巫文鑫，覃展敏，劉佳莉，陳柳燕，夏玉蘋，黃 妤，劉小勇，李永華,

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200；2.暨南大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東河源 517475；3.梧州鴛江響水桑寄生生物科技有限公司，廣西梧州 543200；4.梧州市古樹六堡茶廠，廣西梧州 543003）

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是非過量酒精攝入影響下形成的一種肝臟脂肪蓄積過度為主要特征的代謝綜合征，常伴隨肝損傷、肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌等演變式的并發(fā)癥，其致病因素涵蓋藥物、飲食、環(huán)境、腸道菌群等方面，屬多重因素相互作用的進行性疾病[1?2]。NAFLD在中國大陸的患病率接近30%[3]，Estes等[4]預(yù)測中國NAFLD患病率將在2016～2030年間相對增長22.2%。目前沒有特效藥物被批準(zhǔn)用于NAFLD的治療，常采取多模式方法，以減少肝臟脂質(zhì)蓄積、改善胰島素敏感性、減少肝臟星狀細胞激活等改善并發(fā)癥的途徑達到治療目的[5]。降血糖的代表性藥物鹽酸二甲雙胍常伴隨厭食、腹瀉等胃腸道反應(yīng)，且存在乳酸中毒風(fēng)險，不適用于嚴(yán)重肝功能不全患者，而減肥手術(shù)的快速治療存在皮層周圍炎癥、肝纖維化等問題[2]。必須進一步探索除具備上述治療目的外，還伴有抗氧化、護肝、調(diào)節(jié)腸道微生物生態(tài)等效果的治療方式。對此，中醫(yī)的多靶點治療理念對NAFLD的防治具有明顯優(yōu)勢[6]。

桑寄生茶是桑寄生Taxillus chinensis（DC.） Danser的葉和葉芽通過茶藝處理而成的一種別樣茶（non-Camellia teas），在嶺南地區(qū)，桑寄生作茶飲用歷史悠久，文字記載可追溯至清代《生草藥性備要》[7]，“消熱，滋補，追風(fēng)，養(yǎng)血散熱。作茶飲，舒筋活絡(luò)?！爆F(xiàn)代研究表明，桑寄生還具有降血糖、抑制肝癌細胞、抗炎等藥理作用[8]。冠突曲霉Aspergillus cristatus是茯磚茶發(fā)酵過程的主要真菌[9]，可作為新型益生菌用于肥胖癥的治療[10]，具有抗氧化、抗衰老、調(diào)整腸道菌群、增強宿主免疫等生物活性[11?13]。冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶是否能結(jié)合兩者優(yōu)勢，對NAFLD的防治起到積極的影響并無報道。

斑馬魚為鯉科熱帶硬骨魚，原產(chǎn)于南亞地區(qū)，自成為模式動物以來，因其體積小，繁殖能力強，實驗周期短，基因序列與人類高度相似等特點被廣泛運用于藥效篩選與毒理學(xué)研究[14]。超高效液相色譜串聯(lián)-四級桿-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）是以超高效液相色譜儀作為分離系統(tǒng)，四級桿與飛行時間質(zhì)譜為分析器串聯(lián)而成的一種質(zhì)譜分析技術(shù)，是近年來對于復(fù)雜基質(zhì)進行鑒定分析的有效方法之一[15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運用高通量組學(xué)分析，對系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組分等多學(xué)科理論整體性分析，結(jié)合計算機模擬進行可行性分析，用于預(yù)測藥物作用機制、疾病發(fā)生機制的一項技術(shù)[16]。UPLC-Q-TOF-MS/MS、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、斑馬魚模型等實驗方法常聯(lián)合使用用于中藥藥效預(yù)測及功能驗證[17]。

基于此，本研究采用正交試驗優(yōu)選冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶工藝，模式動物斑馬魚探究冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶對NAFLD的防治作用，并采用超高效液相色譜串聯(lián)-四級桿-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOFMS/MS）與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探究冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶防治NAFLD的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑寄生茶原料 為桑寄生葉和葉芽，采摘于廣西梧州岑溪市桑寄生人工種植基地，寄主植物為桑樹，采摘時間2020年9月，桑寄生茶原料經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)李永華研究員鑒定為桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.） Danser的葉和葉芽；野生型（AB系）斑馬魚 購自國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center）。斑馬魚于本實驗循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，水溫20～28 ℃，環(huán)境28～30 ℃，光照/黑暗周期12 h/12 h，每天飼食豐年蝦2次；總蛋白（TP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試試劑盒 南京建成生物工程研究所；冠突曲霉（菌株編號：CICC2016.97） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；蘆丁（批號：RP210601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、沒食子酸（批號：RP191126，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、L-谷氨酸（批號：RP200602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%） 成都麥德生科技有限公司；原花青素（批號：201219，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%） 信陽市中檢計量生物有限公司；D-無水葡萄糖（批號：110833-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）中國食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白（批號：NO.617C022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；阿托伐他?。ㄅ枺?9961，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）MedChemExpress公司。

ACQUITY UPLC I-Class超高液相色譜儀 美國沃特世公司；Xevo G2-XS Tof飛行時間質(zhì)譜儀美國沃特世公司；EnVision2105高通量酶標(biāo)儀篩選系 珀金埃爾默股份有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；Z-A-D4水生物實驗養(yǎng)殖設(shè)備 上海海圣水族設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶工藝的正交試驗優(yōu)化

1.2.1.1 主要化學(xué)成分權(quán)重系數(shù)的確定 層次分析法（Analytic Hierarchy Process，AHP）[18]是根據(jù)評價指標(biāo)進行成對比較的優(yōu)先判斷矩陣方法。根據(jù)樣品主要化學(xué)成分的含量，對各個評價指標(biāo)進行量化，確定為9個層級，判斷矩陣評分表見表1。計算各化學(xué)成分的權(quán)重系數(shù)，并進行方法學(xué)一致性檢驗。

表1 判斷矩陣評分Table 1 Judgment matrix scoring table

1.2.1.2 正交試驗的設(shè)計 通過前期單因素實驗結(jié)果選出含水量（A）、渥堆時間（B）、菌液濃度（C）、發(fā)酵時間（D）等4因素的三水平構(gòu)建L9（34）正交試驗，因素水平設(shè)置如表2所示。按“常壓氣蒸A→渥堆B→調(diào)整含水量→常壓氣蒸→接種菌液C→發(fā)花D→干燥”工序進行樣品制備。工序中步驟的上標(biāo)字母代表該步驟考察的相關(guān)因素。

表2 正交試驗各因素水平設(shè)置Table 2 Factors of orthogonal test

1.2.1.3 主要化學(xué)成分的測定及AHP化學(xué)成分評分對總黃酮[19]、茶多酚[20]、原花青素[21]、可溶性糖[22]、游離氨基酸[23]、可溶性蛋白[24]、水浸出物[25]進行含量測定，并以此作為考察指標(biāo)進行AHP化學(xué)成分評分。

1.2.1.4 感官審評 參照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》[26]進行感官審評。感官審評得分=外形×0.2+湯色×0.15+香氣×0.25+滋味×0.3+葉底×0.1。評分大致等級劃分如表3所示。

表3 各指標(biāo)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria of each index

1.2.1.5 樣品總分的計算 參考張馨宇[24]多指標(biāo)綜合評價方法，樣品總分=100×（AHP化學(xué)成分得分/AHP化學(xué)成分得分max×0.5+感官審評得分/感官審評得分max×0.5）。

1.2.2 斑馬魚幼魚NAFLD模型建模和桑寄生茶活性測定

1.2.2.1 樣品給藥濃度的確定 取健康野生型（AB系）斑馬魚以雌:雄＝1:2比例于交配盒中，次日交配1.5 h后收取魚卵，用斑馬魚胚胎水換洗5次，于恒溫箱中28 ℃培養(yǎng)至受精后5 d（5 Day post fertilization，簡稱5 dpf），顯微鏡下挑取健康斑馬魚幼魚用于實驗研究。

分別精密稱取正交試驗最佳發(fā)酵樣及原料樣各3.000 g于250 mL錐形瓶中，加入沸水100 mL，于室溫浸提45 min，過濾后用于實驗。取5 dpf健康斑馬魚幼魚于6孔板中，10條/孔，設(shè)置樣品濃度為0.030、0.040、0.050、0.075、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.700 mg/mL，給藥后每12 h更換一次藥液，培養(yǎng)72 h后統(tǒng)計斑馬魚死亡情況，計算其72 h死亡率，確定樣品給藥濃度。

1.2.2.2 斑馬魚實驗的構(gòu)建及藥效指標(biāo)的確定 取5 dpf健康斑馬魚200條/缸于培養(yǎng)缸中培養(yǎng)，模型組以添加“0.1%蛋黃粉+5 mmol·mL?1硫代乙酰胺”的水溶液培養(yǎng)，桑寄生茶以發(fā)酵前后樣品均為LC0的最大濃度給藥，空白組投喂草履蟲0.5 mL·500 mL?1，以120 μg·500 mL?1阿托伐他汀水溶液作陽性對照。

5 dpf斑馬魚幼魚連續(xù)飼養(yǎng)72 h，空腹12 h后收樣。每組隨機挑取幼魚40條于離心管中，加生理鹽水100 μL，組織勻漿儀攪拌至均勻，2500 r/min離心10 min，取上清液用于TP、TC、TG、LDL-C、AST、ALT等生化指標(biāo)的測定。

1.2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS色譜條件及差異代謝物篩選

1.2.3.1 溶液的制備 分別取發(fā)酵前后桑寄生茶干燥樣品50 mg于50 mL 70%甲醇常溫超聲20 min，3000 r/min離心10 min，倒出上清液，樣品加50 mL 70%甲醇重復(fù)提取一次，離心，合并上清液，定容至100 mL，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

1.2.3.2 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱：Thermo scientific Accucore C18柱（100×2.1 mm，2.6 μmol/L）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：5%～95%20 min，95% 3 min A；體積流速：0.4 mL/min；進樣量：3 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子及負(fù)離子模式；一級質(zhì)譜掃描范圍m/z：100～1500，二級質(zhì)譜掃描范圍m/z：50～1500；錐孔電壓：35 V；毛細管電壓：2000 V；加熱毛細管溫度：350 ℃。

1.2.3.3 差異代謝物篩選 篩選條件：通過實驗室自建數(shù)據(jù)庫及公共數(shù)據(jù)庫比對代謝物信息，并通過SIMCA 14.1對數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projection to latent structure discrimination analysis，OPLS-DA）。通過OPLS-DA的VIP>1.0；結(jié)合單因素方差分析、差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）≥2.0或FC≤0.5等條件篩選差異代謝物。

1.2.4 潛在機制

1.2.4.1 活性成分靶點與疾病靶點的收集 通過drugbank（https://go.drugbank.com/）、BindingDB（https://www.bindingdb.org/bind/index.jsp）、STITCH（http://stitch.embl.de/）數(shù)據(jù)庫進行差異代謝物的靶點查找，個別無法查找的化合物通過SwissTraget-Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測潛在靶點。通過UniProt（http://www.uniprot.org/）規(guī)范處理差異代謝物的靶點數(shù)據(jù)。以“nonalcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞，通過genecard（https://www.genecards.org/）查找相關(guān)疾病靶點，篩選相關(guān)性得分大于10的基因。使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將化合物靶點與疾病靶點進行交集處理并制作韋恩圖。

1.2.4.2 PPI構(gòu)建及核心靶點篩選 交集靶點上傳String（https://stringdb.org），物種限定為“Homo sapiens”，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息。篩選可信度（≥0.4）的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，剔除游離靶點后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0，根據(jù)度（degree，DE）、接近中心度（Closeness Centrality，CC）、度介中心度（Betweenness Centrality，BC）篩選核心靶點。

1.2.4.3 GO生物過程和KEGG信號通路富集分析通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對共同靶點進行GO及KEGG富集分析，閾值為差異的顯著性（P-value，P）<0.05，整理分析數(shù)據(jù)，選擇適量數(shù)據(jù)進行Origin 2021的氣泡圖及Cytoscape 3.6.0的網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

1.2.4.4 核心靶點與關(guān)鍵成分的分子對接 通過Auto Dock Tools 1.5.7處理PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載的關(guān)鍵蛋白3D結(jié)構(gòu)與Chem Office制作的關(guān)鍵成分3D結(jié)構(gòu)，去水加氫后轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件，AntoDock Vina進行分子對接，pymol進行可視化處理。根據(jù)文獻[27]報道，分子對接結(jié)果的結(jié)合能<-5.0 kcal·mol?1即有較好結(jié)合活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

除感官審評（n=6），斑馬魚NAFLD模型試驗（n=5）外，所有試驗重復(fù)3次。含量及生化指標(biāo)結(jié)果以平均值正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，樣品評分以平均值表示。采用IBM SPSS Statistics 25.0、Graph-Pad Prism 9.0和Origin 2021進行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果

2.1.1 AHP構(gòu)建權(quán)重系數(shù)的結(jié)果 經(jīng)AHP層次研究，確定各化學(xué)成分的權(quán)重系數(shù)為總黃酮0.2121、茶多酚0.1220、原花青素0.1001、可溶性糖0.0680、游離氨基酸0.0563、可溶性蛋白0.0522、水浸出物0.3892。一致性比例因子CR=0.0081<0.10，即兩兩比較矩陣具有一致性，權(quán)重設(shè)置合理。AHP化學(xué)成分得分=100×[（樣品總黃酮含量/總黃酮最大值）×0.2121+（樣品茶多酚含量/茶多酚最大值）×0.1220+（樣品原花青素含量/原花青素最大值）×0.1001+（樣品可溶性糖含量/可溶性糖最大值）×0.0680+（樣品游離氨基酸含量/游離氨基酸最大值）×0.0563+（樣品可溶性蛋白含量/可溶性蛋白最大值）×0.0522+（樣品水浸出物含量/水浸出物最大值）×0.3892]。

2.1.2 正交試驗樣品主要化學(xué)成分的含量測定結(jié)果通過單因素實驗和正交試驗制備冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶樣品，以化學(xué)成分百分含量作為評價指標(biāo)，AHP評分，結(jié)果如表4所示。對9個樣品的AHP評分進行方差分析，含水量、渥堆時間、菌液濃度、發(fā)酵時間等四因素的F值均大于F0.01（2,2）=99.00，即四因素對樣品得分均有極顯著差異（P<0.01），詳見表5。

表4 正交試驗樣品主要化學(xué)成分百分含量及AHP評分Table 4 Percentage content of main chemical components and AHP scores of orthogonal test samples

表5 方差分析Table 5 Anova analysis

2.1.3 正交試驗樣品主要成分的線性回歸方程 正交試驗樣品總黃酮、茶多酚、原花青素、可溶性糖、游離氨基酸、可溶性蛋白等主要成分的線性回歸方程如表6所示。

表6 主要考察指標(biāo)線性回歸方程Table 6 Linear regression equation of main indexes

2.1.4 感官評價結(jié)果 就外形、湯色、香氣、滋味、葉底等方面對正交試驗樣品進行感官評價，結(jié)果如表7所示。

表7 正交試驗樣品感官評定結(jié)果（n=6）Table 7 Sensory evaluation results on samples of orthogonal test (n=6)

2.1.5 多指標(biāo)綜合評價樣品總分結(jié)果 結(jié)合主要化學(xué)成分AHP得分及感官審評得分計算正交試驗樣品的總分，樣品總分詳見表8。結(jié)合表4可知最佳工藝為A1B3C2D1或A2B3C2D1，但在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，含水量較低時桑寄生葉及葉芽軟化、浸潤程度差異較大，且“金花”較少，為確保冠突曲霉發(fā)酵效果的穩(wěn)定性與均一度，選擇A3B3C2D1為最佳工藝，即含水量35%、渥堆時間3 h、接種量1×106CFU·mL?1和發(fā)酵時間7 d。

2.2 藥效學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 斑馬魚急性毒性結(jié)果 桑寄生茶發(fā)酵樣的毒性較原料樣明顯降低。如圖1所示，發(fā)酵組樣品在濃度為0.200 mg·mL?1時達到LC0，而原料組LC0最大濃度為0.050 mg·mL?1，明顯低于發(fā)酵組。選取兩組樣品均為LC0的最大濃度0.05 mg·mL?1作為給藥濃度。

圖1 發(fā)酵前后桑寄生茶水提物對斑馬魚的量-毒曲線Fig.1 Quantity-toxicity curves of zebrafish treated with water extract of Taxilli Herba tea before and after fermentation

2.2.2 發(fā)酵前后桑寄生茶對NAFLD模型斑馬魚的保護作用 “0.1%蛋黃粉+5 mmol·mL?1硫代乙酰胺”模型較空白組，TC、TG、LDL-C、AST、ALT等各生化指標(biāo)均有顯著性差異（P<0.05），即模型組達到NAFLD模型標(biāo)準(zhǔn)。與模型組相比，阿托伐他汀組與發(fā)酵組各生化指標(biāo)均有顯著性差異（P<0.05），即有明顯的降血脂及抑制肝臟損傷功效。原料組中TC、TG與模型組無顯著性差異（P>0.05），而在LDL-C、AST、ALT等生化指標(biāo)中出現(xiàn)顯著性差異（P<0.01），其結(jié)果符合傳統(tǒng)認(rèn)知中桑寄生“補肝腎”的功效特點，但其“補肝腎”功效與脂質(zhì)代謝之間關(guān)系不顯著。各組生化指標(biāo)結(jié)果見表9。

表9 發(fā)酵前后桑寄生茶對NAFLD模型斑馬魚生化指標(biāo)的影響（n=5）Table 9 Influence of Taxilli Herba tea before and after fermentation on biochemical parameters of zebrafish NAFLD model

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS差異代謝物分析

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測冠突曲霉發(fā)酵前后桑寄生茶樣品，共得到32種化學(xué)成分，將32種化合物及其峰面積信息代入SIMCA 14.1進行OPLSDA分析。交叉驗證R2Y和Q2均大于0.9，且R2YQ2<0.3，即樣品間差異非常顯著，如圖2所示。通過SIMCA中Permutation進行200次隨機改變分類變量Y的排列順序進行置換檢驗，如圖3所示，R2Y<0.4，且Q2Y<0.05，可排除背景相關(guān)，該模型穩(wěn)健性好，無過擬合現(xiàn)象。

圖2 發(fā)酵前后桑寄生茶OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA score diagram of Taxilli Herba tea before and after fermentation

圖3 發(fā)酵前后桑寄生茶置換檢驗圖Fig.3 Displacement test diagram of Taxilli Herba tea before and after fermentation

依據(jù)OPLS-DA模型得到的VIP值、單因素方差分析結(jié)果、FC等篩選條件，共篩選出14種差異代謝物，包含酚酸類6種，黃酮類3種，生物堿3種，鞣質(zhì)1種，糖類1種，詳見表10。其中海膽靈（Echinulin）和新海膽靈A（Neoechinulin A）為發(fā)酵后樣品的特征性代謝產(chǎn)物，無法計算FC值。

表10 差異代謝物Table 10 Differential metabolites

2.4 基于差異代謝物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1 活性成分與疾病靶點篩選 對Drugbank、BindingDB、STITCH、SwissTraget-Prediction平臺所查找基因去重后得到279個活性成分靶點。通過genecard收集NAFLD的相關(guān)靶點351個。對疾病靶點及成分靶點作靶點映射，篩選出潛在活性靶點32個，如圖4所示。

圖4 差異代謝物-非酒精性脂肪肝病靶點Fig.4 Targets of differential metabolites- nonalcoholic fatty liver disease

2.4.2 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將32個交集靶點導(dǎo)入String構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，剔除1個無相關(guān)作用靶點GCKR，得到由31個節(jié)點，144條邊所組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0進行可視化分析，如圖5所示。根據(jù)DE、BC、CC等3個拓?fù)鋮?shù)進行核心靶點篩選，拓?fù)鋮?shù)篩選閾值為均值（DE>9、BC>0.026、CC>0.582），得到7個核心靶點，核心靶點相關(guān)信息見表11。

表11 核心蛋白拓?fù)鋮?shù)信息Table 11 Topological parameter information of core protein

圖5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network of protein-protein interaction

2.4.3 GO分析及KEGG通路富集分析 將交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO及KEGG富集分析，P<0.05為條件，篩選得到GO條目124個，其中生物過程（BP）條目94個，細胞組分（CC）條目9個，分子功能（MF）條目21個。分別對生物過程、細胞組分、分子功能組成P值前10的條目進行可視化分析，結(jié)果如圖6所示。生物過程方面，主要參與細胞的增殖與凋亡，對膽固醇、脂多糖、類固醇激素的調(diào)控等；細胞組分方面，與胞外空間、核體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞各個部分均聯(lián)系密切；分子功能方面，與酶、藥物、蛋白質(zhì)、離子結(jié)合，及酶、蛋白質(zhì)、激酶活性調(diào)節(jié)等功能有關(guān)。結(jié)果表明差異代謝物可通過生物學(xué)途徑防治NAFLD。

圖6 GO分析排名前10條目富集分析Fig.6 Enrichment analysis of top 10 items in GO analysis

根據(jù)篩選條件P<0.05得到KEGG信號通路46條，選取前20條目通路進行可視化分析，如圖7所示。其中，HIF-1、癌癥、胰島素抵抗、腫瘤壞死因子信號通路被顯著富集，為關(guān)鍵信號通路。此外，肝炎、脂肪細胞因子信號、NAFLD等肝臟功能相關(guān)信號通路也被富集，表明差異代謝物能通過多種信號通路發(fā)揮對NAFLD的防治作用。

圖7 KEGG排名前20條目富集分析Fig.7 Enrichment analysis of top 20 items in KEGG

2.4.4 “差異代謝物-靶點-通路-疾病”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 選取14個差異代謝物、32個共同靶點及前20條KEGG信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0構(gòu)建“差異代謝物-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有67個節(jié)點，184條相互作用直線。使用Analyze Network網(wǎng)絡(luò)節(jié)點拓?fù)鋮?shù)進行關(guān)鍵成分篩選，參數(shù)閾值為DE>5，BC>0.023，CC>0.380，得到2個關(guān)鍵成分，海膽靈和新海膽靈A，2個成分均為發(fā)酵后的特征性成分。其中，海膽靈作用于3個核心靶點LDLR、JUN、NR1H4，新海膽靈A作用于2個核心靶點EGFR、STAT3，即冠突曲霉發(fā)酵工藝能夠產(chǎn)生多種成分并通過多種生物途徑協(xié)同防治NAFLD。如圖8。

圖8 “差異代謝物-靶點-通路-非酒精性脂肪肝”網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Network of differential metabolite-targets-pathways-NAFLD

2.4.5 關(guān)鍵成分和核心靶點的分子對接驗證PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的7個核心靶點與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中2個關(guān)鍵成分按默認(rèn)參數(shù)進行分子對接，結(jié)果見表12。除新海膽靈A與JUN基因結(jié)合能為-5 kcal·mol?1外，2種關(guān)鍵成分與核心靶點間結(jié)合能均<-5 kcal·mol?1，即2種關(guān)鍵成分與7個核心靶點的結(jié)合活性較好。

表12 關(guān)鍵成分與核心靶點的分子對接Table 12 Molecular docking of key compounds and core targets

3 討論與結(jié)論

胰島素抵抗、糖尿病、肝損傷、代謝功能異常等是NAFLD發(fā)病的獨立危險因素及常見伴隨表現(xiàn)[28]，因此，對于NAFLD的防治需兼顧多類型疾病靶點的調(diào)控。

發(fā)酵前桑寄生茶相關(guān)的核心靶點IL6、PTGS2均與腫瘤壞死因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。IL6、PTGS2可通過系統(tǒng)介導(dǎo)肝細胞的凋亡，影響肝炎、急性肝衰竭的發(fā)病[29?31]。靶點IL6還參與胰島素抵抗信號通路的調(diào)節(jié)，影響肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等[32?33]的發(fā)病。羅澤萍等[34]研究發(fā)現(xiàn)桑寄生醇提液具有改善2型糖尿病模型小鼠高血糖水平及肝腎并發(fā)癥、保護肝腎功能的作用。即桑寄生茶在防治NAFLD方面具有影響糖脂代謝及炎癥發(fā)生的優(yōu)勢。

冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶的關(guān)鍵成分海膽靈、新海膽靈A可作用于NR1H4、LDLR、JUN、EGFR、STAT3等靶點發(fā)揮對NAFLD的防治作用。EGFR靶點作用于糖酵解和葡萄糖的轉(zhuǎn)運，且影響葡萄糖耐量[35]。EGFR還與JUN共同參與ErbB信號通路的調(diào)節(jié)，進而調(diào)節(jié)生物反應(yīng)[36]。STAT3是蛋白酪氨酸激酶（JAk）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）的代表性信號傳遞子，JAk表達低的人群，其肥胖程度較嚴(yán)重[37]。STAT3還與IL6共同參與FoxO信號通路的調(diào)節(jié)，進而影響葡萄糖代謝、抗氧化應(yīng)激等細胞生理活動[38]。此外，NR1H4可調(diào)控膽汁酸合成[39]、參與脂質(zhì)代謝；LDLR可調(diào)控LDL-C的胞吞作用[40]，從而在NAFLD中發(fā)揮防治作用。冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶結(jié)合了桑寄生茶降血糖、抗炎，以及冠突曲霉代謝產(chǎn)物降血脂、降血糖的優(yōu)勢，為NAFLD的防治提供新的方案。

本研究優(yōu)選了冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶的加工工藝：含水量35%、渥堆時間3 h、接種量1×106CFU·mL?1和發(fā)酵時間7 d。此條件下的冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶對NAFLD有顯著的防治作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測出關(guān)鍵成分海膽靈、新海膽靈A作用于NR1H4、LDLR、JUN、EGFR、STAT3等核心靶點，在此過程發(fā)揮重要作用，為深入研究冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了理論基礎(chǔ)，也為冠突曲霉發(fā)酵桑寄生茶開發(fā)成防治NAFLD的藥膳、膳食補充劑等提供參考。