張 磊，羅 霄，劉明靚，陳葉梓，袁成福，何毓敏，劉朝奇，周永芹

三峽大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 423000

結(jié)直腸癌是消化內(nèi)科疾病中發(fā)病率最高的惡性腫瘤性疾病，近年來(lái)其發(fā)病年齡越來(lái)越趨于年輕化，且發(fā)病率逐年穩(wěn)步上升，且發(fā)現(xiàn)晚[1]。慢性炎癥已被公認(rèn)為多種癌癥的重要危險(xiǎn)因素，癌變發(fā)生的各個(gè)階段都受到炎癥反應(yīng)的影響，腸道炎癥是已知的結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素，炎癥過(guò)程在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起著重要的作用，且患有結(jié)腸炎的患者患上結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高[2-4]。腸道組織中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是組織穩(wěn)態(tài)和炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）在結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮中介作用[5]。炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌（colitis associated cancer，CAC）是與炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）相關(guān)的結(jié)直腸癌亞型，由長(zhǎng)期反復(fù)的腸道炎癥所引起[6-7]。

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）模型是一種可重復(fù)性高且相對(duì)便宜的CAC 動(dòng)物模型。AOM 是一種致癌物，它可以通過(guò)細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）以及同工酶CYP2E1 代謝，轉(zhuǎn)化為甲基苯丙醇，這是一種高活性的烷基化物種，可誘導(dǎo)DNA 產(chǎn)生O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤化合物導(dǎo)致G→A 轉(zhuǎn)變[8]，在排入膽汁后，可被結(jié)腸上皮細(xì)胞所吸收并誘發(fā)DNA 損傷。DSS 是一種類似肝素的多糖，可對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞造成損傷，并誘發(fā)結(jié)腸炎，從而模仿IBD的病理特征[9]。AOM/DSS 模型的主要特點(diǎn)是造模時(shí)間短和對(duì)CAC 的精確建模，腫瘤的發(fā)展可以在短至10 周內(nèi)發(fā)生。此外，AOM/DSS 誘導(dǎo)的腫瘤組織病理學(xué)能很好地模擬人類CAC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如遠(yuǎn)端腫瘤及浸潤(rùn)性腺癌[10-13]。

近年的研究表明中醫(yī)藥干預(yù)結(jié)直腸癌具有一定的效果，也有越來(lái)越多的中草藥應(yīng)用于結(jié)直腸癌的研究。槲皮素和表兒茶素為常見(jiàn)的類黃酮，二者具有結(jié)構(gòu)相似性，存在多種中藥中，具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤功效。文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素和表兒茶素聯(lián)用有很好的協(xié)同抗氧化、抗炎等作用[14-17]。本研究旨在通過(guò)研究槲皮素和表兒茶素協(xié)同作用及機(jī)制，以期為臨床結(jié)直腸患者的用藥及治療提供新方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2017-0012，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核編號(hào)2019010T。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，溫度及濕度適宜，光照條件正常，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥品與試劑

槲皮素（批號(hào) PCS-220201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.44%）、表兒茶素（批號(hào)PCS0077，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.94%）購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；AOM（批號(hào)0218397180）、DSS（批號(hào)0216011090）購(gòu)自廣州威佳科技有限公司；磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）抗體（批號(hào)WLP2412）、IL-6 抗體（批號(hào)WL02841）購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；β-actin（批號(hào)AC026）購(gòu)自Abclonal 公司；羊抗鼠IgG 二抗（批號(hào)115-035-003）購(gòu)自Jackson Immunoresearch；羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)152203）購(gòu)自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；Trizol、RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；PCR 引物由上海生物工程（武漢）股份有限公司合成；RIPA 裂解緩沖液（批號(hào)G2002）、ECL 化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)G2014-50ML）購(gòu)自Servicebio 公司；蛋白定量試劑盒（批號(hào)G2026-200T）、蛋白上樣緩沖液購(gòu)自Solarbio 公司（批號(hào)P1040）；PVDF 膜（批號(hào)R9SA26534）購(gòu)自MilliPore 公司。

1.3 儀器

ChemiScope series 型全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）；1658001 型垂直式蛋白電泳儀器、1703935 型蛋白轉(zhuǎn)印儀器（美國(guó)Bio-Rad公司）；Biometra TOne 96G 型PCR 儀（德國(guó)Analytik JenaAG 公司）；qTOWER3G 型qRT-PCR 儀（德國(guó)Analytik JenaAG 公司）。DYCP-31DN 型水平電泳槽（北京六一儀器廠）；CR21GII型高速離心機(jī)（日本日立公司）；TS100-F 型顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 CAC 小鼠模型的建立、分組及給藥

50 只SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、槲皮素（35 mg/kg）組、表兒茶素（40 mg/kg）組和槲皮素（35 mg/kg）聯(lián)合表兒茶素（40 mg/kg）組，每組10 只。對(duì)照組ip 生理鹽水，其余各組小鼠ip AOM（12.5 mg/kg），給予普通飲食飲水5 d 后，給予2.5% DSS 飲用5 d，然后給予普通飲食飲水2周。接下來(lái)再重復(fù)2 次2.5% DSS 飲水，然后普通飲食飲水喂養(yǎng)至93 d。第1 輪2.5% DSS 飲用結(jié)束即第12 天，各給藥組開(kāi)始ig 相應(yīng)藥物，對(duì)照組ig等體積生理鹽水，直到整個(gè)周期結(jié)束。

2.2 結(jié)直腸形態(tài)學(xué)觀察

造模結(jié)束后，用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖小鼠，先找到闌尾位置，根據(jù)盲腸位置取出全部結(jié)直腸組織，用生理鹽水清洗干凈腸腔的殘留物，縱形剖開(kāi)部分結(jié)直腸，觀察腫瘤浸潤(rùn)情況，將其放于白色背景下直尺旁拍照。

2.3 結(jié)直腸組織蘇木素-伊紅（HE）染色

取各組小鼠結(jié)直腸組織，于4%多聚甲醛中固定，脫水后包埋于石蠟中，切片，進(jìn)行HE 染色，于顯微鏡下觀察組織病理變化。

2.4 結(jié)直腸組織總RNA 提取以及qRT-PCR 檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取結(jié)直腸組織中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物序列見(jiàn)表1，將U6作為miR-124-3P內(nèi)參，將β-actin 作為T(mén)oll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、IL-1β、IL-17、IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和c-myc內(nèi)參。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.5 Western blotting 檢測(cè)結(jié)直腸組織p-STAT3 和IL-6 蛋白表達(dá)

取各組小鼠結(jié)直腸組織，剪碎后，加入裂解液勻漿提取蛋白，采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液混勻后，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入p-STAT3 抗體（1∶1000）、IL-6 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶10 000），4 ℃孵育過(guò)夜；次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入二抗（1∶8000），孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min，使用化學(xué)發(fā)光劑顯影進(jìn)行曝光，以β-actin 作為內(nèi)參，應(yīng)用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

通過(guò)TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.targetscan.org/vert_72/）查找miR-124-3p的靶基因，預(yù)測(cè)miR-124-3p與靶基因IL-6的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系[18]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 和GraPhPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖1-A所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)直腸縱面可看出具有大量腫瘤浸潤(rùn)；與模型組比較，單獨(dú)給藥組小鼠結(jié)腸縱形剖面腫瘤浸潤(rùn)個(gè)數(shù)減少，聯(lián)合給藥組結(jié)腸無(wú)腫瘤浸潤(rùn)。如圖1-B所示，與對(duì)照組比較，模型組腫瘤數(shù)量明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組腫瘤數(shù)量均顯著減少（P＜0.01、0.001）。如圖1-C所示，各給藥組小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織形態(tài)(A)、腫瘤數(shù)量(B)和結(jié)腸長(zhǎng)度(C)的影響(±s,n = 10)Fig.1 Effects of quercetin combined with epicatechin on colorectal tissue morphology(A),tumor number(B)and colon length(C)in CAC mice model(±s,n = 10)

3.2 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織病理變化的影響

如圖2所示，對(duì)照組小鼠腸道黏膜平整，各層組織分界清楚，結(jié)構(gòu)規(guī)則，黏膜隱窩結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞；模型組小鼠結(jié)直腸組織結(jié)構(gòu)不規(guī)則，沒(méi)有正常的結(jié)構(gòu)分層，有大量異形細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核變大，核深染，腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，杯狀細(xì)胞減少甚至消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；各給藥組結(jié)直腸異形細(xì)胞少量浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞較模型組少，腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整。

圖2 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織病理變化的影響Fig.2 Effects of quercetin combined with epicatechin on pathological changes of colorectal tissue in CAC mice model

3.3 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)直腸組織中TLR4、IL-1β、IL-17、IL-6的mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組IL-1β和IL-17的mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），聯(lián)合給藥組和表兒茶素組TLR4、IL-1β、IL-17、IL-6的mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），且聯(lián)合給藥組較單獨(dú)給藥組作用更為顯著。

圖3 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織TLR4、IL-1β、IL-6 和IL-17 mRNA 表達(dá)的影響(±s,n = 10)Fig.3 Effects of quercetin combined with epicatechin on TLR4,IL-1β,IL-6 and IL-17 mRNA expressions in colorectal tissue of CAC mice model(±s,n = 10)

3.4 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)直腸組織中VEGF和c-myc的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組、聯(lián)合給藥組和表兒茶素組c-myc的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），聯(lián)合給藥組和表兒茶素組VEGF的mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），且聯(lián)合給藥組較單獨(dú)給藥組作用更為顯著。

圖4 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織VEGF 和c-myc mRNA 表達(dá)的影響(±s,n = 10)Fig.4 Effects of quercetin combined with epicatechin on VEGF and c-myc mRNA expressions in colorectal tissue of CAC mice model(±s,n = 10)

3.5 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織miR-124-3p/IL-6信號(hào)通路的調(diào)控作用

為了探究槲皮素和表兒茶素防治CAC 的協(xié)同作用是否與結(jié)腸組織中miR-124-3p表達(dá)相關(guān)，通過(guò)生物學(xué)信息預(yù)測(cè)miR-124-3p的靶基因，預(yù)測(cè)的結(jié)果提示miR-124-3p可以靶向IL-6的3’-UTR，靶向序列見(jiàn)圖5-A。采用qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)直腸組織中miR-124-3p的表達(dá)，如圖5-B所示，與對(duì)照組比較，模型組miR-124-3p的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組miR-124-3p的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。采用Western blotting 檢測(cè)結(jié)直腸組織中IL-6 和p-STAT3 蛋白表達(dá)，如圖5-C所示，與對(duì)照組比較，模型組IL-6 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組IL-6蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），聯(lián)合給藥組p-STAT3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且聯(lián)合給藥組較單獨(dú)給藥組作用更為顯著。

圖5 槲皮素聯(lián)合表兒茶素對(duì)CAC 小鼠模型結(jié)直腸組織中miR-124-3p/IL-6信號(hào)通路的調(diào)控作用Fig.5 Regulation of quercetin combined with epicatechin on miR-124-3p/IL-6 signaling pathway in colorectal tissue of CAC mice model

4 討論

IBD 與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IBD 患者比正常人群高出2～3 倍的風(fēng)險(xiǎn)患結(jié)直腸癌，CAC是由長(zhǎng)期腸道炎癥引起的一種常見(jiàn)結(jié)直腸癌，促炎因子和炎性細(xì)胞因子可促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展[19-20]。AOM是一種化學(xué)致癌物，AOM 和DSS 的聯(lián)合作用可誘導(dǎo)炎癥和結(jié)腸腫瘤的發(fā)生，本研究表明，腫瘤相關(guān)標(biāo)志物VEGF、c-myc在AOM/DSS 誘導(dǎo)的CAC 模型小鼠結(jié)直腸組織中表達(dá)明顯升高，提示CAC 模型小鼠腸道已經(jīng)發(fā)生了癌變，而單獨(dú)給藥組和聯(lián)合給藥組結(jié)直腸組織中腫瘤相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)較模型組顯著降低，且聯(lián)合給藥組腫瘤標(biāo)志物降低程度明顯低于單獨(dú)給藥組。表明槲皮素和表兒茶素協(xié)同作用可以抑制結(jié)直腸腫瘤的形成。為了評(píng)估腸道炎癥反應(yīng)在癌變過(guò)程中的作用，進(jìn)一步檢測(cè)炎癥相關(guān)基因TLR4、IL-1β、IL-17的mRNA 表達(dá)水平，以明確槲皮素及表兒茶素的抗腫瘤作用是否與其抑制結(jié)直腸道炎癥相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CAC模型小鼠腸道炎癥相關(guān)因子表達(dá)增加；與模型組比較，各給藥組炎癥因子表達(dá)明顯減少，且聯(lián)合給藥組炎癥因子低于單獨(dú)給藥組。表明槲皮素及表兒茶素可以抑制結(jié)直腸道的炎癥反應(yīng)。

IL-6 在結(jié)直腸癌的腸上皮細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，在慢性炎癥發(fā)展為腫瘤疾病的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，可通過(guò)作用于下游STAT3 途徑參與調(diào)控結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移[21-23]。IL-6 能直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)下游STAT3 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤增殖或存活，STAT3 還可以誘導(dǎo)促進(jìn)血管生成因子的表達(dá)，造成腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及免疫抑制[24-25]。miRNA 可以通過(guò)特異性mRNA 結(jié)合來(lái)沉默特異性mRNA，誘導(dǎo)翻譯抑制。研究表明，miRNA 在不同類型的癌癥中充當(dāng)抑制腫瘤因子，具有成為癌癥的生物標(biāo)志物以及化療靶標(biāo)的潛在用途[26]。miR-124-3p被作為胃癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌等腫瘤發(fā)生進(jìn)展的腫瘤抑制因子[27]。研究表明，miR-124-3p通過(guò)靶向IL-4Rα 緩解過(guò)敏性鼻炎中的炎癥反應(yīng)[28]。本研究通過(guò)生物學(xué)信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測(cè)，IL-6為miR-124-3p的靶基因，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸組織中miR-124-3p、IL-6 和p-STAT3 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，模型組IL-6、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平明顯增加，miR-124-3pmRNA 表達(dá)水平明顯降低；與模型組比較，各給藥組IL-6、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平明顯降低，miR-124-3pmRNA 表達(dá)水平明顯升高，且聯(lián)合給藥組較單獨(dú)給藥組作用更為顯著。提示槲皮素和表兒茶素協(xié)同作用可能通過(guò)上調(diào)miR-124-3p表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)直腸組織中IL-6 和p-STAT3 的表達(dá)，抑制結(jié)直腸黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減少結(jié)直腸道炎癥反應(yīng)，抑制CAC小鼠的疾病進(jìn)程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突