賴燕婷 曾惠清 張孝斌

良性氣道狹窄指因各類良性病變引起的氣道狹窄，臨床表現(xiàn)為咳嗽、反復(fù)呼吸道感染、不同程度的呼吸困難甚至窒息。成人良性氣道狹窄常見病因?yàn)榻Y(jié)核、氣管插管和氣管切開術(shù)后氣道狹窄[1-2]。隨著重癥醫(yī)學(xué)和呼吸支持技術(shù)的發(fā)展，接受氣管插管、氣管切開的病人數(shù)量上升，其導(dǎo)致氣道狹窄的發(fā)生率升高[3]。據(jù)報(bào)道氣管插管2周左右、拔管后1個月左右即可發(fā)生氣管狹窄[4]。相較于惡性氣道狹窄，良性氣道狹窄患者生存期長、遠(yuǎn)期并發(fā)癥多，反復(fù)住院，生活質(zhì)量差，越來越受到人們的關(guān)注，已成為研究熱點(diǎn)。本研究旨在通過機(jī)械劃痕模擬氣管插管對氣道損傷作用，通過測量造模后細(xì)胞生長情況，在細(xì)胞水平層面探討機(jī)械損傷對氣道上皮細(xì)胞的作用，探討氣管插管所致氣管狹窄可能的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)、16HBE專用完全培養(yǎng)液外購于賽百慷公司。DMEM培養(yǎng)基購于hyclone公司；DAB顯色試劑盒、(Mouse/Rabbit)IHC Kit購于福州邁新；CCK8試劑盒購于Biosharp；TGF-β抗體購于bioss公司；β-catenin抗體購于abcam公司；HIF-1α抗體購于proteintch公司；蘇木精染色劑購于SIGMA公司。本研究倫理審批號：xmzsyyky論審第(2021-065)號。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

三、細(xì)胞造模

本課題組參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[5-6]，建立上皮細(xì)胞機(jī)械損傷模型。具體步驟如下：16HBE細(xì)胞100%融合后進(jìn)行換液，然后用20μL的槍頭在單層細(xì)胞上以間隔縱橫劃8條寬約0.5mm缺口，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后棄去，加新鮮的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)后上清液加入16HBE專用完全培養(yǎng)液建立條件培養(yǎng)液。

四、HBE細(xì)胞處理

將16HBE分為2組，每組各設(shè)置3個亞組進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，其中A1組用16HBE專用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，A2組用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)5天，倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)。

五、細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞分子檢測

1 CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞按照3000個/孔,鋪板96孔板，待細(xì)胞貼壁后分組進(jìn)行處理。處理48 h后，丟棄舊的培養(yǎng)基，加入CCK8試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，2h內(nèi)讀取OD450值。具體步驟參照各種試劑說明書進(jìn)行。

2 免疫細(xì)胞化學(xué)

利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測處理后16HBE中TGF-β、β-catenin、HIF-1表達(dá)水平。具體步驟如下：1)阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶；2)正常羊血清工作液封閉非特異位點(diǎn)；3)相應(yīng)細(xì)胞因子一抗、二抗孵育；4)DAB反應(yīng)染色、蘇木素復(fù)染、脫水透明，中性樹膠封片；5)拍照存檔。具體步驟參照各種試劑說明書進(jìn)行；各抗體工作濃度按說明書進(jìn)行稀釋。

3 HE染色

蘇木精-伊紅染色方法對細(xì)胞處理后16HBE進(jìn)行染色；具體步驟均參照各種試劑說明書進(jìn)行。

材料中“黨的十八屆會議審議通過《建議》”體現(xiàn)中共的相應(yīng)知識點(diǎn)，比如：執(zhí)政黨、領(lǐng)導(dǎo)核心、執(zhí)政方式；“國家發(fā)改委啟動建言獻(xiàn)策活動”體現(xiàn)公民參與民主決策；“政府編制‘十三五’綱要”體現(xiàn)政府科學(xué)民主決策等等。通過分析，既把握材料的中心思想和層次性，又建立了與知識點(diǎn)的聯(lián)系。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)

人支氣管上皮細(xì)胞16HBE基礎(chǔ)培養(yǎng)生長情況(圖1)所示，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

圖1 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)生長情況(×100)

二、16HBE細(xì)胞造模

16HBE造模前后生長情況，細(xì)胞生長狀態(tài)良好(圖2)所示。

圖2 細(xì)胞造模前后生長情況(×100)

三、16HBE細(xì)胞處理后生長情況

將16HBE分組培養(yǎng)5天后，倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，兩組細(xì)胞均表現(xiàn)為扁平、核大而圓、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間彼此連接緊密，細(xì)胞連接處清晰可見，(圖3)所示。

四、細(xì)胞計(jì)數(shù)

將16HBE分組培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，各組數(shù)量比較(圖4)所示，造模后，細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

圖3 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)分組培養(yǎng)后細(xì)胞生長情況(×100)

圖4 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)分組培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量對比

五、CCK8檢測

將16HBE分組培養(yǎng)后用CCK8檢測法分析兩組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果(圖5)所示，造模后，細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。

圖5 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)分組培養(yǎng)后CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性(OD450吸光度對比情況)

六、免疫細(xì)胞化學(xué)

將16HBE分組培養(yǎng)后免疫細(xì)胞化學(xué)分析TGF-β、β-catenin、HIF-1表達(dá)情況，使用Image J軟件分析組化圖像，結(jié)果(圖6)所示，原圖(圖7)所示。結(jié)果顯示，造模后TGF-β、β-catenin、HIF-1α表達(dá)升高(P<0.05)。

圖6 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)分組培養(yǎng)后免疫細(xì)胞化學(xué)測定細(xì)胞因子結(jié)果

圖7 16HBE細(xì)胞分組培養(yǎng)后免疫細(xì)胞化學(xué)DAB染色(×400)

七、HE染色

將16HBE分組培養(yǎng)后，HE染色顯微鏡下觀察細(xì)胞變化情況，造模后細(xì)胞形態(tài)未變，胞核染色未變，胞質(zhì)淡染，結(jié)果(如圖8)所示。

討 論

氣管插管和氣管切開是導(dǎo)致氣道良性狹窄的主要病因，此類患者生存期長，生活質(zhì)量差，醫(yī)療資源及經(jīng)濟(jì)資源消耗大，越來越受到人們關(guān)注，其參與介導(dǎo)氣道狹窄的分子機(jī)制復(fù)雜，且關(guān)于這方面的基礎(chǔ)研究不足。

圖8 HE(蘇木精-伊紅染色)染色(×400)

良性氣道狹窄的發(fā)生是氣道粘膜損傷和異常修復(fù)的過程[7]，最終導(dǎo)致氣道重塑。當(dāng)氣道粘膜破壞時，炎癥細(xì)胞浸潤、增生、分化，新生血管形成，其中成纖維細(xì)胞分泌大量膠原纖維，造成膠原沉積，肉芽組織老化脫水，成纖維細(xì)胞變成具有收縮表現(xiàn)的肌成纖維細(xì)胞，發(fā)生組織攣縮及瘢痕狹窄，在氣道狹窄中起重要作用。

氣道重塑過程中，TGF-β過度表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的募集及向肌成纖維細(xì)胞分化，細(xì)胞外基質(zhì)過表達(dá)、沉淀和細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，參與氣道狹窄的形成。Simpson等[8]對聲門下氣道狹窄模型犬注射抗TGF-β，發(fā)現(xiàn)其可明顯減輕氣道狹窄，從動物層面驗(yàn)證了TGF-β在氣道狹窄中的作用。隨訪119例氣管支氣管結(jié)核患者，氣管鏡評估氣管狹窄發(fā)生情況，分析血液TGF-β濃度，發(fā)現(xiàn)氣道狹窄組TGF -β水平較非狹窄組明顯升高[9]。國內(nèi)學(xué)者一項(xiàng)關(guān)于大鼠氣管移植后移植體狹窄的研究發(fā)現(xiàn)，對比對照組，氣管移植體內(nèi)TGF-β1表達(dá)量明顯增加,且其變化趨勢與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化動態(tài)變化趨勢一致,其研究證明TGF-β/Smad信號通路參與氣管移植后移植體狹窄[10]。

TGF-β和Wnt都是調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要通路，Wnt/β-catenin通路中當(dāng)Wnt信號激活后可激活胞內(nèi)蛋白DVL，抑制GSK3β等蛋白形成的β-catenin降解復(fù)合物的降解活性，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-catenin蛋白。β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后結(jié)合LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族，啟動下游靶基因(如c-myc、Cyclin D1等)的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)換，介導(dǎo)氣道重塑發(fā)生。在哮喘小鼠中, 通過抑制Wnt/β-catenin通路, 小鼠上皮下纖維化及膠原累積明顯減少, 氣道重塑程度明顯降低[11]。

HIF-1是一種低氧誘導(dǎo)結(jié)合蛋白，在低氧環(huán)境下，HIF-1α亞基的降解被抑制，1α和β亞基形成有活性的HIF-1，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，包括VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，參與炎癥反應(yīng)。Cai[12]等人分析了24例氣管插管后氣道狹窄患者氣道增生組織中HIF-1α表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HIF-1α在氣道肉芽組織中持續(xù)存在，參與氣管插管后氣道狹窄的發(fā)病過程，認(rèn)為其可能是啟動和促進(jìn)這一過程的潛在關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

本研究通過機(jī)械劃痕模擬插管機(jī)械損傷，對氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行損傷造模，利用造模后培養(yǎng)基對氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對比細(xì)胞數(shù)及凋亡率，探討機(jī)械損傷對氣道上皮細(xì)胞增生的影響，結(jié)果顯示造模后氣道上皮細(xì)胞的生長速度減慢，且活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明機(jī)械損傷可抑制氣道上皮細(xì)胞的正常生長。免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步分析兩組細(xì)胞因子變化，發(fā)現(xiàn)造模后細(xì)胞TGF-β、β-catenin升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示機(jī)械損傷破壞上皮細(xì)胞后可產(chǎn)生無菌性炎癥，促發(fā)損傷修復(fù)機(jī)制，同感染性炎癥介導(dǎo)氣道重塑相似，導(dǎo)致炎癥性細(xì)胞因子TGF-β、β-catenin過表達(dá)，說明TGF-β及Wnt/β-catenin通路可能是機(jī)械損傷后氣道修復(fù)的作用機(jī)制。氣管插管對氣道粘膜造成機(jī)械損傷的同時，由于氣管插管套囊長時間壓迫，粘膜局部缺血缺氧，導(dǎo)致缺氧因子HIF-1過表達(dá)，本研究在細(xì)胞層面證實(shí)了機(jī)械損傷下HIF-1的升高，證實(shí)缺氧參與了機(jī)械損傷介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。綜上，本研究認(rèn)為機(jī)械損傷可抑制氣道上皮細(xì)胞的正常生長；缺氧及TGF-β、Wnt/β-catenin通路可能參與了氣道機(jī)械損傷后的修復(fù)過程。在此，我們提出假設(shè)，機(jī)械損傷可通過TGF-β、Wnt/β-catenin通路及HIF-1參與其氣道修復(fù)過程，抑制氣道上皮細(xì)胞的正常增殖，誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)上皮重塑，導(dǎo)致氣道發(fā)生狹窄，這需要進(jìn)一步行細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。