陳華秋，陳興友，王光明

（1.西昌市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川西昌 615000；2.西昌市人民醫(yī)院病理科，四川西昌 615000；3.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測中心，云南大理 671000）

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤〔1〕，嚴(yán)重威脅著女性的健康。宮頸癌每年確診病例多達(dá)50 多萬例，死于宮頸癌人數(shù)超過30 萬人〔2〕。據(jù)報(bào)道，近年來宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但仍然是導(dǎo)致發(fā)展中國家婦女癌癥病死的主要原因〔3〕，中國和印度患者數(shù)量占全球?qū)m頸癌患者的三分之一以上〔4〕。宮頸癌的形成是一個長期的過程，在發(fā)展成為浸潤性宮頸癌之前很難被發(fā)現(xiàn)〔5〕。宮頸癌早期及時應(yīng)用手術(shù)治療，病情能得到有效控制，但到了中晚期則只能以放療和化療為主，且治療效果并不理想〔6-7〕。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)〔8〕，根據(jù)其與宮頸癌和癌前病變的關(guān)系，分為高風(fēng)險人乳頭瘤病毒（high riskhuman papilloma virus，HR-HPV）和低風(fēng)險人乳頭瘤病毒（low risk-human papilloma virus，LR-HPV），不同HPV 亞型對宮頸組織損傷不同，宮頸癌的發(fā)生與HR-HPV 感染具有相關(guān)性，LR-HPV 與宮頸細(xì)胞的良性或低級別變化相關(guān)〔9-10〕。宮頸癌是唯一一種可以通過篩查來預(yù)防的惡性腫瘤，近年來，許多發(fā)達(dá)國家宮頸癌的發(fā)病率和病死率得到改善，這都?xì)w功于宮頸癌篩查和HPV 疫苗的普及。與歐洲國家相比，中國人群對HPV 疫苗的認(rèn)識度相對較低〔8〕。研究〔11〕證明，年輕女性接種HPV 疫苗，益處可能比以前了解的還要多。HR-HPV 流行特點(diǎn)在不同的地理位置、經(jīng)濟(jì)水平和種族之間存在較為顯著的差異〔12〕，因此研究四川省涼山地區(qū)的HR-HPV 感染特點(diǎn)，利于有針對性地開發(fā)該地區(qū)的HPV 疫苗，對宮頸癌的有效預(yù)防具有重要意義。本研究對四川省涼山地區(qū)7 445 例女性患者HR-HPV 的感染情況進(jìn)行分析，總結(jié)該地區(qū)女性HR-HPV 感染特點(diǎn)，為該地區(qū)HR-HPV 疫苗的開發(fā)和宮頸癌的預(yù)防提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2018 年11 月14 日至2020年12 月30 日在西昌市人民醫(yī)院體檢中心和婦產(chǎn)科門診就診的7 445 例女性為研究對象，年齡16～86 歲，對各年齡段HR-HPV 感染情況、感染特點(diǎn)和亞型感染分布情況進(jìn)行分析。本研究經(jīng)西昌市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有納入研究者均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集檢查前要求：檢查應(yīng)在非月經(jīng)期，48 h 內(nèi)不應(yīng)有性行為，3 d 內(nèi)不應(yīng)進(jìn)行陰道沖洗或使用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥。樣本采集：使用一次性宮頸細(xì)胞采集器進(jìn)行樣本采集，采樣前用棉拭子拭去宮頸口過多的分泌物，將宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉(zhuǎn)3～4 圈，慢慢取出宮頸刷，將其放入裝有細(xì)胞保存液的無菌樣本管中，在管口處將多余的刷柄折斷，密閉送檢。標(biāo)本保存和運(yùn)送：采集樣本的檢測時限為室溫（20 ℃）放置不超過24 h，4 ℃環(huán)境下放置不超過120 h，-20 ℃環(huán)境下放置不超過7 個月（反復(fù)凍融不超過7 次）；標(biāo)本運(yùn)送采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封運(yùn)輸。

1.3 儀器和試劑熒光定量PCR 儀（SLAN-96P，上海宏石）；高風(fēng)險人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，湖南圣湘生物科技有限公司），該試劑盒用于體外定性檢測女性宮頸脫落上皮細(xì)胞樣本中的15 種HR-HPV 核酸DNA，并鑒別其基因亞型，分別為HPV 16 型、18 型、31 型、33型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、58型、59 型、66 型和68 型。

1.4 檢測原理高風(fēng)險人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒采用核酸釋放劑快速裂解、釋放樣本中HPV 的DNA，采用HPV 中15 種型別的特異性熒光引物及熒光探針，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合Taqman 技術(shù)，分別對HPV 中15 種型別的特異性DNA 片段進(jìn)行分型檢測。整個實(shí)驗(yàn)過程無須單獨(dú)提取樣本中的DNA，只需將樣本洗脫液直接與核酸釋放劑充分混合即可作為PCR 擴(kuò)增模板，可有效避免常規(guī)核酸提取過程中的環(huán)境污染。

1.5 檢測流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，試劑準(zhǔn)備：取出試劑盒中的各個組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫，混勻后備用；取4 種HPV 的PCR 反應(yīng)液n×38 μL 分別與4 份n×2 μL 酶混合液（n=待檢樣本數(shù)+質(zhì)控品數(shù)，本研究中質(zhì)控品為2個），充分混勻制成PCR-混合液，瞬時離心后備用。待測樣本處理：1 mL 樣本瞬時離心后吸取25 μL 至1.5 mL 滅菌離心管中，加入25 μL 核酸釋放劑，充分混勻后作待測樣本備用；將陰性對照和陽性對照分別進(jìn)行稀釋，取對照試劑25 μL 與核酸釋放劑25 μL 混勻待用。加樣：每個PCR 反應(yīng)管中加入上述處理后的待測樣本和稀釋后的陰性對照、陽性對照各10 μL，間隔10 min 以上分別加入40 μL 上述已配制好的4 種PCR-混合液。PCR 擴(kuò)增：將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，選擇熒光檢測通道、設(shè)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行檢測，并分析和判讀檢測結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用［n（%）］表示，使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體情況共有受檢者7 445 例，其中HRHPV 陽性者1 027 例，陽性率為13.79%，HPV 16 型、18 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、58 型、59 型、66 型和68 型均有檢出。

2.2 各年齡段HR-HPV 感染情況在7 445 例受檢者中，以年齡≥61 歲的受檢者HR-HPV 陽性率最高，其次為21～30 歲和51～60 歲的受檢者，年齡≤20 歲的受檢者HR-HPV 陽性率最低，不同年齡段受檢者之間HR-HPV 陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.116，P=0.02＜0.05）。見表1。

表1 各年齡段HR-HPV 感染情況

2.3 單一感染與多重感染情況單一感染者818例（占79.65%），多重感染者209 例（占20.35%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=387.884，P＜0.01），由此可知，目前HPV 感染者中以單一感染情況為主。在多重感染者中，以感染2 個亞型的感染率最高，為15.00%（154/1 027），感染3 個亞型的感染率為4.19%（43/1 027），感染4 個亞型的感染率為0.97%（10/1 027），感染6 個亞型的感染率為0.19%（2/1 027）。

2.4 HR-HPV 亞型感染分布高危型單一感染比例最高的是HPV 52 型，陽性率為20.45%；其次為HPV 16 型，陽性率為8.28%；再次為HPV 53 型，陽性率為7.59%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了感染HPV 52 型與多重感染無關(guān)聯(lián)外（P ＞0.05），其余單個亞型均與多重感染有關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。見表2。

表2 HR-HPV 亞型感染分布（n=1 027）

3 討論

流行病學(xué)研究表明，持續(xù)HR-HPV 感染與發(fā)生高級別的宮頸上皮內(nèi)癌變的風(fēng)險呈正相關(guān)〔2，13〕，陽性者的風(fēng)險是陰性者的100 多倍〔14〕。HPV 的陽性率從非典型鱗狀細(xì)胞增生、低級別鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變、高級別鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變到浸潤性宮頸癌呈上升趨勢〔15〕。四川省涼山地區(qū)關(guān)于HPV 感染的報(bào)道較少，因此，本研究有助于豐富該地區(qū)HPV 感染的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，使該地區(qū)的HPV 篩查和宮頸癌預(yù)防方案更有針對性。

本次研究中，HR-HPV 的陽性率為13.79%，陽性率最高的年齡段為≥61 歲（占22.39%）和21～30歲（占15.86%），陽性率最低的年齡段為≤20 歲（占9.52%）；單一感染者818 例（占79.65%），多重感染者209 例（占20.35%）；單一HR-HPV 感染中陽性率排名前3 的感染亞型分別為HPV 52 型（占20.45%）、16 型（占8.28%）、53 型（占7.59%）。在本研究中，年齡≤20 歲和年齡≥61 歲的病例數(shù)相對較少，不能真實(shí)反映該年齡段HR-HPV 感染的真實(shí)情況，因此，應(yīng)加大四川省涼山地區(qū)這2 個年齡段女性HR-HPV 篩查的宣傳力度。本研究結(jié)果表明，該地區(qū)HR-HPV 仍以單一感染為主，多重感染是否更容易引起宮頸病變以及對病變嚴(yán)重程度的影響仍存在爭議，還有待進(jìn)一步研究。

國內(nèi)外關(guān)于HR-HPV 流行病學(xué)的報(bào)道中，陽性率最高的亞型和年齡段不盡相同。HPV 16 型、18 型是印度陽性率最高的亞型〔16〕，其中印度中央邦阿努普爾區(qū)HPV 16 型檢出率高達(dá)到70.0%，隨著年齡的增長其陽性率顯著下降，排在前兩位的年齡段分別為15～29 歲和30～54 歲，陽性率分別為86.4%和13.3%〔17〕；在墨西哥HR-HPV 陽性率排名前三的亞型分別為HPV 16 型、59 型和66 型，感染的高峰年齡為36～55 歲〔18〕；巴基斯坦最常見的HRHPV 亞型為HPV 16 型、18 型和45 型，HPV 陽性率高達(dá)57.0%，單一型HR-HPV 陽性率高達(dá)25.0%〔19〕。在我國，佛山市最常見的HR-HPV 亞型分別為HPV 16 型、52 型和58 型〔20〕；北京地區(qū)感染陽性率排名前三的HR-HPV 亞型依次為HPV 16 型、52 型和58 型，陽性率最高的年齡段為30～40 歲和45～55歲〔21〕；重慶市HR-HPV 感染陽性率排名前三的亞型分別為HPV 52 型、16 型和58 型，感染的高峰分別在20 歲以下和50 歲以上〔22〕；山西省感染陽性率排名前三的HR-HPV 亞型分別為HPV 16 型、58型和52 型，HR-HPV 的陽性率隨著宮頸細(xì)胞學(xué)的嚴(yán)重程度呈上升趨勢〔23〕；四川省HR-HPV 感染陽性率排名前三的亞型分別為HPV 52 型、58 型和16型〔24〕；全國HR-HPV 感染陽性率排名前三的亞型分別為HPV 52 型、53 型和58 型〔25〕。在本研究中，四川省涼山地區(qū)HPV 流行特點(diǎn)與很多地區(qū)不盡相同，可能與涼山地區(qū)是少數(shù)民族聚居地有關(guān)，本研究還發(fā)現(xiàn)50 歲以上女性的HR-HPV 陽性率很高，分析原因可能與此階段女性處于絕經(jīng)期，其雌性激素水平降低，陰道內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變有關(guān)。

綜上所述，四川省涼山地區(qū)HR-HPV 感染的特殊性可能與該地區(qū)的地理位置和民族差異有關(guān)，本次研究豐富了HR-HPV 感染的流行病學(xué)研究，為該地區(qū)HPV 疫苗的開發(fā)，宮頸癌的預(yù)防提供有價值的數(shù)據(jù)支持。