王 丹，江春陽，鄧喬晟，楊 勤 ，周 濃,

（1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120）

地參（Lycopus lucidus）又名蟲草參，銀條菜，地蠶子，是唇形科地筍屬多年生草本植物，其形狀、營養(yǎng)與人參相似[1]。在《中華本草》資料中記載了地參可作為蔬菜食用，其曬干之后還可以入藥，功能與冬蟲夏草相當(dāng)[2]。藥理研究表明[3]，地參中含有大量的多酚類和多糖類，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤等療效作用。地參可作為蔬菜食用，其保健功能豐富，享有“蔬菜珍品”、“山中之王”等美譽[4]。

目前國內(nèi)外對地參藥理研究主要集中在地參多糖、多酚等成分的提取研究[5?7]，現(xiàn)有的對地參的工藝研究包括地參酸奶[8]、地參酸辣發(fā)酵羊蹄[9]、地參枸杞汁[10]等休閑食品，沒有關(guān)于用鮮地參進行發(fā)酵酒的研究報道。針對目前市場上的地參加工成品，加工方法略微粗放，工業(yè)化程度較低，其產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定難以控制[11]。地參作為藥食兼用的植物，營養(yǎng)成分豐富，保健功能明顯，有著很大的開發(fā)利用價值，且地參含有大量的糖類物質(zhì)，可作為釀造保健型發(fā)酵酒的良好原材料。因此，有必要對地參開展深加工技術(shù)，開發(fā)利用地參中的其它活性成分，提升地參產(chǎn)品附加值。

本研究以新鮮地參為原料，通過單因素和響應(yīng)面試驗來確定地參發(fā)酵酒的發(fā)酵工藝條件，并對其體外抗氧化活性和酚酸類物質(zhì)進行分析，旨在釀造出一款口感佳、營養(yǎng)豐富、具有地參典型風(fēng)味的地參發(fā)酵酒，為地參的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮地參 重慶市萬州區(qū)恒合鄉(xiāng)石桶寨村種植地；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DY9 自篩選地參發(fā)酵酒專用酵母菌；酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基（YPD液體培養(yǎng)基） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）、ABTS西亞化學(xué)科技（山東）有限公司；沒食子酸、蘆丁北京索萊寶科技有限公司；丹參素、對羥基苯甲酸、咖啡酸 成都曼思特生物科技有限公司；原兒茶酸上海源葉生物科技有限公司；白砂糖 重慶野山珍商貿(mào)有限公司；甲醇（色譜純） 德國默克公司；氫氧化鈉、過硫酸鉀、苯酚、硫酸等試劑 成都市科隆化工試劑廠，均為分析純。

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀美國Waters公司；L18-Y915S型高速破壁調(diào)理機九陽股份有限公司；PHS-3C型精密酸度計 杭州齊威儀器有限公司；酒精計 衡水創(chuàng)紀(jì)儀器表有限公司；FA1004型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；YRE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限公司；V-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HSY-26型水浴鍋、HDPN-Ⅱ-256型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地參發(fā)酵酒的工藝流程和操作要點 地參發(fā)酵酒的工藝流程如圖1所示，操作要點如下：

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow chart

地參汁制備：挑選新鮮無病害的地參清洗，備用。新鮮地參按一定的料液比（1:2）榨汁，按地參汁總質(zhì)量的0.1%添加果膠酶，40 ℃酶解2 h；添加焦亞硫酸鉀（80 mg/L），用白砂糖調(diào)節(jié)糖度，用檸檬酸將pH調(diào)至酵母菌最適生長值4～4.5；

酵母活化：取自篩的釀酒酵母DY9，劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃的搖床振蕩培養(yǎng)20 h，將1 mL菌液接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，連續(xù)擴增。

發(fā)酵：將調(diào)整好成分的地參汁放入發(fā)酵瓶（500 mL）中，在水浴70 ℃下殺菌30 min，冷卻至室溫，接入活化好的酵母，使用硅膠塞單向閥蓋好發(fā)酵瓶，按試驗設(shè)計的發(fā)酵時間、溫度進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，用4層紗布過濾去除發(fā)酵殘渣，得到的酒液放置14～18 ℃下低溫陳釀2個月。

滅菌：采用巴氏滅菌法，將澄清處理后的地參發(fā)酵酒置70 ℃熱水中20 min。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計

1.2.2.1 酵母接種量 設(shè)不同酵母接種量為2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，發(fā)酵溫度24 ℃，初始糖度22%，發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵酒的酒精度和殘?zhí)呛?，研究不同酵母接種量對發(fā)酵酒品質(zhì)（酒精度和殘?zhí)橇浚┑挠绊憽?/p>

1.2.2.2 發(fā)酵溫度 設(shè)不同發(fā)酵溫度為19、22、25、28、31 ℃，酵母接種量5%，初始糖度22%，發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵酒的酒精度和殘?zhí)呛?，研究不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵酒的品質(zhì)影響。

1.2.2.3 初始糖度 設(shè)不同初始糖度為18%、20%、22%、24%、26%，酵母接種量5%，發(fā)酵溫度24 ℃，發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵酒的酒精度和殘?zhí)呛浚芯坎煌跏继嵌葘Πl(fā)酵酒的品質(zhì)影響。

1.2.2.4 發(fā)酵時間 設(shè)不同發(fā)酵時間為3、5、7、9、11 d，發(fā)酵溫度24 ℃，初始糖度22%，酵母接種量5%，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵酒的酒精度和殘?zhí)呛?，研究不同發(fā)酵時間對發(fā)酵酒的品質(zhì)影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）和初始糖度（C）三個影響因素，以感官評分、酒精度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗[12?14]，試驗因素及水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface experiment

1.2.4 理化指標(biāo)測定 按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中酒精計法進行酒精度的測定[15]；總酸（以檸檬酸計）：按照GB/T 12456-2021《食品中總酸的測定》中的pH計電位滴定法測定[16]；殘?zhí)橇康臏y定：采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[17]；總酚含量的測定：采用Folin-Ciocaltue法[18]，以沒食子酸為對照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.5482x+0.4538，R2=0.9995；黃酮含量測定采用NaNO2-Al（NO3）3方法[19]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=10.541x?0.027，R2=0.9998；多糖含量的測定采用硫酸-苯酚比色法[20]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.121x?0.0005，R2=0.9989。

1.2.5 感官評價 隨機選擇10名食品專業(yè)人員，從地參發(fā)酵酒的外觀、滋味、香氣、典型性4個指標(biāo)進行評定，滿分100分，感官評分結(jié)果取平均值。感官品評表見表2。

表2 地參發(fā)酵酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard of sensory evaluation for Lycopus lucidus fermented wine

1.2.6 地參發(fā)酵酒抗氧化能力的測定 將酒樣稀釋10倍后，吸取1.0 mL樣品于刻度試管中進行實驗。DPPH自由基清除能力的測定：參考蘇龍等[21]的測定方法稍作修改；ABTS+自由基清除能力的測定：參考Miriam等[22]的方法稍作修改；對羥自由基清除能力的測定：參考萬景瑞等[23]的方法稍作修改；以上方法均以0.1 mg/mL的VC為陽性對照，計算公式為：

式中：A1為樣品溶液吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白溶液吸光度。

1.2.7 地參發(fā)酵酒酚酸類物質(zhì)的測定 對照品溶液的制備：分別精密稱取沒食子酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸對照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容至刻度線，得到濃度分別為0.709、1.2、1.426、0.204、0.448 mg/mL的對照品貯備液，于4 ℃冰箱保存，備用。

樣品溶液的制備：參考朱霞建等[24]的方法并稍作修改。取地參發(fā)酵酒20 mL，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH為7左右，加入20 mL乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，合并上清液，40 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用甲醇復(fù)溶并定容至2 mL，過0.22 μm有機濾膜上機測定。

色譜條件：參考唐柯等[25]的方法并稍作修改。以ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）為色譜柱；以0.1%磷酸為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～4 min，10%～20% B；4～9 min，20%～40% B；9～10 min，40%～10% B；10～12 min，10% B）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；進樣體積1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理及分析采用Excel 2010。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，用Origin 2021繪圖軟件繪制試驗結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酵母接種量對地參發(fā)酵酒的影響 不同酵母接種量對地參發(fā)酵酒精度及殘?zhí)橇康挠绊懡Y(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，當(dāng)酵母接種量為5%時，酒精度出現(xiàn)了最大值，殘?zhí)呛孔畹汀．?dāng)酵母量超過5%時，酒精度降低的同時殘?zhí)橇恳猜晕⒃龈?，可能是因為酵母接種量過多，酵母生長代謝旺盛，會消耗發(fā)酵液中大量營養(yǎng)物質(zhì)，影響了微生物的發(fā)酵導(dǎo)致酒精產(chǎn)量低[26]。當(dāng)酵母接種量少時，發(fā)酵的速度慢，容易產(chǎn)生雜菌，從而影響發(fā)酵酒的口感[27]。經(jīng)發(fā)酵酒精度及殘?zhí)呛烤C合考慮，選擇酵母接種量為4%、5%、6%進行響應(yīng)面試驗。

圖2 酵母接種量對地參發(fā)酵酒酒精度和殘?zhí)橇康挠绊慒ig.2 Effects of yeast inoculation on the alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.1.2 發(fā)酵溫度對地參發(fā)酵酒的影響 不同發(fā)酵溫度對地參發(fā)酵酒精度及殘?zhí)橇康挠绊懡Y(jié)果見圖3。由圖3可知，在19～25 ℃溫度范圍內(nèi)時，隨著溫度的增加酒精度也升高。溫度為25 ℃時酒精度達到了最大值，殘?zhí)呛孔畹?。?dāng)溫度在超過25 ℃時，發(fā)酵生成的酒精度呈下降趨勢，殘?zhí)呛恐饾u增多，發(fā)酵溫度過高，酵母菌繁殖速度加快，容易使菌體提前衰老，不利于糖轉(zhuǎn)化為酒精，溫度高發(fā)酵物中風(fēng)味物質(zhì)易揮發(fā)，影響發(fā)酵酒的口感。經(jīng)發(fā)酵酒精度及殘?zhí)呛烤C合考慮，選擇發(fā)酵溫度為22、25、28 ℃進行響應(yīng)面試驗。

圖3 發(fā)酵溫度對地參發(fā)酵酒酒精度和殘?zhí)橇康挠绊慒ig.3 Effects of fermented temperature on the alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.1.3 初始糖度對地參發(fā)酵酒的影響 不同初始糖度對地參發(fā)酵酒精度及殘?zhí)橇康挠绊懡Y(jié)果見圖4。在發(fā)酵的過程中酵母菌利用糖進行生長繁殖，并將糖轉(zhuǎn)化為酒精。由圖4可知，隨著初始糖度的增加，酒精度呈現(xiàn)出先升高后降低的情況，殘?zhí)呛吭谥饾u的增加。初始糖度太低，生成的酒精度低，酒的口感寡淡。初始糖度含量過多會增加發(fā)酵液的滲透壓，酵母菌代謝活動會受到抑制，多余的糖未能轉(zhuǎn)化為酒精導(dǎo)致酒精度降低，發(fā)酵酒中的剩余糖量過多，從而影響了發(fā)酵酒的口感[28]。當(dāng)初始糖度為22%時，發(fā)酵酒的酒精度、殘?zhí)呛窟m中。因此，經(jīng)發(fā)酵酒精度及殘?zhí)呛烤C合考慮，選擇初始糖度為20%、22%、24%進行響應(yīng)面試驗。

圖4 初始糖度對地參發(fā)酵酒酒精度和殘?zhí)橇康挠绊慒ig.4 Effects of initial sugar content on alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.1.4 發(fā)酵時間對地參發(fā)酵酒的影響 發(fā)酵時間過短或過長都會對酒的品質(zhì)造成影響。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時間為3 d時，酒精度最低，殘?zhí)橇孔罡?；在發(fā)酵時間3～9 d的范圍內(nèi)時，酒精度隨著時間的延長而增加，這個階段殘?zhí)橇肯陆笛杆?。發(fā)酵時間為9 d時，酒精度的增長最快，酒精度達到了最大值，在9～11 d時酒精度基本不再生長，殘?zhí)橇肯陆稻徛?。發(fā)酵后期，發(fā)酵液中剩余的營養(yǎng)成分較少，酵母的生長受到了抑制，部分酵母衰老[29]。經(jīng)發(fā)酵酒精度及殘?zhí)橇烤C合考慮，加上時間的成本選擇時間9 d為最佳發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對地參發(fā)酵酒酒精度和殘?zhí)橇康挠绊慒ig.5 Effects of fermented time on the alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）和初始糖度（C）為自變量，分別以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為因變量進行Box-Benhken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗，試驗結(jié)果見表3。

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次回歸方程擬合，分別得到酒精度（Y1）和感官評分（Y2）對發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）和初始糖度（C）的二次多項回歸方程：

表3 地參發(fā)酵酒工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of optimized response surface of Lycopus lucidus fermentation wine process

方差分析結(jié)果顯示，所得回歸模型極顯著（P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），證明所得模型能充分擬合試驗數(shù)據(jù)，能夠較好的預(yù)測試驗值，詳見表4。由P值結(jié)果得出3種因素對地參發(fā)酵酒酒精度影響的強弱順序依次為：初始糖度>發(fā)酵溫度>酵母接種量。一次項C對酒精度的影響極顯著（P<0.01），A、B對酒精度影響不顯著；交互項AB、AC、BC對酒精度影響均不顯著；二次項A2對酒精度影響顯著（P<0.05），B2、C2對酒精度影響極顯著（P<0.01）；3種因素對地參發(fā)酵酒感官評分影響的強弱順序依次為：初始糖度>發(fā)酵溫度>酵母接種量。一次項C對感官評分的影響極顯著（P<0.01），A對感官評分的影響顯著（P<0.05），B對酒精度影響不顯著；交互項AB對感官評分的影響極顯著（P<0.01），AC、BC對感官評分影響均不顯著；二次項A2、B2、C2對感官評分影響極顯著（P<0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 響應(yīng)面是響應(yīng)值受各影響因子影響程度的三維曲面圖，能很好地反映不同影響因子間的相互作用強弱，且響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭、等高線越密集成橢圓形表示兩因素交互影響越大[30]。

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對影響地參發(fā)酵酒酒精度和感官評分的3個因素進行交互分析，交互作用的大小由響應(yīng)面的的陡峭程度來體現(xiàn)。由圖6可知，圖6A的陡峭度和等高線的密集程度都高于圖6B和圖6C，證明了AB的相互作用對酒精度的影響要高于AC和BC交互作用的影響，這與表4中AB的P值小于AC和BC的P值相吻合。由圖6D～圖6F可知，A與B的響應(yīng)面坡度最陡峭，其等高線呈橢圓，說明AB的交互作用對感官評分的影響較顯著，而AC和BC的陡峭程度都不如AB，其高等線密集程度也弱于AB，這與表4中AB的P值小于AC和BC的結(jié)論相吻合。

圖6 各因素交互作用對酒精度和感官評分影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface view of the effect of factor interaction on alcohol content and sensory score

表4 響應(yīng)面試驗方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

2.2.3 最佳發(fā)酵工藝與驗證 通過單因素實驗得出最佳發(fā)酵時間為9 d，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對響應(yīng)面試驗進行結(jié)果分析，確定地參發(fā)酵酒的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度25.99 ℃，接種量為5.1%，初始糖度為22.78%，此條件下由公式算出的理論酒精度為11.18%vol，理論感官評分為85.38分。根據(jù)實際情況，驗證試驗的條件為發(fā)酵溫度26 ℃，接種量為5.1%，初始糖度為22.8%，在此條件下，進行3次重復(fù)試驗，得到地參發(fā)酵酒的酒精度為11.23%vol，感官評分為85.50分，測定結(jié)果與預(yù)測值偏差不大。因此，響應(yīng)面優(yōu)化地參發(fā)酵酒工藝參數(shù)是可靠的。

2.3 地參發(fā)酵酒品質(zhì)評價

2.3.1 地參發(fā)酵酒理化指標(biāo)分析 由響應(yīng)面優(yōu)化出的工藝參數(shù)發(fā)酵，所得到的地參發(fā)酵酒體色澤呈橘黃色，澄清透明，酒體醇厚豐滿，具有獨特的地參酒風(fēng)味。理化指標(biāo)，地參發(fā)酵酒多糖含量為6.54±0.08 g/L、總酚為384.31±0.12 mg/L、總酸和總黃酮為別為20.67±0.15 g/L和204.59±0.21 mg/L。

2.3.2 體外抗氧化活化 研究發(fā)現(xiàn)，地參發(fā)酵酒中含有豐富總黃酮、總酚物質(zhì)，這兩種物質(zhì)有很好的抗氧化能力，能有效地清除體內(nèi)自由基延緩衰老[31?32]。由圖7可知，地參發(fā)酵酒對DPPH、·OH、ABTS+都有較強的清除作用，與VC的清除能力相比較，其DPPH自由基清除能力低于VC，·OH、ABTS+自由基清除能力高于VC。

圖7 地參發(fā)酵酒抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of Lycopus lucidus fermented wine

2.3.3 酚酸類物質(zhì)含量分析 在響應(yīng)面試驗得到的條件下，測定了地參發(fā)酵酒中酚酸物質(zhì)含量，含量檢測結(jié)果見表5，液相色譜圖見圖8。酚酸類物質(zhì)具有良好的營養(yǎng)功能和抗氧化等藥理活性，發(fā)酵酒中就含有大量的酚酸類物質(zhì)[33]。由表5可知，從地參發(fā)酵酒中檢測到了5種酚酸物質(zhì)，其中沒食子酸的含量最高（11.20 mg/L），占酚酸總量的33.2%，趙寧等[34]研究發(fā)現(xiàn)除“徐香”清汁發(fā)酵酒外其他5種獼猴桃酒中沒食子酸含量最高，其次是咖啡酸，對羥基苯甲酸的含量最低（3.40 mg/L），本研究結(jié)果與其類似。沒食子酸作為地參發(fā)酵酒中的主要酚酸類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗突變及抗腫瘤等多種生物活性[35]。本研究所得地參發(fā)酵酒中酚酸類物質(zhì)種類較為豐富，具有一定的保健作用。

圖8 混合對照品（A）及樣品（B）的UPLC圖譜Fig.8 UPLC spectra of mixed reference substance (A) and sample (B)

表5 地參發(fā)酵酒5種酚酸類物質(zhì)含量Table 5 Contents of five phenolic acids in Lycopus lucidus fermented wine

3 討論與結(jié)論

地參發(fā)酵酒的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度26 ℃，接種量5.1%，初始糖度22.8%，發(fā)酵時間9 d，在此條件下得到的地參發(fā)酵酒感官評分為85.50分，酒精度為11.23%vol，釀造得到的酒體醇厚豐滿或酒體爽口，顏色為橘黃色，澄清透明，具獨特的地參酒風(fēng)味，酒香純正優(yōu)雅。地參發(fā)酵酒含有豐富的活性物質(zhì)，多糖、總酚、總酸和總黃酮含量分別為6.54 g/L、384.31 mg/L、20.67 g/L和204.59 mg/L。單體酚酸類物質(zhì)沒食子酸為11.20 mg/L、丹參素為4.38 mg/L、原兒茶酸為3.74 mg/L、對羥基苯甲酸為3.40 mg/L，咖啡酸為11.00 mg/L。地參本身就具有豐富的營養(yǎng)價值和開發(fā)價值，本研究所得地參發(fā)酵酒酒色澤呈橘黃色，澄清透明，酒體醇厚豐滿，不僅具有獨特的地參酒風(fēng)味，同時較好的保留了地參發(fā)酵酒多酚等活性成分，并且還具有一定的抗氧化活性。因此，開發(fā)地參酒可為今后地參的深加工提供新的思路，同時也增加了地參加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。