倪建成，范永飛，2，王澤榕，3，阮少江，陳美霞，3，葉祖云*

(1.福建省特色藥用植物工程技術(shù)研究中心/寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建寧德 352100；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福建福州 350002)

太子參(Pseudostellariaheterophylla)為石竹科孩兒參屬草本藥用植物，以其肉質(zhì)根入藥，富含多糖、環(huán)肽、生物堿和皂苷等功能成分，具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1-3]。與人參相比，太子參藥性平緩，更加適合兒童、老人和體弱多病者，常用于健胃消食的制劑處方中，如“江中牌健胃消食片”和“太子參復(fù)方顆?！盵4]。福建省柘榮縣從20世紀(jì)60年代末開始引種太子參，種植面積逐年擴(kuò)大，全縣90%的農(nóng)戶都在從事太子參種植或與其相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)業(yè)，太子參產(chǎn)業(yè)成為當(dāng)?shù)孛撠氈赂坏闹еa(chǎn)業(yè)。

由于太子參主要通過種根繁殖，隨著種植年限增加，連作障礙凸顯，危害太子參的真菌病害頻發(fā)，其中葉斑病對太子參葉片危害尤為顯著，嚴(yán)重影響太子參的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約太子參產(chǎn)業(yè)發(fā)展。已報(bào)道的引起太子參葉斑病的病原菌主要有莖點(diǎn)霉屬(Phoma)真菌[5]、殼針孢屬(Septoria)真菌[6]、斑點(diǎn)葉點(diǎn)霉(Phyllostictacommonsii)[7]、殼二孢(Ascochytaversabilis)[8-9]等，這些研究主要集中在病原菌的發(fā)病規(guī)律、分類鑒定和藥劑防治方面，而關(guān)于病原菌代謝產(chǎn)生的真菌毒素鮮有報(bào)道。前期從福建柘榮的太子參葉斑病葉中分離篩選獲得的一株莖點(diǎn)霉菌Phomasp.FJZR01，該研究對其固體發(fā)酵物的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)合生物活性確定該菌代謝產(chǎn)生的致病毒素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑超凈工作臺SW-CJ-2D(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；高壓滅菌鍋GR60DA(美國致微Zealway)；光照培養(yǎng)箱MGC-100(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；多功能超純水系統(tǒng)Unique-S20(廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-100(瑞士Buchi公司)；核磁共振儀Bruker 400 MHz(瑞士Bruker公司)；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀Agilent 1290 infinity Ⅱ/6470(美國安捷倫科技公司)；顯微熔點(diǎn)儀SGW X-4B(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)；RP-C18(50 μm，加拿大Silicycle公司)；Sephadex LH-20(50～150 μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司)；硅膠H板、200 ～ 300目柱色譜硅膠、薄層層析硅膠(青島海洋化工有限公司)。正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、冰乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；顯色劑5% H2SO4-乙醇溶液(實(shí)驗(yàn)室配制)。

1.2 試材太子參葉斑病病葉采自福建柘榮(標(biāo)本編號TZS1705)。菌株從太子參病葉分離得到，經(jīng)形態(tài)和ITS rDNA鑒定為莖點(diǎn)霉屬Phomasp.(菌株編號為FJZR01)，該菌株保藏于福建省特色藥用植物工程技術(shù)研究中心。

1.3 葉斑病菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)菌株FJZR01采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板發(fā)酵。培養(yǎng)基配制：馬鈴薯200 g，去皮、切成小塊，水煮開0.5 h后，用紗布過濾，濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，用純水定容至1 000 mL，pH自然，共配制5 000 mL PDA培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min。倒平板：將加熱融化的培養(yǎng)基放置于超凈工作臺中，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，將培養(yǎng)基倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每皿含培養(yǎng)基20～25 mL。接種：將預(yù)先活化好的致病菌用無菌打孔器制成直徑5 mm的菌餅接種于培養(yǎng)基中央，用封口膜包封培養(yǎng)皿，標(biāo)記上菌株名稱和接種日期，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，25 ℃倒置培養(yǎng)40 d。

1.4 發(fā)酵物提取與分離純化

1.4.1發(fā)酵物提取。挑選發(fā)酵好的平板約220皿，將發(fā)酵菌體連同培養(yǎng)基攪碎并用乙酸乙酯浸提，收集過濾后的浸提液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃減壓濃縮，并回收溶劑用于重復(fù)浸提，共提取4次，得到乙酸乙酯提取浸膏(11.9 g)，將該浸膏用甲醇溶解過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮，獲得甲醇提取浸膏(6.6 g)。

1.4.2發(fā)酵物分離純化。將甲醇提取浸膏(6.6 g)用甲醇溶解后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，通過薄層色譜檢識合并相近組分，減壓濃縮得到5個(gè)組分(Fr.1～Fr.5)。組分Fr.2(2.9 g)經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物6(100.0 mg)，母液經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，薄層色譜檢測合并得到4個(gè)組分(Fr.2-1～Fr.2-4)。Fr.2-2(1.8 g)上RP-18柱，使用甲醇-水體系(體積比0∶100、15∶85、30∶70、45∶55、60∶40、80∶20、100∶0)洗脫得到8個(gè)亞組分(Fr.2-2-1～Fr.2-2-8)，F(xiàn)r.2-2-6(208.6 mg)經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物5(160.6 mg)；Fr.2-4(18.1 mg)經(jīng)硅膠柱層析，用正己烷-丙酮(9∶1)體系洗脫得到化合物2(8.0 mg)。組分Fr.4(535.6 mg)用純水溶解后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，通過薄層色譜檢識合并相近組分，獲得5個(gè)組分(Fr.4-1～Fr.4-5)，F(xiàn)r.4-5(7.2 mg)經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物4(5.2 mg)。組分Fr.5(825.9 mg)用純水溶解后經(jīng)RP-18柱層析，甲醇-水體系(體積比0∶100、15∶85、30∶70、45∶55、60∶40、80∶20、100∶0)洗脫得到11個(gè)組分(Fr.5-1～Fr.5-11)。Fr.5-8(46.5 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，經(jīng)檢測合并得到2個(gè)亞組分(Fr.5-8-1～Fr.5-8-2)，F(xiàn)r.5-8-1(28.2 mg)過硅膠柱，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物1(21.8 mg)；Fr.5-10(35.2 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，再過硅膠柱，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物3(13.9 mg)。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物對太子參葉片毒害作用測定參照文獻(xiàn)[10-11]中的葉片穿刺法?；衔镉蒙倭考状既芙?，并用蒸餾水分別配制0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL 4個(gè)樣品濃度待測液，甲醇的終濃度為5%(甲醇/水=5/95，v/v)；配制5%甲醇水溶液為對照溶液。選取健康的6～8葉齡太子參植株上方的嫩葉，用無菌注射器的針頭在葉片左半葉的表皮層刮刺一道約2 mm的傷口，確保沒有刺破葉片，用微量移液器吸取20 μL的樣品溶液滴加在傷口處，作為樣品處理組；用無菌注射器的針頭在葉片右半葉的表皮層刮刺一道約2 mm的傷口，用微量移液器吸取20 μL的5%甲醇水溶液滴加在傷口處，作為空白對照組。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在室內(nèi)25 ℃室溫下培養(yǎng)觀察，記錄病斑產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

從菌株FJZR01固體發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分離得到6個(gè)化合物，采用現(xiàn)代波譜技術(shù)分析結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對確定這些化合物的結(jié)構(gòu)(圖1)，分別為3-氯-4-羥基苯乙酸(1)、3-氯-4-羥基苯乙酰胺(2)、flemingipanic acid(3)、腺苷(4)、乙基α-D-吡喃葡萄糖苷(5)、甘露醇(6)，化合物1～6均是首次從太子參葉斑病菌中報(bào)道，化合物3系首次從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到。

圖1 化合物1～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1化合物1。結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)108～110 ℃，ESI-MSm/z：185[M-H]-，分子式C8H7ClO3。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7)，6.99(1H，dd，J=8.3，2.2 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，3.46(2H，s，H-7)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：175.7(C-8)，153.2(C-4)，131.7(C-2)，129.9(C-6)，128.3(C-1)，121.4(C-3)，117.4(C-5)，40.7(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]的報(bào)道基本一致，故鑒定為3-氯-4-羥基苯乙酸(3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid)。

2.1.2化合物2。白色針尖，熔點(diǎn)160～162 ℃，ESI-MSm/z：186[M + H]+，分子式C8H8ClNO2。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.22(1H，d，J=2.2 Hz，H-7)，7.02(1H，dd，J=8.3，2.2 Hz，H-6)，6.83(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，3.37(2H，s，H-7)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：176.9(C-8)，153.3(C-4)，131.5(C-2)，129.7(C-6)，129.0(C-1)，121.5(C-3)，117.6(C-5)，42.1(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]的報(bào)道基本一致，故鑒定為3-氯-4-羥基苯乙酰胺(3-chloro-4-hydroxyphenylacetamide)。

2.1.3化合物3。棕色粉末，ESI-MSm/z：195 [M-H]-，分子式C10H12O4。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.17(1H，dd，J=8.2，7.5 Hz，H-4)，6.71(1H，dd，J=8.2，1.2 Hz，H-3)，6.66(1H，dd，J=7.5，1.2 Hz，H-5)，4.01(1H，m，H-2′)，3.37(1H，dd，J=12.6，7.5 Hz，H-1′a)，3.02(1H，dd，J=12.6，5.0 Hz，H-1′b)，1.20(3H，d，J=6.2 Hz，H-3′)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：178.8(COOH)，162.7(C-2)，143.3(C-6)，132.5(C-4)，123.7(C-5)，119.5(C-1)，115.9(C-3)，70.9(C-2′)，44.6(C-1′)，23.9(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13-14]的報(bào)道基本一致，故鑒定為flemingipanic acid。

2.1.4化合物4。白色粉末，熔點(diǎn)234～236 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.36(1H，s，H-2)，8.14(1H，s，H-8)，7.36(2H，s，NH2)，5.88(1H，d，J=6.2 Hz，H-1′)，5.46(1H，d，J=6.3 Hz，2′-OH)，5.45(1H，dd，J=7.3，4.5 Hz，5′-OH)，5.21(1H，d，J=4.5 Hz，3′-OH)，4.62(1H，td，J=6.2，4.9 Hz，H-2′)，4.15(1H，td，J=4.9，2.9 Hz，H-3′)，3.97(1H，q，J=3.4 Hz，H-4′)，3.68(1H，dt，J=12.2，4.5 Hz，H-5′a)，3.55(1H，ddd，J=12.2，7.3，3.4 Hz，H-5′b)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.2(C-6)，152.4(C-2)，149.1(C-4)，140.0(C-8)，119.4(C-5)，87.9(C-1′)，85.9(C-4′)，73.4(C-2′)，70.7(C-3′)，61.7(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]的報(bào)道基本一致，故鑒定為腺苷(adenosine)。

2.1.5化合物5。無色黏稠，易吸濕。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：4.77(1H，d，J=3.8 Hz，H-1′)，3.78(2H，m，H-6′a，1a)，3.65(1H，dd，J=11.8，5.6 Hz，H-6′b)，3.63(1H，t，J=8.9 Hz，H-3′)，3.56(1H，ddd，J=10.0，5.6，2.3 Hz，H-5′)，3.49(1H，dq，J=9.8，7.1 Hz，H-1b)，3.37(1H，dd，J=9.7，3.8 Hz，H-2′)，3.27(1H，dd，J=10.0，8.9 Hz，H-4′)，1.23(3H，t，J=7.1 Hz，H3-2)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：99.8(C-1′)，75.1(C-3′)，73.6(C-2′)，73.5(C-5′)，71.8(C-4′)，64.4(C-1)，62.7(C-6′)，15.3(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]的報(bào)道基本一致，故鑒定為乙基α-D-吡喃葡萄糖苷(ethyl α-D-glucopyranoside)。

2.1.6化合物6。白色針尖，熔點(diǎn)166～168 ℃，ESI-MSm/z：181[M-H]-，分子式C6H14O6。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.42(2H，d，J=5.5 Hz，OH-2，5)，4.34(2H，t，J=5.7 Hz，OH-1，6)，4.14(2H，d，J=7.1 Hz，OH-3，4)，3.60(2H，ddd，J=10.7，5.8，3.3 Hz，H-2，5)，3.53(2H，t，J=7.2 Hz，H-3，4)，3.44(2H，dtd，J=8.6，5.7，3.3 Hz，H-1a，6a)，3.37(2H，m，H-1b，6b)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：71.3(C-2，5)，69.7(C-3，4)，63.9(C-1，6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]的報(bào)道基本一致，故鑒定為甘露醇(mannitol)。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物致病活性測定采用葉片穿刺法測定化合物1～6對太子參葉片的毒害活性，測定結(jié)果見表1。由表1可知，化合物1(3-氯-4-羥基苯乙酸)在濃度高于0.250 mg/mL時(shí)，能使太子參葉片造成不同程度損傷，產(chǎn)生壞死性病斑；當(dāng)濃度達(dá)到1.000 mg/mL時(shí)，病斑癥狀顯著，病斑直徑大于3 mm。化合物2(3-氯-4-羥基苯乙酰胺)只有在濃度達(dá)到1.000 mg/mL時(shí)才表現(xiàn)出較弱的致病癥狀，而化合物3～6在供試濃度下均未對太子參葉片產(chǎn)生毒害作用。

表1 化合物對太子參葉片毒害活性Table 1 Toxic activity of compounds on Pseudostellaria heterophylla leaves

從圖2A可觀察到，在田間種植的太子參，葉斑病發(fā)病中期的病斑呈灰白色壞死狀，病斑上有黑褐色的分生孢子器，散生，輪紋狀排布。3-氯-4-羥基苯乙酸處理葉片1 d時(shí)，在樣品處理部位周邊產(chǎn)生了明顯的半透明壞死的葉斑毒害癥狀(圖2B)，而空白對照處理未出現(xiàn)明顯毒害癥狀。隨著時(shí)間增加，7 d時(shí)，3-氯-4-羥基苯乙酸處理部位周邊呈組織壞死、干枯、發(fā)白、葉斑周圍皺縮等癥狀(圖2C)，該癥狀與田間葉斑病菌對太子參葉片毒害作用相似。綜上觀察分析可以確定3-氯-4-羥基苯乙酸是葉斑病菌Phomasp.FJZR01產(chǎn)生的主要致病毒素。

3 討論與結(jié)論

莖點(diǎn)霉屬真菌多數(shù)是植物病原真菌或內(nèi)生真菌，所產(chǎn)生的致病毒素能造成農(nóng)作物的莖腐、枝枯、葉片和果實(shí)壞死等病害，前人從該屬病原菌中報(bào)道過phomozin[18]、6-methylsalicylic acid[19]、herbarumins I～Ⅲ[20]、maculansin A[21]等不同結(jié)構(gòu)類型的致病毒素。

該研究從一株太子參莖點(diǎn)霉葉斑病菌Phomasp.FJZR01的固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到6個(gè)單體化合物，均是首次從該菌中分離得到。其中，化合物1(3-氯-4-羥基苯乙酸)在1.000 mg/mL劑量下對太子參葉片有明顯毒害作用，產(chǎn)生的葉斑與田間葉斑病菌活體致病癥狀相似，因而確定3-氯-4-羥基苯乙酸為菌株P(guān)homasp.FJZR01的主要致病毒素。從結(jié)構(gòu)上看，3-氯-4-羥基苯乙酸和化合物2(3-氯-4-羥基苯乙酰胺)結(jié)構(gòu)相近，母核苯環(huán)3C位上連有氯原子，差異主要是支鏈8C位分別以羧基和酰胺基團(tuán)存在，結(jié)合活性測定結(jié)果表明，8C位羧基對致病性起到關(guān)鍵作用?；衔?和化合物2早先從炭角菌Xylariasp.中分離報(bào)道[12]，Kumar等[22]以化合物1作為先導(dǎo)分子合成系列衍生物用于抗前列腺癌細(xì)胞和抗寄生活性篩選測試，但鮮見關(guān)于植物致病性相關(guān)報(bào)道，因此，化合物1(3-氯-4-羥基苯乙酸)是一種真菌代謝產(chǎn)生的新型真菌毒素。后續(xù)可開展該致病毒素對太子參葉片的細(xì)胞質(zhì)膜、線粒體、葉綠體及防御酶體系和酚代謝體系等的影響，進(jìn)一步闡明其致病機(jī)制。

注：B.1.000 mg/mL 3-氯-4-羥基苯乙酸處理葉片1 d時(shí)表現(xiàn)的癥狀；C.1.000 mg/mL 3-氯-4-羥基苯乙酸處理葉片7 d時(shí)表現(xiàn)的癥狀；“--→”表示空白對照；“”表示樣品處理。Note：B.Symptoms of leaves treated with 1.000 mg/mL 3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid(1)for 1 d；C.Symptoms of leaves treated with 1.000 mg/mL 3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid(1)for 7 d；“--→” means blank control；“”means sample processing.圖2 田間太子參葉斑病癥狀(A)及室內(nèi)3-氯-4-羥基苯乙酸致病癥狀(B、C)Fig.2 Symptoms of leaf spot disease of Pseudostellaria heterophylla in the field(A)and pathogenic symptoms of 3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid indoors(B，C)