抑制因子，主要由iTr35細(xì)胞和Treg細(xì)胞產(chǎn)生，通過抑制炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)免疫功能，在炎性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病及血栓性疾病中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，IL-35能夠抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-17、IL-12等促炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌IL-10等抑炎性細(xì)胞因子[11]，本研究結(jié)果表明DVT患者外周靜脈血清IL-35水平低于對照組，體外實(shí)驗(yàn)表明IL-35能夠抑制sCD40L誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附因子，抑制血小板和單個核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。報道表明IL-35能夠抑制溶血磷脂酰膽堿誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活化[12]。

此外本研究還檢測了血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示IL-35顯著降低sCD40L誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞pNF-κBp65蛋白表達(dá)。NF-κB通路是sCD40L激活過程中最具特征的信號通路，參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，能調(diào)控大鼠血栓的形成，主要機(jī)制是NF-κB活化后啟動多種炎性介質(zhì)如黏附分子、趨化因子等的釋放，形成炎性反應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)血栓形成[13]。有研究表明，IL-35可通過NF-κB信號途徑抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌[14]，還可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號通路上游調(diào)節(jié)分子線粒體活性氧的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)溶血磷脂酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化[15]。

綜上所述，深靜脈血栓患者外周靜脈血IL-35濃度顯著下降，sCD40L、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素和vWF濃度顯著升高，體外實(shí)驗(yàn)表明IL-35對sCD40L刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過NF-κB信號通路。本次實(shí)驗(yàn)為體外研究，但其在體內(nèi)的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。