韓雪林,張 磊,張 娟,李蘇濤,陽(yáng)伏林

(福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福建 福州 350002)

青貯是厭氧條件下的自然發(fā)酵過(guò)程,主要是以飼料作物表面所附著的乳酸菌為主的有益菌利用飼料原料中的養(yǎng)分生長(zhǎng)活動(dòng),產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸,降低青貯內(nèi)環(huán)境pH,抑制有害菌群,從而得到高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值飼料,延長(zhǎng)飼料作物保存時(shí)間。青貯飼料具有高價(jià)值、色香俱全、柔軟可口、保存時(shí)間長(zhǎng)的特性,是反芻動(dòng)物日糧的主要能量來(lái)源。青貯過(guò)程中通常會(huì)加入抗生素、酸化劑、酶制劑等添加劑來(lái)保持或提升飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,為動(dòng)物機(jī)體健康提供保障,規(guī)避飼料變質(zhì)等問(wèn)題。近年來(lái),為響應(yīng)國(guó)家“全面禁抗”的號(hào)召,抗生素及其產(chǎn)品在飼料行業(yè)中逐漸淘汰。益生菌綠色、健康且安全有效,全面禁抗后更是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis, BS)是芽孢桿菌屬的一種,耐高溫且能分泌出抗菌物質(zhì),具有很強(qiáng)的抗菌能力和穩(wěn)定性[1],其能消耗動(dòng)物腸道內(nèi)游離氧,促進(jìn)有益厭氧菌的生長(zhǎng),抑制有害菌群,同時(shí)還能分泌多種消化酶,促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、改善動(dòng)物機(jī)體健康[2-3],其在替代抗生素上具有很大的潛力。BS作為新興起的益生菌添加劑在畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已作為綠色添加劑被廣泛使用。但在青貯飼料方面對(duì)BS的研究較少, Phillip等[4]發(fā)現(xiàn)BS對(duì)體積龐大的作物的需氧穩(wěn)定性有積極影響。表明BS在控制青貯飼料的需氧不穩(wěn)定性方面可成為一種選擇。Lara等[5]發(fā)現(xiàn),接種枯草芽孢桿菌后玉米青貯的有氧穩(wěn)定性提高,霉菌和酵母菌數(shù)量減少。青貯發(fā)酵過(guò)程中,BS能促進(jìn)有益菌活動(dòng),抑制不良菌群的生長(zhǎng),提高青貯成功率及其品質(zhì)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用以及維持動(dòng)物腸道健康和菌群平衡有促進(jìn)作用[6],大大減少了不良因素對(duì)飼料青貯效果及飼料品質(zhì)的影響。劉桂香等[7]在豆粕發(fā)酵飼料中發(fā)現(xiàn)BS能產(chǎn)生蛋白酶等多種水解酶類(lèi)將原料中的纖維和蛋白等生物大分子水解,降低飼料原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量,提升飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。孫林等[8]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)BS發(fā)酵處理后的豆粕其氨基酸與蛋白含量均在增加,同時(shí)不易被消化的物質(zhì)也被分解。禾本科牧草纖維含量高、蛋白含量低且適口性差,極易影響飼料的利用率。BS分泌的纖維素等酶類(lèi)對(duì)其具有很強(qiáng)的降解木質(zhì)纖維素的能力。李立波等[9]發(fā)現(xiàn)BS提高了玉米秸稈的利用率,增加蛋白質(zhì)含量。劉春雪等[10]添加BS的麩皮發(fā)酵處理后其纖維成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量得到降低,蛋白含量得到提高,同時(shí)發(fā)酵飼料中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)及菌群,有效促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)、降低養(yǎng)殖成本。本文主要介紹了枯草芽孢桿菌的特性、作用特點(diǎn),概述了其在青貯飼料中的應(yīng)用,為枯草芽孢桿菌在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 枯草芽孢桿菌

1.1 枯草芽孢桿菌的特性

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis, BS)為好氧型革蘭氏陽(yáng)性菌,廣泛存在于自然界,經(jīng)常能在土壤中分離得到。BS有鞭毛、能運(yùn)動(dòng),無(wú)莢膜,其菌落顏色多為白色或淡黃色,菌落形態(tài)凹凸不平。BS繁殖力強(qiáng),營(yíng)養(yǎng)水平要求低,能產(chǎn)生抗逆芽孢,在惡劣壞境中具有很強(qiáng)的抗逆性,能產(chǎn)生消化酶等多種酶類(lèi)和代謝產(chǎn)物以分解有機(jī)物、參與機(jī)體代謝,是一種不含毒素且不產(chǎn)毒素的安全微生物[11-12]。

1.2 枯草芽孢桿菌在青貯中的作用特點(diǎn)

生產(chǎn)實(shí)踐中,養(yǎng)殖者最關(guān)注的就是飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是否能促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng),BS可以產(chǎn)生纖維素酶等降低纖維含量的細(xì)菌素和酶,其可通過(guò)水解植物細(xì)胞壁增加可溶性糖的釋放,改善青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[13-14]。酵母是青貯飼料有氧降解的主要微生物,并降解飼料中的底物,產(chǎn)生二氧化碳和酸進(jìn)而導(dǎo)致青貯飼料養(yǎng)分的損失[15]。 BS是芽孢桿菌屬中重要生產(chǎn)者之一,其能產(chǎn)生抗真菌或抗細(xì)菌活性的代謝產(chǎn)物,對(duì)許多微生物表現(xiàn)出明顯的拮抗作用,對(duì)細(xì)菌和真菌表現(xiàn)出很高的抗菌性[16],抑制有害菌微生物的生長(zhǎng),防止飼料的發(fā)霉變,提高有氧穩(wěn)定性;乙酸是能夠有效抑制有害微生物生長(zhǎng)提高青貯料有氧穩(wěn)定性的有機(jī)酸,BS可通過(guò)抑制酵母菌的生長(zhǎng)和提高青貯有機(jī)物的消化率,提高青貯飼料中乙酸的含量和好氧穩(wěn)定性[5]。厭氧是保證青貯成功的重要因素。BS發(fā)酵基礎(chǔ)良好[17],且其是好氧型菌種,在青貯發(fā)酵過(guò)程中添加BS能夠消耗青貯發(fā)酵容器中的氧氣,快速達(dá)到一個(gè)厭氧環(huán)境,并能通過(guò)丙酮酸還原乳酸,為乳酸菌發(fā)酵提供有利條件[18-19],BS還能產(chǎn)生淀粉酶等將多糖分解成單糖,為乳酸菌的生長(zhǎng)提供碳源[20],提高青貯成功率。同時(shí),BS能產(chǎn)生抗生素類(lèi)的細(xì)菌素、有機(jī)酸等提高青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、降低青貯料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和pH抑制有害菌的活動(dòng)[21-22],提高青貯料的適口性。

2 枯草芽孢桿菌在青貯飼料中的應(yīng)用

2.1 對(duì)青貯發(fā)酵的影響

作為飼料添加劑,益生菌添加劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)已得到了廣泛的應(yīng)用。添加劑的使用旨在有效的調(diào)控青貯的發(fā)酵進(jìn)程和改善青貯料的發(fā)酵品質(zhì)。BS作為新興起的益生菌,得到了眾多學(xué)者的關(guān)注。有報(bào)道稱(chēng)在青貯過(guò)程中接種BS不改變玉米青貯的化學(xué)特性和損失[23]。BS能夠分泌多種酶及細(xì)菌素如阿魏酸酯酶和α-淀粉酶,在木質(zhì)素和半纖維素酯鍵間起作用,破壞細(xì)胞壁的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),降低飼料中纖維含量,各種酶之間又能相互作用生成一定量的粗蛋白質(zhì),改善青貯飼料品質(zhì)[24]。Lara等[5]在玉米青貯中單獨(dú)添加BS和與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum, LP)聯(lián)合接種發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加BS處理組中中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber, NDF)含量最低。朱佳文等[25-26]在桑葉發(fā)酵中加入BS及其與地衣芽孢桿菌復(fù)合菌后降低了粗纖維、NDF和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber, ADF)含量。BS具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白質(zhì)能力[26],在青貯中添加BS能提高飼料蛋白含量。黃光云等[27]研究表明在桑枝葉青貯中加入BS提高了粗蛋白質(zhì)(Crude protein, CP)含量,纖維含量降低。Shi等[28]報(bào)道在玉米-豆粕固體發(fā)酵中添加BS對(duì)CP的提高有增強(qiáng)作用。有機(jī)酸含量和pH是青貯料發(fā)酵品質(zhì)的評(píng)判指標(biāo),青貯料中高濃度乳酸和低濃度丁酸能快速降低pH,抑制菌群的活動(dòng)[29],提高青貯料品質(zhì)。BS能產(chǎn)生抗菌肽物質(zhì),加速同型發(fā)酵乳酸菌的活動(dòng),乳酸含量增加,改善青貯發(fā)酵,抑制不良細(xì)菌的生長(zhǎng),降低蛋白質(zhì)水解[30]。朱佳文等[25]在桑青貯中添加BS,氨態(tài)氮/總氮的比值顯著降低,青貯料中蛋白質(zhì)的降解能力受到抑制,青貯發(fā)酵品質(zhì)得到改善。BS還可以產(chǎn)生纖維素酶,作用于植物細(xì)胞壁,將其水解增加可溶性糖的釋放,提高乳酸含量,進(jìn)而改善青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[14]。

2.2 對(duì)有氧穩(wěn)定性的影響

好氧穩(wěn)定性被定義為青貯飼料超過(guò)環(huán)境溫度2 ℃所需的時(shí)間[31]。除此之外,pH的評(píng)估以及有害微生物的出現(xiàn)也被用作確定飼料穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)[23]。飼草保存時(shí)間主要與飼料抵抗好氧腐敗菌和抗氧化的能力息息相關(guān),青貯飼料在開(kāi)封飼喂后暴露于空氣中,氧氣的進(jìn)入會(huì)激活酵母菌和霉菌等好氧菌的活動(dòng),青貯飼料溫度升高,乳酸降解,pH升高,有害菌群劇烈活動(dòng)造成青貯料的腐敗變質(zhì),有氧穩(wěn)定性降低[32-33],飼料保存時(shí)間縮短[34]。發(fā)酵后,青貯料中所殘留的可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates, WSC)濃度過(guò)高易引起不良微生物的生長(zhǎng),降低青貯飼料有氧穩(wěn)定性[35]。為使青貯飼料保存良好通常添加不同菌劑迅速降低飼料酸堿度,抑制好氧菌的活性,防止飼料的好氧劣變[36]。BS抗氧性強(qiáng)能產(chǎn)生與其它細(xì)菌有拮抗活性的抗微生物蛋白細(xì)菌素及類(lèi)似細(xì)菌素的代謝物,有抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)繁殖,提高飼料有氧穩(wěn)定性、抑制飼料有氧腐敗的作用[37]。青貯料中pH過(guò)高,不良微生物活動(dòng)未受到抑制,進(jìn)行二次活動(dòng),造成青貯飼料進(jìn)一步pH升高,促進(jìn)不良微生物的生長(zhǎng)[38]。青貯中添加BS有效降低了青貯酸堿度,抑制了有害菌的滋生[39]。酵母菌是影響青貯料有氧穩(wěn)定性的主要有害微生物之一[40],它能降解乳酸,使飼料溫度和pH升高,有害菌大量繁殖,導(dǎo)致青貯飼料的腐敗[41-42]。Borrani等[43]證實(shí)酵母計(jì)數(shù)超過(guò)100.000 UFC/g飼料(5 log10UFC/g)導(dǎo)致玉米青貯飼料穩(wěn)定性低。BS能產(chǎn)生抗真菌生長(zhǎng)的化合物抑制酵母菌和真菌的生長(zhǎng),降低青貯飼料的變質(zhì)程度,增強(qiáng)飼料有氧穩(wěn)定性[44]。Lara等[5]在玉米青貯中進(jìn)行單獨(dú)添加BS及與LP復(fù)合添加處理后發(fā)現(xiàn),青貯96 d后單獨(dú)處理組酵母菌數(shù)量最低,有氧穩(wěn)定性高。Basso等[23]也發(fā)現(xiàn)接種BS的玉米青貯的有氧穩(wěn)定性有所改善。乙酸和丁酸是控制有害微生物的有機(jī)酸,其含量對(duì)飼料有氧穩(wěn)定性有一定的影響,但丁酸過(guò)多表示青貯飼料梭菌污染嚴(yán)重[45-46]。Gandra等[47]在甘蔗青貯發(fā)現(xiàn)BS與布氏乳桿菌(Lactobacillus brucei, LB)聯(lián)合處理比LB處理乙酸含量高,丁酸含量低,其有氧穩(wěn)定性得到有效改善。

2.3 對(duì)青貯中微生物菌群的影響

青貯原料本身具有復(fù)雜的微生物菌群,包括有益菌群和有害菌群。青貯發(fā)酵過(guò)程實(shí)則是有益和有害微生物交替演變的過(guò)程,其變化影響飼料青貯品質(zhì)[48]。微生物菌群與青貯樣本自身[49]、添加劑種類(lèi)[50]、青貯條件等多種因素有關(guān)。青貯中添加外源菌劑能調(diào)控發(fā)酵過(guò)程中的微生物區(qū)系[30],提高乳酸菌等可促進(jìn)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌群的豐富度,相對(duì)降低霉菌、腐敗菌等有害菌群的豐度進(jìn)而得到較好品質(zhì)的青貯飼料,延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間,提升青貯料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。芽孢桿菌通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素和抗菌物質(zhì)等抑制有害微生物的生長(zhǎng),進(jìn)而調(diào)控青貯飼料微生物的組成[51]。BS能產(chǎn)生抗真菌化合物及抗生素類(lèi)物質(zhì),如以肽類(lèi)等為主的抗生素,抑制有害微生物的生長(zhǎng),調(diào)節(jié)青貯飼料中的微生物菌群[52]。Basso等[53]在玉米青貯中接種不同濃度BS后發(fā)現(xiàn),接種5×105cfu/g飼料濃度時(shí)可有效控制微生物的生長(zhǎng),得到較低的酵母數(shù)量,較高的絲狀真菌數(shù)量。Bai等[39]研究發(fā)現(xiàn)接種BS,乳酸菌豐度增加且有效抑制了腸桿菌和沙門(mén)氏菌等不良菌群,降低了青貯飼料微生物多樣性及豐富度。Lara等[5]在玉米青貯中添加BS后酵母菌和霉菌數(shù)量顯著降低。Bonaldi等[53]研究表明在玉米青貯中添加9 log10cfu/kg飼料的BS時(shí)孢子形成菌數(shù)量增多,在青貯60 d時(shí)添加量為8 log10cfu/kg飼料時(shí)乳酸菌數(shù)量最多;所有的BS處理中酵母菌數(shù)量降低。Gandra等[54]在向日葵青貯研究中表明,BS可通過(guò)降低好氧菌和腐敗菌的數(shù)量,增加乳酸菌的數(shù)量提高青貯微生物質(zhì)量。

3 聯(lián)合菌劑在青貯飼料中的應(yīng)用

為取得更好的青貯效果,將不同以及不同類(lèi)型的微生物菌劑混合能取長(zhǎng)補(bǔ)短,互相彌補(bǔ),提高青貯發(fā)酵品質(zhì)及效率[55-57]。趙蕊蕊等[58]在青貯中添加BS復(fù)合菌劑能降低青貯料的NDF、AD、酸性洗滌木質(zhì)素(Acid detergent lignin, ADL)含量以及CP損失,進(jìn)而提高“張雜谷”的青貯品質(zhì)。穆勝龍等[59]甘蔗尾的青貯研究中發(fā)現(xiàn)BS和LP的混合添加,青貯料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性得到很大的提升,尤其是添加比例為1∶2時(shí)效果最顯著。青貯過(guò)程中,微生物的種類(lèi)對(duì)青貯發(fā)酵的影響極大,多種菌劑混合添加更能豐富青貯料的菌群組成,促進(jìn)青貯優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)繁殖,加強(qiáng)優(yōu)勢(shì)菌群的主導(dǎo)作用,更加利于青貯發(fā)酵、提高青貯料品質(zhì)。Bai等[39]研究發(fā)現(xiàn),LB和BS的聯(lián)合接種后青貯苜蓿中乳酸菌豐度得到增加,二者共同促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)。在甘蔗尾青貯中將LP、BS和米曲霉聯(lián)合接種后顯著降低了青貯料的pH和NH3-N濃度,不良菌群的活動(dòng)及蛋白質(zhì)的降解受到抑制,提高了乳酸桿菌屬豐度,同時(shí)降低了畢次酵母屬豐度,保證了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[60]。王鳳林等[61]在玉米秸稈青貯中按1∶1比例添加BS和LP,青貯后玉米秸稈的pH、NDF、ADF和NH3-N含量降低,青貯品質(zhì)優(yōu)良,效果顯著。官武太等[62]使用植物乳桿菌、戊糖片球菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵高梁后,DM和乳酸含量增加,乙酸、NDF和ADF含量降低。Ohyama等[63]報(bào)道稱(chēng),有氧條件下,WSC高,則會(huì)提高青貯飼料的穩(wěn)定性;反之,青貯飼料將會(huì)發(fā)霉變質(zhì)。丙酸抗真菌能力強(qiáng),對(duì)飼料有氧穩(wěn)定性的提高有促進(jìn)作用[64]。劉歡歡等[20]研究表明,在有氧暴露后添加植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌混合菌劑能有效抑制微生物對(duì)WSC的利用,保留更多的WSC含量,且其丙酸含量顯著高于對(duì)照組及商業(yè)添加劑組,有效抑制不良菌群的生長(zhǎng)活動(dòng),提高紫花苜蓿的有氧穩(wěn)性。

4 小結(jié)與展望

BS作為新興起的飼料益生菌添加劑,具有很大的代替抗生素的潛力。在青貯上的應(yīng)用研究較少,特別是在改善青貯料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值機(jī)制、發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物及作用特點(diǎn)值得我們深入探究。近年來(lái),高通量測(cè)序等生物學(xué)信息技術(shù)的不斷發(fā)展和完善為青貯中微生物菌群的研究提供了便利和技術(shù)支撐。今后,對(duì)益生菌添加劑在青貯上的研究應(yīng)不斷地向前推進(jìn):加強(qiáng)菌劑對(duì)青貯作用機(jī)制的研究,特別是復(fù)合劑的聯(lián)合作用機(jī)制,規(guī)避風(fēng)險(xiǎn),推動(dòng)青貯技術(shù)發(fā)展,降低成本、提供安全保障;研究青貯菌劑在青貯過(guò)程中抑制高霉變反應(yīng)、增強(qiáng)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的作用調(diào)控機(jī)制。