謝玉霞，葛武鵬, ，李國薇，白 航，張 靜，李香云，高秦藝，王爽爽

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.富平縣檢驗檢測中心（陜西省羊乳產品質量監(jiān)督檢驗中心），陜西渭南 711700；3.西安依巴特生物科技有限公司，陜西西安 710000；4.陜西秦龍乳業(yè)集團有限公司，陜西西安 710000）

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一種以持續(xù)性高血糖為特征的代謝性疾病，隨著時間推進會導致心血管疾病、神經病變、腎功能衰竭等一系列并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為I型糖尿病（T1MD），II型糖尿?。═2MD）和妊娠型糖尿?。℅DM）三種類型，其中II型糖尿病患者占到90% 以上[1]。T2DM顯著的病理生理學特征為胰島素調控葡萄糖代謝能力的下降（胰島素抵抗）伴胰島β細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌減少。二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）是II型糖尿病代謝中一種關鍵酶，廣泛表達于大多數組織和細胞中[2]。DPP-IV在體內會迅速降解胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）從而影響胰島素分泌和血糖代謝，因此DPP-IV也是糖尿病治療的一個關鍵因子[3?4]，DPP-IV抑制劑成為糖尿病藥物開發(fā)的一個重要方向。目前在全球上市的DPP-IV抑制劑超過10種，常見的有西格列?。╯itagliptin）、維格列?。╲ildagliptin）、沙格列?。╯axagliptin）等，但這類藥物都是人工合成藥物，常會引發(fā)比較嚴重的副反應，如頭疼、腹瀉、尿路感染、腎臟負擔等[5?6]。相比之下，食源性DPP-IV抑制肽因穩(wěn)定性好，副作用小等優(yōu)點而受到關注。

乳源是生物活性肽的廣泛來源，駝乳是一種營養(yǎng)很高的小品種乳，富含多種功能性因子，其在輔助治療糖尿病方面顯示出巨大的潛力[7?8]。駝乳源DPP-IV抑制肽的研究相對較少，2017年Nongonierma首次報道了駝乳蛋白水解物對DPP-IV抑制作用，從中鑒定到兩條新型DPP-IV抑制肽LPVPQ和WK，研究結果表明，相比牛乳，駝乳蛋白水解物具有更高的DPP-IV抑制率[9]。LF是駝乳中重要的功能性因子之一，有文獻報道了LF和糖尿病及其并發(fā)癥之間的潛在聯(lián)系，例如胰島素抵抗、炎癥和肥胖癥[10?12]。Khan等[12]首次在分子和細胞水平上分析駝乳LF和牛乳LF對肝癌細胞（HepG2）和人胚胎腎細胞（HEK293）中胰島素受體活性和藥理作用，表明LF是駝乳中抗糖尿病特性背后的潛在生物活性蛋白。Gamal Badr等[13]也發(fā)現(xiàn)駝乳源LF可提高II型糖尿病患者的胰島素敏感性，并具有抗炎和免疫調節(jié)作用。由此推測駝乳LF可能是DPP-IV抑制肽的潛在來源，但目前關于駝乳LF源DPP-IV抑制肽的研究非常有限。

食源性DPP-IV抑制肽已成為國內外研究熱點，然而常規(guī)方法篩查DPP-IV抑制肽耗時費力，隨著科技手段的進步，模擬酶切和分子對接等生物信息學工具已被廣泛應用于生物活性肽制備及篩選中。此外，網絡藥理學也作為一種有效工具應用于活性成分與疾病間作用機制的研究中[14]?；诖耍狙芯恳择勅長F為研究對象，模擬酶切產生多條肽段，結合文獻報道，數據庫比對及分子對接篩選DPP-IV抑制肽，選擇其中4條進行人工合成驗證其DPP-IV抑制率。隨后，采用分子動力學和分子對接進一步揭示肽段與DPP-IV的作用機理。最后，選擇DPP-IV抑制率較強的肽段進行網絡藥理學分析，進一步探究肽段防治糖尿病的潛在作用靶點及通路，為駝乳源DPPIV抑制劑的研發(fā)提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DPP-IV、Gly-Pro-pNA Sigma-Aldrich公司；Tris-HCl緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；醋酸-醋酸鈉緩沖液 北京譜析科技有限公司；合成肽段EACAF、GPQY、IWKL、FGR （純度≥98%）生工生物工程（上海）股份有限公司。

VictorX3酶標儀 美國珀金埃爾默股份有限公司；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；XP6電子天平 梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬酶切 駝乳LF序列由UniProt數據庫獲?。╡ntry ID：Q9TUM0），其氨基酸序列長度為708。選擇三組不同類型蛋白酶進行模擬酶切，包括三種胃腸消化酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶，一種植物蛋白酶木瓜蛋白酶以及堿性蛋白酶和蛋白酶K兩種微生物蛋白酶。胰蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶是文獻中制備DPP-IV抑制肽常用的三種蛋白酶，此外還選擇了胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K三種水解能力較強的蛋白酶水解駝乳LF，以產生更多新型肽段。駝乳LF序列在BIOPEP網站（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）進行模擬酶切。

1.2.2 DPP-IV抑制肽的篩選

1.2.2.1 Peptide Ranker評分 將1.2.1中所得肽段在Peptide Ranker（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/）網站中進行生物活性可能性分析，肽段評分越高，則其具有生物活性的可能性越大。選擇生物活性評分≥0.5的肽段作為潛在的目標活性肽[15]，與多肽數據庫BIOPEP、PeptideDB、SwePep、EROP Moscow、PepBank和文獻中的生物活性肽進行比對，篩選出未報道的肽段進行下一步分析。

1.2.2.2 分子對接篩選 應用Discovery Studio2019軟件中的Dock Ligands（CDOCKER）工具對肽段與DPP-IV（PDB ID：4A5S）進行半柔性分子對接，按照分子對接步驟設定相關參數，以-CDOCKER_ENERGY和 -CDOCKER_INTERACTION_ENERGY為評分指標，篩選目標活性肽?！?CDOCKER_INTERACTION_ENERGY”值是受體與配體相互作用力的評分，“-CDOCKER_ENERGY”值是“-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY”與分子內能的和，“-CDOCKER_ENERGY”值相對越高，表示配體和受體結合越緊密[15]。

1.2.3 目標肽段人工合成 采用固相法對篩選所得肽段進行人工合成（純度≥98%），通過LC-MS和HPLC法確定肽段分子量和純度（委托上海生工公司完成）。

1.2.4 DPP-IV抑制率測定 參考張穎的方法[16]，采用發(fā)色底物法測定DPP-IV抑制率。所有試劑和樣品均在Tris-HCl（100 mmol/L，pH8.0）緩沖液中稀釋。將25 μL樣品與25 μL底物（1.6 mmol/L）加入96孔酶標板，在37 ℃下孵育10 min，加入50 μL DPP-IV（8 U/L），于37 ℃反應60 min后加入100 μL醋酸鈉緩沖液（1 mol/L，pH4.0）終止反應，使用酶標儀在405 nm下檢測吸光值。測定不同濃度下樣品的抑制率，并繪制樣品濃度-抑制率函數圖，確定IC50值（DPP-IV抑制率達到50%時的樣品濃度）。

式中：A陰性對照，以Tris-HCl代替樣品；B陰性空白對照，以Tris-HCl代替DPP-IV；C樣品在405 nm處的吸光度；D樣品空白對照，以Tris-HCl代替DPP-IV。

1.2.5 肽段作用機理分析

1.2.5.1 肽段抑制模式分析 采用Lineweaver-Burk方法研究了不同樣品的抑制模式。底物濃度范圍為0.1～2.0 mmol/L（最終濃度），樣品濃度取IC50值的1/8和1/16，以不含抑制肽的樣品作為陰性對照，于37 °C反應30 min后，使用酶標儀測定405 nm處的吸光值[3]。

1.2.5.2 分子對接探究肽段與DPP-IV作用位點與作用方式 利用Discovery Studio2019軟件receptorligand Interactions模塊中的 Ligand Interactions（Interaction options），分析肽段與DPP-IV作用位點和相互作用方式，包括氫鍵、靜電作用和疏水相互作用，并在analyze ligand poses條目下分析詳細作用殘基。

1.2.6 網絡藥理學分析

1.2.6.1 肽段對糖尿病潛在作用靶點預測 利用Swiss Target Prediction網站（http://www.swisstargetprediction.ch/）預測篩選所得肽段在體內的潛在作用目標。由Genecards數據庫（https://www.genecards.org/）獲取糖尿病相關基因靶點，關鍵詞設定為“diabetes”。繪制維恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），獲取所選肽段與糖尿病作用靶點的交集。

1.2.6.2 PPI網絡構建 將肽段對糖尿病的潛在作用靶點上傳到STRING網站（https://cn.string-db.org/），屬性選擇“Homo sapiens”，置信度>0.7，獲得蛋白與蛋白相互作用網絡（Protein-protein interactions，PPI）。使用Cytoscape3.9.0軟件修飾網絡，CytoNCA插件計算網絡拓撲參數，度值（Degree）用于評價節(jié)點在網絡中的重要性，度值越大，說明節(jié)點在網絡中越重要。

1.2.6.3 GO分析及KEGG通路富集分析 通過GO分析及KEGG通路富集分析進一步研究肽段對糖尿病保護作用的各種機制。將所選肽段的抗糖尿病作用靶點導入DAVID（https://david.nci fcrf.gov/home.jsp）平臺，限定物種為“Homo sapiens”，P<0.05[17?18]。保存富集結果，利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化分析。

1.3 數據處理

使用Excel2016處理DPP-IV活性驗證數據，實驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 駝乳LF模擬酶切

BIOPEP平臺模擬酶切駝乳LF序列生成肽段，利用Peptide Ranker網站對肽段進行生物活性可能性評分，從中篩選活性評分大于0.5的肽段，結果如表1。DPP-IV抑制肽的構效關系研究表明，大多數DPP-IV抑制肽結構中具有脯氨酸（Pro）和丙氨酸（Ala），尤其是肽段N端第二位是Pro和Ala時，一般具有DPP-IV抑制作用，此外疏水性氨基酸（Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr 或 Trp）存在可增強與DPP-IV熱點處殘基的相互作用，從而使肽段抑制作用增強[19?21]。根據DPP-IV抑制肽的特征，在評分大于0.5的肽段中篩選符合DPP-IV抑制特征的肽段進行下一步分析。

表1 模擬酶切結果Table 1 Simulation of digestion results

2.2 DPP-IV抑制肽的篩選

通過Peptide Ranker及DPP-IV抑制特征初步選定30條短肽（表2），將30條肽段在BIOPEP-UWM和PeptideDB等多肽數據庫進行比對，有8條為已報道過的活性肽，其中7條是DPP-IV抑制肽。

表2 篩選肽段Peptide ranker評分Table 2 Peptide ranker score for screening peptides

為進一步篩選DPP-IV抑制肽，使用Discovery Studio2019軟件對22條肽段進行半柔性分子對接。IPI為迄今為止發(fā)現(xiàn)的抑制作用最強的DPPIV抑制肽，以IPI作為對照，最佳對接姿勢打分結果見表3。對接結果顯示IPI “-CDOCKER_ENERGY”打分60.1427 kcal/mol，這與Wang等報道IPI打分結果（66.8307 kcal/mol）相近[22]。這22條肽段中有18條肽段-CDOCKER_ENERGY打分高于IPI，其中EACAF打分最高為102.042 kcal/mol，排名前五的肽段中，DAF與FGR兩者“-CDOCKER_ENERGY”打分相近，但GAF“-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY”評分低于IPI，因此在排名靠前的肽段中選擇EACAF、IWKL、GPQY和FGR四條肽段進行人工合成。

表3 分子對接打分表Table 3 Molecular docking scoring

2.3 肽段抑制活性驗證

采用固相合成法對EACAF、GPQY、IWKL和FGR四條肽段進行合成，肽段的純度和分子量由HPLC和LC-MS分析驗證，結果如圖1所示，四條肽段的純度都大于98%，分子量大小分別為539.60、463.48、558.70和378.42。測定肽段IC50值判斷肽段對DPP-IV抑制效果，IC50值越低，說明肽段對DPP-IV抑制效果越好。四條肽段中GPQY和EACAF對DPP-IV具有明顯的抑制作用，根據抑制率函數圖（圖2）計算得IC50值分別為348.27±16.11和1024.89±19.67 μmol/L。IWKL在濃度為2 mg/mL時抑制率僅有10.47%，抑制作用不明顯，而FGR在2 mg/mL并未表現(xiàn)出抑制作用。表4列出了幾種已報道的DPP-IV抑制肽，本研究所得GPQY抑制率與LPLPL相近[20]，高于MPPLP、LP、ADF、GPFPILV[20,23]；肽段EACAF抑制率略低，但仍高于Zhao等[24]由雞蛋蛋白中獲得的三肽ADF和MIR。對四條肽段的體外活性驗證符合先前研究結果，EACAF和GPQY兩條肽段N端的第二位分別為丙氨酸（A）和脯氨酸（Pro），根據對DPP-IV構效關系的研究，具有這類結構的肽段一般具有DPP-IV抑制活性[21,25]。

圖1 肽段HPLC圖和LC-MS圖Fig.1 HPLC spectrum and LC-MS spectrum of peptides

圖2 GPQY（A）和EACAF（B）的DPP-IV抑制活性Fig.2 DPP-IV inhibitory activity of GPQY (A) and EACAF (B)

表4 已報道的DPP-IV抑制肽的IC50值Table 4 IC50 values of the reported DPP-IV inhibitory peptides

2.4 肽段與DPP-IV的作用機理

2.4.1 肽段抑制模式分析 采用Lineweaver-Buck法對EACAF和GPQY兩條肽段進行抑制模式分析，結果如圖3所示：圖中直線與Y軸的交點為最大初速Vm的倒數（1/Vm），與X軸的交點為Km（反應速度達到最大反應速度Vm一半時的底物濃度）的倒數（?1/Km）。GPQY表現(xiàn)為競爭性抑制模式，不同濃度線性回歸曲線相較于Y軸正半軸，隨著肽段濃度增大，最大初速度Vm保持不變，Km值增大。研究表明，Pro在DPP-IV抑制肽N端序列中所處位置的不同會直接影響其抑制模式，當Pro處于N端第二位時，由于其具有DPP-IV底物的類似結構，所以一般會與底物競爭性結合DPP-IV活性位點[21,30]，如IPIQY、IPML、PYPY、YPYY、IPSK、EPVK和YPLR等均表現(xiàn)為競爭性抑制模式[3,28]。GPQY肽段N端第二位為Pro，與DPP-IV底物Gly-Pro-pNA具有相似的結構，說明GPQY可能與天然底物競爭性結合到DPP-IV的活性位點，從而發(fā)揮其生物效應。EACAF不同濃度線性回歸曲線相交于第二象限，表現(xiàn)為競爭/非競爭混合型抑制模式，這意味著該肽段在抑制DPP-IV過程中是通過結合DPP-IV催化活性中心以及活性中心以外的點兩種方式共同起作用[16,30]。在本研究中，相比EACAF，競爭性抑制肽段GPQY對DPP-IV表現(xiàn)出更好的抑制效果。

圖3 DPP-IV抑制肽 GPQY（A）與EACAF（B）的Lineweaver-Buck雙倒數圖Fig.3 Lineweaver-Buck double inverse plot of DPP-IV inhibitory peptide GPQY (A) and EACAF (B)

2.4.2 分子對接分析相互作用方式 為了解肽段與DPP-IV分子間相互作用力，將2.2中分子對接結果進行深入分析，結果如圖4和表5所示。圖4展示了IPI（對照）、GPQY、EACAF與DPP-IV的分子對接圖。由分子對接3D結構圖中可看出EACAF和GPQY都能結合到DPP-IV的活性空腔內。小分子與大分子間結合程度強弱通常取決于對接過程中自由能的變化，所以兩者之間的相互作用力對結合物的親和程度和結合模式都有很大影響，如氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用往往是有助于復合物結合的相互作用力[15]。從表5中可看到，GPQY與DPPIV殘基形成9個氫鍵，3個疏水作用和3個靜電作用；EACAF與DPP-IV殘基形成11個氫鍵，1個疏水作用和6個靜電相互作用，GPQY和EACAF與DPP-IV的這三種作用力有助于兩者結合物的結構穩(wěn)定。

表5 肽段與DPP-IV對接最佳構象相互作用力Table 5 Optimal conformational interaction force of peptide docking with DPP-IV

圖4 分子對接模式圖Fig.4 Molecular docking pattern diagram

DPP-IV包含一個洞穴狀的活性中心，抑制劑通常與空腔中疏水活性口袋S1和帶電的S2 活性口袋結合來競爭性地占據該活性中心。S1口袋由催化三聯(lián)Ser630-Asp708-His740以及Tyr 547、Tyr 631、Trp 659、Val 656、Tyr 662、Tyr 666、Asn 710和Val 711組成[24]，S2口袋包括Arg 125、Glu 205、Glu 206、Val 207、Ser 209、Arg 358和Phe 357[31?32]。由表5可知，GPQY能與S1中的Tyr 547、Ser 630、Tyr 631、Tyr 662、His 740和Val 711形成了氫鍵和疏水相互作用，與S2中Glu 205、Glu 206和Arg 125形成了靜電相互作用和疏水相互作用。EACAF與S1中Ser 630、Tyr 631、Tyr 662和Tyr 666形成氫鍵和靜電相互作用，與S2中Arg 125、Glu 205、Glu 206、Ser 209和Phe 357形成氫鍵、疏水作用和靜電相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)肽段與S1口袋形成疏水作用可以使肽段與酶結合更穩(wěn)定，從而提高肽段的抑制率，對S2口袋中的疏水作用可以提高親和力[18,32]。GPQY與S1口袋中活性殘基形成個3個疏水作用，這三個疏水作用對GPQY抑制DPPIV活性起到關鍵作用；EACAF未在S1口袋中形成疏水作用。雖然GPQY與EACAF表現(xiàn)為不同的抑制模式，但兩者有一些相同的結合位點（Arg 125、Glu 205、Glu 206、Ser 630、Tyr 631、Tyr 662和Asp 663）與這些位點的結合可能有助于在與底物共存的體系中阻礙底物和酶活性部位的接觸[16]。

2.5 網絡藥理學分析

2.5.1 GPQY作用靶點預測 利用Swiss Target Prediction網站，預測到GPQY在體內有100個潛在作用靶點，其類型分布如圖5A所示。由Genecards數據庫收集到10776個糖尿病相關基因靶點，將GPQY與糖尿病靶點導入Venn diagrams軟件繪制韋恩圖（圖5B），得到GPQY與糖尿病共有的82個潛在作用靶點，GPQY可能通過這82個潛在靶點作用與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展過程。

圖5 GPQY潛在作用靶點分布（A）和GPQY與糖尿病交集靶點韋恩圖（B）Fig.5 Distribution of potential targets of GPQY action (A) and Venn diagram of GPQY and diabetes intersection targets (B)

2.5.2 PPI網絡構建 將82個靶點上傳至STRING平臺，生成PPI網絡，將其導入Cytoscape3.9.0軟件進一步修飾，結果如圖6所示。PPI網絡有63個節(jié)點、122個邊，節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白與蛋白間相互作用，節(jié)點大小表示度值（Degree），度值越高，說明靶點在網絡中的位置越重要，一般度值大于其平均值，可認為該靶點為核心靶點[33]，該網絡平均度值為3.873，根據度值大小排序，篩選到25個核心靶點（表6），推測這些靶點為GPQY作用于糖尿病的關鍵靶點。從PPI網絡圖中可看到STAT3、MMP9、SRC、MAPK1、PLG節(jié)點較大，推測這些靶點在GPQY防治糖尿病過程中起到關鍵作用。

圖6 GPQY作用靶點PPI網絡圖Fig.6 PPI network diagram of GPQY action targets

表6 核心靶點拓撲參數Table 6 Core targets and topological parameters

STAT3是轉錄因子家族成員之一，信號轉導和轉錄激活因子（STATs）是脊椎動物發(fā)育和成熟組織功能的成熟調節(jié)劑，激活STAT3會導致促炎因子表達增加[34]。研究表明，STAT3的磷酸化可調節(jié)促炎因子的表達水平，抑制STAT3蛋白磷酸化可減弱CD36的表達，進而抑制高脂飲食的糖尿病小鼠動脈粥樣硬化病變的發(fā)展[35]。抑制STAT3可改善糖尿病大鼠肝臟炎癥及糖代謝功能障礙[36]。MAPK屬促分裂原活化蛋白激酶，是細胞傳遞應激信號的關鍵激酶，具有較強的分化作用，在胰島素抵抗中，常常伴隨慢性炎癥反應，MAPK類蛋白對多種炎性細胞因子非常敏感，通過降低其表達水平可減輕炎性反應，因此在2型糖尿病炎癥反應中也起到了重要作用[37]。李芳等[38]發(fā)現(xiàn)，MAPK與糖尿病大鼠的心肌纖維化有關，抑制MAPK1/3的表達可以改善糖尿病大鼠心肌纖維化。MMP9主要參與了血管的再生及炎性反應等過程，其可破壞細胞組織、產生炎性反應而發(fā)揮促炎作用。劉坤等[39]發(fā)現(xiàn)MMP9的含量直接影響糖尿病腎病的發(fā)生，高糖使MMP9蛋白的表達下調，從而影響其所占比例失衡，也加劇了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

2.5.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析 為了進一步探究GPQY防治糖尿病的潛在作用機制，利用DAVID數據庫對交集靶點進行了GO分析和KEGG富集分析。GO分析包括三個方面：生物過程（Biological process, BP）、細胞組分（Cellular component, CC）和分子功能（Molecular function, MF）。GO富集分析得到170個BP，52個CC和66個MF，根據P<0.05篩選出前10個條目進行可視化，如圖7B所示。BP結果顯示，這些靶點主要參與到蛋白水解、膠原蛋白分解代謝和細胞溶質鈣離子濃度的正向調節(jié)等生物過程。KEGG富集到57條信號通路，根據P<0.05對前20條通路可視化，這些靶點涉及神經活性配體-受體相互作用、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、IL-17信號通路、松弛素信號通路、細胞凋亡、癌癥的途徑、鈣離子信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路和脂質和動脈粥樣硬化等信號通路，具體如圖7A。

圖7 GPQY與糖尿病相關的82個靶點KEGG富集分析（A）及GO富集分析（B）Fig.7 KEGG enrichment analysis (A) and GO enrichment analysis (B) of 82 targets associated with GPQY and diabetes

糖尿病是持續(xù)炎癥和動脈粥樣硬化相關的慢性疾病。IL-17是一種促炎因子，與胰島細胞的破壞密切相關，其通過激活NF-κB信號通路引起TNF-α等促炎因子釋放，增加抑制胰島素信號傳導，從而促進胰島素抵抗[40]。Rajendran等[41]證明IL-17可在在T1DM和T2DM胰島β和α細胞中表達，并且在T2MD患者中表達水平更高。TNF信號通路在細胞增殖、分化、凋亡、免疫調節(jié)和炎癥誘導等各種生理病理過程中發(fā)揮著重要作用，較高水平的TNF-α通過絲氨酸磷酸化加速胰島素對脂肪細胞和外周組織的抵抗，從而破壞有助于發(fā)展糖尿病的胰島素信號[18,42]。細胞凋亡在胰腺的正常生理和糖尿病的發(fā)病機制中起著至關重要的作用，GLP-1已被證明具有抗凋亡特性，并且在受到各種凋亡刺激物的攻擊時能夠促進胰腺β細胞的存活[43]。由駝乳LF衍生的DPP-IV抑制肽GPQY可延長DPP-IV對GLP-1的降解，從而抑制β細胞凋亡，同樣DPP-IV抑制劑也被證明具有抗凋亡活性，可減輕糖尿病相關的細胞和組織損傷[44]。糖尿病往往伴隨著一系列并發(fā)癥，KEGG通路富集表明，除IL-17信號通路、細胞凋亡、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路外，這些靶點在神經活性配體-受體相互作用、腎素-血管緊張素系統(tǒng)兩個通路中顯著富集，推測GPQY可通過作用于核心靶點對糖尿病并發(fā)癥如神經病變，高血壓等發(fā)揮協(xié)同作用。

3 結論

本研究以駝乳LF為研究對象，結合模擬酶切、活性預測、分子對接以及人工合成驗證快速篩選驗證得到2條DPP-IV抑制肽GPQY和EACAF，并對其抑制模式和作用機理進行了分析。隨后選擇抑制作用較強的GPQY進行網絡藥理學分析，探討了其對糖尿病的潛在作用機制。分析發(fā)現(xiàn)GPQY通過作用于STAT3、MMP9、SRC、MAPK1等核心靶點，參與IL-17信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、細胞凋亡代謝途徑抑制炎癥因子的分泌，參與抗炎反應，抑制β細胞凋亡，改善胰島素抵抗對糖尿病發(fā)揮作用。此外，還發(fā)現(xiàn)GPQY通過調節(jié)神經活性配體-受體相互作用、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、松弛素信號通路、癌癥的途徑和脂質和動脈粥樣硬化等信號通路對糖尿病并發(fā)癥，如心血管疾病、神經病變、糖尿病腎病、視網膜病變和癌癥發(fā)揮協(xié)同作用。這些結果將為駝乳蛋白肽作為功能性食品成分預防和治療糖尿病提供一些見解，但本研究仍存在一些不足，網絡藥理學是基于大數據背景進行的預測，具體機制仍需進一步通過實驗驗證。