許嬌霞，張家新，周 璇，何小龍

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

許嬌霞，張家新，周 璇，等.附睪中非編碼小RNA（sncRNA）的研究進展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2023，44（2）：61-65.

精子在睪丸生成后，經(jīng)附睪頭運輸?shù)礁讲G尾的過程中，發(fā)生了形態(tài)、胞質(zhì)和細胞核的變化，結(jié)構(gòu)不斷完善，最終獲得運動能力和受精能力［1］。精子功能上的轉(zhuǎn)化并不是由其內(nèi)部機制決定的，而是由精子經(jīng)過附睪所遇到的外在因素所致，即附睪微環(huán)境。附睪上皮細胞和精子之間的通訊方式比較特殊，附睪通過主細胞的分泌作用將蛋白、非編碼RNA （ncRNA）選擇性地積聚到細胞外囊泡中，即附睪小體，而后由附睪小體運送至精子［2］，因此，精子在經(jīng)過附睪時會被不斷修飾進而達以成熟［3］。

ncRNA 是一個龐大而又異質(zhì)的RNA 家族，它們沒有被翻譯成蛋白質(zhì)，以RNA 的形式直接發(fā)揮作用，從基因表達調(diào)節(jié)、基因組防御到表觀遺傳［4］。ncRNA 在生物領(lǐng)域的多個方面具有重要作用，如在人類腫瘤、非腫瘤等方面的疾病治療，在動物胚胎發(fā)育、肌肉生長、脂肪沉積、免疫應(yīng)答及皮膚毛囊調(diào)控等領(lǐng)域［5］。可根據(jù)ncRNA 的大小將其分為兩類：>200 nt 的為非編碼的長RNA（lncRNA），lncRNA 對轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、蛋白質(zhì)定位、細胞結(jié)構(gòu)完整性、基因組印記、細胞周期和凋亡等重要的生物學(xué)過程至關(guān)重要［6］；<40 nt 的為非編碼小RNA （sncRNA），sncRNA 通常在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上沉默RNA 來調(diào)控基因的表達。sncRNA 不僅可以建立和調(diào)節(jié)組織自身的基因表達模式，且對于調(diào)節(jié)精子中父系表觀遺傳信息及后代的發(fā)育也有著至關(guān)重要的作用［7］。同時sncRNA 中的微RNA （miRNA）PIWI 蛋白相互作用蛋白（piRNA）、tRNA 源性片段（tRF）及來源于28S rRNA 的新小RNA（rsRNA-28S）在調(diào)控雄性生殖方面作用扮演重要角色。到目前為止，研究最多的是miRNA，它在哺乳動物附睪中起關(guān)鍵調(diào)控作用，可以與內(nèi)分泌信號協(xié)同調(diào)控附睪不同節(jié)段的基因差異表達，且高度保守［8］。此外，最新研究表明，sncRNA對基因表達的調(diào)控作用以及對精子成熟的影響都遠遠超過上皮細胞中的穩(wěn)態(tài)基因［2］。鑒于此，該文將對附睪上皮和精子中sncRNA 的調(diào)控功能展開論述。

1 附睪

附睪是一條長而彎曲的小管，附睪的上皮組織是由不同類型的細胞組成，包括主細胞、基底細胞、亮細胞、暈細胞和頂細胞，主細胞最多，約占整個附睪管上皮細胞的80%。附睪可根據(jù)其節(jié)段分為三部分：頭、體、尾。在附睪頭和附睪體內(nèi)，主細胞具有蛋白質(zhì)合成和分泌的能力。附睪每個區(qū)域的上皮形態(tài)、管腔直徑和管腔環(huán)境都有所不同，這要歸因于特定區(qū)域基因的不同表達。Browne 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，人附睪上的miRNA 可調(diào)控附睪的區(qū)域化基因的表達和功能。此外，在激素的調(diào)節(jié)下，不同發(fā)育階段對附睪的組織結(jié)構(gòu)和基因表達也會產(chǎn)生顯著的影響［10］。這種嚴格把控基因的時空表達特性揭示了附睪中有著嚴格而又多層次的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)涉及轉(zhuǎn)錄因子、sncRNA 和DNA 甲基化。

在睪丸形成但并未成熟的精子進入附睪后，附睪管腔內(nèi)環(huán)境通過直接分泌或附睪小體運輸來介導(dǎo)上皮細胞和精子之間蛋白質(zhì)或RNA 的轉(zhuǎn)移和交換［11］。附睪小體釋放后，與鄰近的上皮細胞相互作用，進行旁分泌調(diào)節(jié)，從而對精子成熟產(chǎn)生間接影響［12］。另外，附睪小體還可以通過向精子傳遞復(fù)雜的蛋白質(zhì)和脂類對精子的成熟產(chǎn)生更直接的影響，這些相互作用涉及選擇性黏附和瞬時融合機制，最終導(dǎo)致精子膜結(jié)構(gòu)和胞質(zhì)的成分發(fā)生顯著變化。大多數(shù)附睪小體中的蛋白在精子通過附睪過程中轉(zhuǎn)移到精子亞細胞或膜結(jié)構(gòu)域，參與受精能力的獲得、運動的調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激的保護［13］。而后Gay 等［14］還使用標(biāo)記硫脲嘧啶滲入法（TU）檢測小鼠附睪上新合成RNA 的轉(zhuǎn)移情況，并通過SLAM-Seq 的方法對新合成的RNA 進行了標(biāo)記和測序，研究結(jié)果進一步證實了sncRNA 就是由附睪上皮產(chǎn)生的附睪小體轉(zhuǎn)移至精子上的［2］。在附睪腔環(huán)境中，附睪小體可將miRNA［11］、tRF［2］及rsRNA-28S 包裹并攜帶，從而介導(dǎo)上皮細胞和精子之間sncRNA 的傳遞作用于精子［11］。

2 附睪中sncRNA 的表達特征

大多數(shù)sncRNA 都是通過調(diào)控靶基因發(fā)揮其功能的。例如miRNA 先是與RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RISC 結(jié)合，然后抑制靶基因mRNA 的翻譯或者切斷堿基配對直接到達3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），從而達到沉默基因的效果。由于miRNA 序列通常不能與靶序列完美互補，因此，每個miRNA 都可能有數(shù)百個靶向mRNA［15］，類似的調(diào)控機制也被證明適用于piRNA 和tRF。

在人類等物種的附睪中應(yīng)用微陣列和高通量測序的方法已經(jīng)鑒定出幾百個miRNA 的復(fù)雜圖譜［10］，其中一些miRNA 顯著富集于附睪或是附睪特有的。在小鼠、大鼠和人附睪組織的所有區(qū)域中有79 個miRNA（約占所有miRNA 的21%）均具有保守性［8］。據(jù)估計在人類和小鼠細胞中，tRF 群體含有150 多個不同序列的tRF，表達量顯著高于在同一組織中大多數(shù)的miRNA。而且tRF 在附睪尾部的成熟精子中大量積累而成為主要的sncRNA 種群，因此，tRF 在男性生殖健康領(lǐng)域至關(guān)重要［16］。而piRNA 在成熟精子的sncRNA 譜中占到17%［17］，這些研究發(fā)現(xiàn)提示sncRNA 可能在維持附睪內(nèi)環(huán)境平衡中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。而且sncRNA 發(fā)揮作用時對mRNA 的互補性要求低，所以每個sncRNA 都可能調(diào)控許多功能上無關(guān)靶基因的表達。

哺乳動物附睪中sncRNA 的表達還具有時空性。例如在小鼠［8］、大鼠［18］、人［9］、馬的上皮細胞中，miRNA 家族表現(xiàn)出一定程度的區(qū)域表達模式。例如在馬的附睪頭、附睪體近端和遠端、附睪尾分別檢測到11 個、6 個、8 個、19 個miRNA，這說明附睪區(qū)域之間的miRNA 譜存在差異［19］。在某些情況下，miRNA 豐度的節(jié)段性變化明顯，例如在小鼠中從附睪頭到附睪尾miR-204-5p 降低了39 倍，miR-196b-5p 升高了45 倍［8］。miR-573 和miR-155 在人的附睪頭大量表達，而在附睪尾miR-1204 和miR-770 大 量 表 達［9］。而 且 附 睪 中 的miRNA 還會隨著年齡的增長而發(fā)生變化，例如人的新生兒附睪中miRNA 的表達最高，隨著生長發(fā)育逐漸降低［10］。Chu 等［7］還對青年小鼠和老年小鼠附睪中的sncRNA 進行了比較，觀察到：隨著年齡的增長，附睪中miRNA 比例下降，tRF 和piRNA比例增加，因此，sncRNA 在附睪不同節(jié)段的差異表達對附睪形成獨特的節(jié)段性微環(huán)境具有重要的調(diào)控作用。

為了觀測小鼠精子從形成到成熟過程中sncRNA 的變化，Chu 等［7］將睪丸中生精細 胞與附睪頭和附睪尾中精子的小RNA 圖譜進行了整合，發(fā)現(xiàn)精子進入附睪后，精子上piRNA 的高比例轉(zhuǎn)變?yōu)閠RF 和rsRNA-28S 的高比例［20］。精子轉(zhuǎn)錄停止的特性，很有可能是這種附睪中sncRNA 含量變化和腔環(huán)境相互作用的結(jié)果。而附睪尾中成熟的精子存在piRNA 的序列，這一發(fā)現(xiàn)揭示了精子在經(jīng)過附睪時，附睪液中的sncRNA 對其進行了修飾［2，20］。最近Hutcheon 等［17］研究發(fā)現(xiàn)piRNA 不同于其他類型的sncRNA，精子尾部上的piRNA并不是從附睪上獲得的，因為附睪上并不存在piRNA，而且附睪小體中所包含的piRNA 也很少，因此，附睪和精子的體外共孵不會使得piRNA 的大量轉(zhuǎn)移［2］。所以附睪小體不太可能解釋附睪尾部成熟精子中piRNA 的積累。鑒于此，引發(fā)了科學(xué)家們的另外一種推測，即精子可能含有piRNA前體轉(zhuǎn)錄物，用于piRNA 的合成［17］。綜上所述，附睪上皮細胞中sncRNAs 的多樣性及其表達水平的時空差異會影響許多潛在的靶基因，這些基因在很大程度上與哺乳動物的生理和病理過程有關(guān)。

3 sncRNA 對附睪上皮功能的影響

在附睪上皮細胞中，miRNA 占總sncRNA 的最大比例，可調(diào)控組織的發(fā)育，還參與了附睪節(jié)段高度區(qū)域化基因表達的建立和維持。例如miR-34和miR-449 可調(diào)控附睪輸出小管中纖毛的分化，一旦將其敲除，纖毛缺失引發(fā)精子凝集、管腔阻塞，最終導(dǎo)致雄性不育［21］。不同物種的附睪中，miRNA 表達的時空性與其靶基因mRNA 的表達呈負相關(guān)［10，18］。在人類附睪中，隨著年齡的增長，附睪中的miRNA 隨著靶向mRNA 的增加而減少［10］。大鼠附睪中的miR-335、miR-29a 和miR-200家 族 表 現(xiàn) 出 與 靶 基 因RASA1、NASP、TCF8 和CTNNB1 相反的時空表達模式［18］，這些miRNA 主要參與對附睪上皮細胞增殖和附睪發(fā)育的調(diào)控。此外，miR-200 家族在成年大鼠附睪頭上比附睪尾上優(yōu)先表達。miR-200 家族還有很多功能，例如細胞的抗凋亡作用和蛋白轉(zhuǎn)運［18］。

附睪中的miRNA 也參與應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控，有研究敲除小鼠附睪頭區(qū)域Dicer1（一種負責(zé)miRNA 成熟的關(guān)鍵酶）后發(fā)現(xiàn)，Dicer1 的局部敲除導(dǎo)致上皮細胞去分化、類固醇激素信號和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失去平衡［22］，Dicer1 還參與β-防御素基因亞群的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些基因是編碼附睪抗菌防御系統(tǒng)的關(guān)鍵元素［23］。Zhang 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，miR-7578 還可以抑制炎癥。除了miRNA，附睪中其他的sncRNA對應(yīng)激反應(yīng)也有一定的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，piRNA 中的PIWI1 和PIWI2 在老年小鼠的附睪中具有很高的表達，通過沉默其附睪頭上抗氧化基因GPX5，促發(fā)氧化應(yīng)激使得piRNA 顯著下降，繼而引起其靶基因表達的升高［25］。此外，還發(fā)現(xiàn)在發(fā)生感染或炎癥時，tRF 和rsRNA-28S 的表達水平也會隨之改變，這些研究結(jié)果表明sncRNA 參與應(yīng)激反應(yīng)［20］。而后續(xù)的研究表明，暴露于多種應(yīng)激環(huán)境下的附睪，其精子和附睪小體的sncRNA 分布也會受到影響［26］。

4 sncRNA 對附睪精子功能的影響

附睪miRNA 除了在上皮細胞中調(diào)節(jié)靶基因表達的原位效應(yīng)外，還可以通過附睪小體釋放到附睪管腔中，然后與其他上皮細胞或精子產(chǎn)生效應(yīng)。附睪中的一些miRNA 還會選擇性地富集在附睪小體上，例如miR-202、miR-204 和miR-1224等［19］。這些附睪小體上攜帶的miRNA 被證明是細胞間的通信介質(zhì)，且參與附睪基因表達的旁分泌調(diào)節(jié)［11］。而當(dāng)這種附睪通過附睪小體向精子轉(zhuǎn)運的過程受到影響時，例如生殖道炎癥，這會影響精子獲得tRF 和rsRNA-28S［20］，同樣很多研究表明，輸精管切除術(shù)后逆轉(zhuǎn)和少精子癥患者，附睪中附睪小體攜帶的sncRNA 不進行傳遞［27］。由此可見，附睪分泌的sncRNA 在醫(yī)學(xué)上也可作為診斷某些雄性生殖疾病的指標(biāo)。

附睪小體攜帶著由附睪合成的sncRNA（包括miRNA、tRF 以及rsRNA-28S）轉(zhuǎn)移至經(jīng)過的精子上，然后精子將這些重要的表觀遺傳信息傳遞給合子，參與早期胚胎的調(diào)控，并對后代的發(fā)育有很大的影響［19］。研究發(fā)現(xiàn)，將附睪頭的精子與卵子結(jié)合后，合子很快死亡，但將附睪尾特定sncRNA 純化后注射到合子內(nèi)，可以避免致死，這一研究進一步強調(diào)了精子在附睪運輸過程中獲得sncRNA 重要的生物學(xué)意義［28］。父本的代謝異常會影響sncRNA 的含量，尤其是精子中tRF，可通過調(diào)節(jié)胚胎早期發(fā)育的代謝基因表達作為補償，從而降低父本的代謝異常給后代帶來的不利影響［29］。男性生殖道的炎癥也會改變成熟精子中的sncRNA，例如tRF 和rsRNA-28S，這可能是一種父本傳遞給后代的免疫表觀遺傳信息［20］。

miRNA 在調(diào)節(jié)精子成熟方面也起到關(guān)鍵的作用。附睪上皮細胞中miRNA 譜在區(qū)域差異性表達，而miRNA 還可通過附睪小體從附睪上皮運輸?shù)骄樱@提示miRNA 不僅參與附睪功能的調(diào)控作用，還可調(diào)控精子的成熟。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)馬附睪尾部的精子多了66 個新獲得的miRNA，例如miR-122、miR-388、miR-128 和miR-376a 等，經(jīng)過預(yù)測它們的靶向途徑對精子成熟都具有影響作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，將雄性小鼠miR-7a2 敲除后，其精子活力低且不育［29］。Ni 等［30］嘗試將人工合成的miRNA模擬物（agomir）注射到成年大鼠的附睪尾中，發(fā)現(xiàn)這會引起一系列分子變化，如附睪中羧酸酯酶CES7 mRNA 和蛋白的表達顯著降低，這些變化導(dǎo)致精子獲能缺陷，從而影響了精子的成熟?；谶@些研究，通過條件性敲除Dicer1 后，機體喪失生育能力［25］，由此可見miRNA 對精子成熟起著至關(guān)重要的作用。

5 結(jié)語

越來越多的研究表明，sncRNA 對于附睪功能和精子在附睪的成熟發(fā)揮著重要作用。這些發(fā)現(xiàn)突出了附睪組織及其管腔中sncRNA 的生物意義，有助于對附睪精子成熟過程、雄性不育有更深入的了解，為提高雄性動物繁殖效率提供依據(jù)。