甘 斌李華南李 松章曉云陳 宇顧 兵張?jiān)崎_劉永乾邵子晨

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,南昌 330006;3.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330013)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis,GA)是最常見的由晶體誘發(fā)的自身炎癥性疾病之一,其特征是單鈉尿酸鹽(monosodium urate,MSU)晶體沉積于關(guān)節(jié)和(或)非關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中誘發(fā)[1]。全球患病率在1%～4%之間[2]。隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)提高和飲食習(xí)慣的改變,我國(guó)GA的患病率呈顯著上升趨勢(shì),患病率數(shù)據(jù)顯示已達(dá)1136.24/100 000[3],且愈趨于年輕化[4]。一般來(lái)說(shuō),根據(jù)機(jī)體對(duì)MSU晶體炎癥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)可分為四期[5]:持續(xù)性高尿酸血癥期、劇烈疼痛的急性炎癥性關(guān)節(jié)炎期(GA發(fā)作期)、無(wú)痛無(wú)癥狀期(臨界期)以及MSU晶體引起的持續(xù)性炎癥期(慢性GA)和痛風(fēng)石(Tophi)期,其中GA發(fā)作期在臨床中最為常見[6]。

古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為病之總者為病,而一病總有數(shù)證。94版《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[7]根據(jù)GA階段性本質(zhì)的癥狀集合將其概括為四證:濕熱蘊(yùn)結(jié)證、痰濁阻滯證、瘀熱阻滯證、肝腎陰虛證。本課題組臨床觀察發(fā)現(xiàn)濕熱證GA占比73.14%[8],這可能與江西人體質(zhì)多屬濕熱質(zhì)相關(guān)。江西省位于北回歸線附近,屬長(zhǎng)江中下游地區(qū),地形南高北低,雨量偏多,日照充足,為亞熱帶濕潤(rùn)氣候;此外江西人飲食重油重辣,多食油脂等厚味之品,長(zhǎng)此已久,故江西人體質(zhì)偏濕熱質(zhì)。既往濕熱內(nèi)傷伏邪理論在臨床學(xué)術(shù)研究中占首要,余邪伏于里遇誘因(外邪)而發(fā)-外邪入里、內(nèi)濕為合,這也是濕熱證最基礎(chǔ)的病機(jī)[9]。

目前西醫(yī)臨床一線治療急性期GA主要口服皮質(zhì)內(nèi)固醇、非甾體抗炎藥或秋水仙堿等對(duì)癥治療[5],這些藥物可迅速控制疼痛并抑制炎癥,但使用時(shí)普遍受腎功能不全和心血管等諸多合并癥的限制[10],此外還存在胃腸道和腎毒性等副作用。中藥自古以來(lái)就用于GA治療[11],從單味中藥或中藥組方中分離出的部分化學(xué)成分具有多靶點(diǎn)、低毒等特點(diǎn),在GA防治中展示出良好前景[12]。動(dòng)物模型是開展藥物研究的重要載體,將“病”和“證”相結(jié)合構(gòu)建接近人體濕熱證GA(急性發(fā)作期GA)病證結(jié)合動(dòng)物模型更是深入研究濕熱證參與GA急性發(fā)作的病理生理機(jī)制及中藥藥效評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)[13]。盡管單獨(dú)的“濕熱證”模型和“GA”模型造模方式繁多,但尚無(wú)公認(rèn)合理成熟的濕熱證GA病證結(jié)合動(dòng)物模型造模方法?；诖?本實(shí)驗(yàn)以雄性SD大鼠為造模對(duì)象,從脂代謝和炎癥反應(yīng)出發(fā)探討兩種不同濕熱證GA病證結(jié)合模型造模差異,以期為篩選穩(wěn)定且具備可重復(fù)性的濕熱證GA病證結(jié)合大鼠模型提供客觀數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠44只,6周齡,體重180～200 g,由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)中心提供[SCXK(贛)2018-0001],飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)中心[SYXK(贛)2017-0004]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程通過(guò)了江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(JZSYDWLL-20200901),并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則。于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)采用晝夜間斷12 h/12 h照明方式飼養(yǎng),溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度(55±3)%。所有大鼠均由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)中心的工作人員檢疫并適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水、進(jìn)食,同時(shí)每3 d更換高溫滅菌后的玉米芯墊料。

1.2 主要試劑與儀器

正常普通基礎(chǔ)飼料:成分為玉米30%,小麥25.5%,豆粕20%,酪蛋白10%,魚粉5%,蜜糖酵母2.5%,油2.5%,磷酸氫鈣2%,生長(zhǎng)預(yù)混料1%,石粉1%,食鹽0.3%,氯化膽堿0.2%;高脂高糖飼料:在上述正常普通基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上添加糖、黃油和魚粉,具體成分為58.9%普通基礎(chǔ)飼料、黃油15%,綿糖15%、蛋黃粉5%,魚粉5%,膽固醇1%,豬膽鹽0.1%。

TG、TC、LDL-C、HDL-C(批號(hào)分別為:20210118、20210115、20210118、20210304,南京建成生物工程研究所);NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6(批號(hào)分別為:YX-201406R、 YX-091203R、 YX-201407R、 YX-091206R,上海赫澎生物科技有限公司);紅星二鍋頭白酒(批號(hào):20160424,北京紅星股份有限公司);冠生園蜂蜜(批號(hào):GB14963,上海冠生園蜂制品有限公司);鼠傷寒沙門菌(批號(hào):ATCC14028,美國(guó)菌株保藏中心);戊巴比妥鈉(批號(hào):SIGMA-P3761,美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

人工氣候箱(批號(hào):MGC-350-HP-2,上海一恒科學(xué)儀器有限公司);全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(批號(hào):3001-1950,美國(guó)Thermo公司);高速冷凍離心機(jī)(批號(hào):C2500-RC,美國(guó)Labnet公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSU混懸液的配置

向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU混懸液是濕熱證GA病證結(jié)合模型中“GA”模型誘導(dǎo)的關(guān)鍵。按照黃火高[14]的方法并結(jié)合MSU晶體在不同pH值環(huán)境下的形態(tài)改變[15]對(duì)其配制方法進(jìn)行改良,具體步驟如下:將4.5 mL NaOH溶液(濃度:0.5 moL/L)加入400 mL超純水中,加入2 g尿酸,用磁力攪拌器緩慢加熱并不斷攪拌,直至尿酸完全溶解。隨后將溫度保持在60℃用1 moL/L的HCl溶液調(diào)pH=7.2,室溫冷卻后置于4℃冰箱過(guò)夜冷藏,隔日濾去上清,盛入蒸發(fā)皿中經(jīng)水浴鍋干燥,干燥后用碾缽碾成細(xì)末并通過(guò)250 μm孔徑金屬網(wǎng)篩過(guò)篩,經(jīng)高溫高壓滅菌后用無(wú)菌EP管收集。以無(wú)菌生理鹽水配成濃度20 mg/mL MSU混懸液,使用前置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30 min,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

健康SD雄性大鼠44只,經(jīng)由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)中心的工作人員檢疫并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:正常對(duì)照組、GA對(duì)照組、模型組A、模型組B。除正常對(duì)照組和GA對(duì)照組10只外其余各組每組12只(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中大鼠死亡率評(píng)估增加20%)。

正常對(duì)照組:在屏障實(shí)驗(yàn)室恒溫恒濕環(huán)境內(nèi)普通飼料喂養(yǎng),自由飲水21 d。

GA對(duì)照組:喂飼方式同正常對(duì)照組,第18天以大鼠踝關(guān)節(jié)外側(cè)兩骨突出為注射定位點(diǎn),將抽取了MSU混懸液注射器配6號(hào)注射器針頭,針頭斜面朝關(guān)節(jié)腔沿脛骨前肌內(nèi)側(cè)向下插至關(guān)節(jié)腔,有落空感時(shí)停止進(jìn)針且回抽無(wú)血后注入50 μL MSU溶液(濃度:20 mg/mL)以對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)囊鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn),誘導(dǎo)GA模型。

模型組A:第一階段即高脂高糖和高溫高濕階段制備濕熱證模型,給大鼠飼以高脂高糖飲食,并在高脂高糖飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,用200 g/L蜂蜜水自由飲用,且白酒1 mL/100 g和豬脂1.5 mL/100 g交替灌服,共持續(xù)14 d。從第8天開始每日上午8:00放入人工氣候箱中,溫度為(32±2)℃,相對(duì)濕度95%,8 h,共持續(xù)14 d;第二階段制備GA“病”模型,在第18天造模同GA對(duì)照組。通過(guò)上述復(fù)合多因素造模方式制備濕熱證GA病癥結(jié)合大鼠模型。

模型組B:第一階段即高脂高糖階段聯(lián)合生物因素干預(yù)制備濕熱證模型,給大鼠飼以高脂高糖飲食,并在高脂高糖飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,加用200 g/L蜂蜜水自由飲用,且白酒1 mL/100 g和豬脂1.5 mL/100 g交替灌服,共持續(xù)14 d。于第10天灌服鼠傷寒沙門氏菌液(10 mL/kg,每毫升109個(gè)),第15天加強(qiáng)一次(5 mL/kg);第二階段制備GA“病”模型,在第18天造模同GA對(duì)照組。通過(guò)上述復(fù)合多因素造模方式制備濕熱證GA病癥結(jié)合大鼠模型。

1.3.3 觀測(cè)指標(biāo)

(1)一般情況觀測(cè)及統(tǒng)計(jì)造模后各組死亡率

確定以第1、8、15、21天同一時(shí)刻對(duì)大鼠表征進(jìn)行觀察,包括:①精神狀態(tài);②飲食飲水;③毛色;④大小便等情況;最后造模結(jié)束統(tǒng)計(jì)大鼠死亡率。

(2)踝關(guān)節(jié)腫脹的測(cè)定

周長(zhǎng)法:使用縛線測(cè)量注射MSU混懸液前0 h及造模后4、8、12、24、48及72 h后大鼠踝關(guān)節(jié)劃線部位的周長(zhǎng)。以造模前后周長(zhǎng)的差值作為腫脹度變化,即腫脹度=造模后周長(zhǎng)-造模前周長(zhǎng)。

(3)大鼠步態(tài)分析

①步態(tài)改變分級(jí):在造模后,請(qǐng)1名骨科醫(yī)生(不知分組情況)觀察大鼠步態(tài)的改變并按步態(tài)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分:正常步態(tài)為0級(jí);輕度跛行,右足稍呈彎曲態(tài)行走為1級(jí);中度跛行,右足彎曲明顯,輕挨地面行走為2級(jí);重度跛行,右足脫離接觸面甚至三足步態(tài)行走為3級(jí)。

②炎癥指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):正常為0級(jí),記作1分;關(guān)節(jié)皮膚出現(xiàn)紅斑,輕度腫脹,骨性標(biāo)志可見為Ⅰ級(jí),記作2分;腫脹皮膚出現(xiàn)褶皺,骨性標(biāo)志消失,但腫脹未跨出關(guān)節(jié)部位為Ⅱ級(jí),記作3分;關(guān)節(jié)皮膚呈暗紅且關(guān)節(jié)以外肢體也出現(xiàn)腫脹為Ⅲ級(jí),記作4分。

(4)血清制備,脂代謝指標(biāo)和炎癥因子檢測(cè)

造模后第21天,各組大鼠禁食不禁水12 h,3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈采血,將采血管略傾斜靜置2 h,3000 r/min × 15 min離心,收集上層血清于-80℃中保存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒檢測(cè)血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、IL-1β、IL-6、TNFα、NF-κB的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,運(yùn)用單因素方差分析對(duì)各組間統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。組間多重比較,若滿足方差齊性采用LSD法檢驗(yàn),反之則采用Dunnett’sT3檢驗(yàn);以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01表示具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用Graphpad Prism 8.0.2軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察

正常對(duì)照組:喂養(yǎng)期間精神狀態(tài)好,活動(dòng)正常,毛色柔順亮澤,雙目炯炯有神,體重增加平穩(wěn),飲食、大小便均正常;GA對(duì)照組:由于前期未參與高糖高脂飼料和濕熱證階段造模,故表征均正常,注射MSU后首先出現(xiàn)煩躁不安并用舌頭舔舐右足,右后肢彎曲明顯,輕挨地面行走甚至抬離地面,隨后精神萎靡,蜷縮在角落;模型組A和模型組B:大鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)力減弱,毛發(fā)粗糙疏松、毛色暗淡,前7 d體重逐漸增加隨后增勢(shì)緩慢且飲食減少尤其在放入人工氣候箱后大部分出現(xiàn)精神倦怠、嗜睡,毛發(fā)枯槁潮濕掉毛,體重及飲食均減少,大便較正常組量少甚至不成型、溏便。在第18天注射MSU后合并GA對(duì)照組造模癥狀。與模型組A相比,模型組B大鼠在灌服鼠傷寒沙門氏菌后大鼠體重不增反減,大便糞質(zhì)稀溏味臭。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠死亡及其解剖分析

納入的44只大鼠,其中有4只(模型組A死亡1只,模型組B死亡3只)大鼠在造模過(guò)程中死亡,模型組A死亡率8.3%,模型組B死亡率25%。

2.3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定比較

由表1可見,組內(nèi)比較:正常對(duì)照組在4 h腫脹程度達(dá)到高峰,隨后腫脹程度逐漸回落,到72 h基本恢復(fù),可能是由于注射生理鹽水引起的非病理性腫脹,后期生理鹽水被自體吸收。GA對(duì)照組、模型組A和模型組B在4、8、12 h腫脹程度逐漸增大,并于12 h達(dá)到高峰,隨后腫脹程度逐漸回落。組間比較:與正常對(duì)照組比較,造模后4、8、12、24、48、72 h,GA對(duì)照組、模型組A和模型組B的踝關(guān)節(jié)腫脹明顯增大(P＜0.01)。這與前人研究相一致[16-17],提示造模成功。模型組A在不同時(shí)間點(diǎn)與模型組B比較均不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)法腫脹度測(cè)量變化(±s,mm)Table 1 Measure the changes of ankle joint swelling degree at different time points in each group of rats based on the circumference method

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)法腫脹度測(cè)量變化(±s,mm)Table 1 Measure the changes of ankle joint swelling degree at different time points in each group of rats based on the circumference method

注:與正常對(duì)照組相比, *P＜0.05, **P＜0.01;與GA對(duì)照組相比, #P＜0.05。Note. Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with the GA group, #P＜0.05.

組別Groups n 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組Control group 10 0.24±0.06 0.16±0.03 0.09±0.04 0.08±0.03 0.10±0.03 0.07±0.02 GA對(duì)照組GA group 10 2.38±0.35** 3.47±0.88** 4.47±0.98** 3.89±0.62** 3.07±0.54** 1.96±0.43**模型組A Model group A 11 2.28±0.30** 3.48±0.55** 4.88±1.07** 4.28±0.88** 3.38±0.67* 2.89±0.49**#模型組B Model group B 9 2.22±0.41** 3.52±0.35** 5.22±0.64** 4.97±0.57**# 3.66±0.65** 2.74±0.62**#

2.4 各組大鼠步態(tài)分級(jí)和炎癥指數(shù)評(píng)分比較

由表2可見GA對(duì)照組、模型組A和模型組B大鼠步態(tài)等級(jí)大部分被評(píng)為Ⅲ級(jí)。由圖1可見,與正常對(duì)照組比較,GA對(duì)照組、模型組A和模型組B炎癥指數(shù)存在顯著差異性(P＜0.01),說(shuō)明“GA”病模型復(fù)制成功。且進(jìn)一步說(shuō)明大鼠步態(tài)分級(jí)和炎癥指數(shù)的改變主要與MSU注射后引發(fā)右踝關(guān)節(jié)的炎癥改變相關(guān)。

圖1 各組大鼠注射MSU混懸液后關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)分柱狀圖Figure 1 The score of ankle joint inflammation index in each group after inject MSU suspension

表2 注射MSU混懸液后各組大鼠踝關(guān)節(jié)步態(tài)分級(jí)情況Table 2 Ankle gait classification of rats in each group after inject MSU suspension

2.5 各組大鼠脂代謝指標(biāo)表達(dá)比較

由表3可知,模型組A和模型組B的TG、TC和LDL-C均高于正常對(duì)照組和GA對(duì)照組,HDL-C則顯著低于正常對(duì)照組和GA對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組A相比,模型組B的TG和HDL-C趨勢(shì)有所升高,TC和LDL-C趨勢(shì)降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠血脂代謝改變情況(±s,mmol/L)Table 3 Changes of blood lipid metabolism in rats in each group

表3 各組大鼠血脂代謝改變情況(±s,mmol/L)Table 3 Changes of blood lipid metabolism in rats in each group

注:與正常對(duì)照組相比, *P＜0.05, **P＜0.01;與GA對(duì)照組相比, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with the GA group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 甘油三酯TG總膽固醇TC低密度脂蛋白LDL-C高密度脂蛋白HDL-C正常對(duì)照組Control group 10 0.71±0.21 1.81±0.33 0.48±0.16 1.10±0.48 GA對(duì)照組GA group 10 0.92±0.20 1.93±0.29 0.53±0.27 1.06±0.50模型組A Model group A 11 2.13±0.18**## 2.62±0.55**# 0.98±0.31**## 0.38±0.28**##模型組B Mdel group B 9 2.30±0.34**## 2.49±0.36*# 0.78±0.12* 0.41±0.33**##

2.6 各組大鼠免疫炎癥因子表達(dá)比較

由表4可知,與正常對(duì)照組相比,GA對(duì)照組、模型組A和模型組B的NF-κB、IL-1β、IL-6和TNFα水平均顯著升高(P＜0.01),這提示模型復(fù)制成功。與GA對(duì)照組相比,模型組A的NF-κB和TNFα水平有所升高(P＜0.05),模型組B的NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α水平有所升高(P＜0.05),這提示兩種病證結(jié)合模型造模方式或可刺激機(jī)體產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)。與模型組A相比,模型組B的IL-1β、IL-6和TNF-α水平有所升高(P＜0.05),這或許可以作為兩種病證結(jié)合模型炎癥反應(yīng)量化指標(biāo)。

表4 各組大鼠NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α改變情況(±s,pg/mL)Table 4 The level of NF-κB, IL-1β, IL-6, TNF-α in rats of each group

表4 各組大鼠NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α改變情況(±s,pg/mL)Table 4 The level of NF-κB, IL-1β, IL-6, TNF-α in rats of each group

注:與正常對(duì)照組相比, *P＜0.05, **P＜0.01;與GA對(duì)照組相比, #P＜0.05, ##P＜0.01;與模型組A相比, aP＜0.05, aaP＜0.01Note. Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with the GA group, #P＜0.05, ##P＜0.01. Compared with the model group A, aP＜0.05, aaP＜0.01.

組別Groups n 核因子-κB NF-κB白細(xì)胞介素 1β IL-1β白細(xì)胞介素-6 IL-6腫瘤壞死因子-α TNF-α正常對(duì)照組Control group 10 391.69±22.99 46.13±10.68 32.76±5.81 4.86±1.26 GA對(duì)照組GA group 10 680.10±29.07** 361.50±8.58** 143.1±10.67** 58.81±6.53**模型組A Model group A 11 738.74±49.33**# 366.70±12.48** 146.5±11.09** 64.78±5.93**#模型組B Model group B 9 741.15±52.59**# 430.00±12.50**##aa 168.9±6.61**##aa 71.26±4.44**##a

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《素問·至真要大論篇》指出:“諸濕腫滿,皆屬于脾”[18];《素問·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》指出:“中央生濕……其藏為脾”[18],可見脾與濕密切相關(guān);清代薛生白言“濕熱乃陽(yáng)明太陰同病也”,以上均說(shuō)明濕熱證病位多責(zé)之于脾胃[19]。濕熱證病程多纏綿反復(fù),系飲食內(nèi)傷致脾失健運(yùn),水液運(yùn)化機(jī)能失職,導(dǎo)致水液留滯、內(nèi)濕內(nèi)生,復(fù)感外邪,內(nèi)外相引,故病濕熱[20]。這也和《素問·奇病論篇》中:“甘者,肥美之所發(fā)”,指出甘為濕之應(yīng),常食膏粱厚味,易生濕蘊(yùn)熱,病因病機(jī)相吻合?？偨Y(jié)以上對(duì)濕熱證病因病機(jī)的論述,在本實(shí)驗(yàn)中模型組A和模型組B均通過(guò)自由飲用蜂蜜水,豬脂、白酒隔日灌服14 d,以損其脾胃,復(fù)刻脾失健運(yùn),水液運(yùn)化失職,導(dǎo)致內(nèi)濕自生。模型組A給予高溫高濕外環(huán)境,模型組B通過(guò)外邪(鼠傷寒沙門氏菌)從口鼻而入,模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因,內(nèi)外相引,故病濕熱。從癥狀表現(xiàn)來(lái)看,模型組A和模型組B大鼠均出現(xiàn)便溏的臨床表現(xiàn),這提示脾胃運(yùn)化機(jī)能障礙,升降失序,清濁不分。根據(jù)現(xiàn)有的模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),可認(rèn)為模型組A和模型組B均復(fù)制身重困倦、腹脹納呆、便溏的濕熱證表現(xiàn)。

眾所周知,高尿酸血癥是GA最主要的危險(xiǎn)因素,但臨床研究表明,許多高尿酸血癥患者不會(huì)發(fā)展為GA,也不會(huì)形成MSU晶體,甚至終身無(wú)癥狀。另有研究表明,約70% GA患者雖血尿酸值正常,但臨床卻表現(xiàn)出GA急性發(fā)作癥狀。這說(shuō)明只有當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)MSU晶體沉積并與中性粒細(xì)胞相作用時(shí),才會(huì)導(dǎo)致以中性粒細(xì)胞為首的先天免疫系統(tǒng)被激活,進(jìn)而引發(fā)GA發(fā)作[21-22]。臨床上GA起病急驟,發(fā)作時(shí)可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)紅腫、劇烈疼痛和運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀,通常在7～10 d后緩解,患者自行恢復(fù)。此外本次實(shí)驗(yàn)造模使用的大鼠為嚙齒類動(dòng)物,與靈長(zhǎng)類不同在于其自身存在可將尿酸代謝為尿囊素的尿酸酶[23],故非長(zhǎng)期刺激,而只是一過(guò)性刺激難以建立以高尿酸血癥為基礎(chǔ)的GA動(dòng)物模型[24]。MSU晶體作為誘發(fā)GA發(fā)作的關(guān)鍵物質(zhì),因此目前建立GA動(dòng)物模型最經(jīng)典方法便通過(guò)向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性MSU晶體。該造模方式不僅操作簡(jiǎn)便、模型穩(wěn)定而且與臨床GA患者急性發(fā)作癥狀相吻合。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,注射MSU晶體混懸液2 h后模型逐漸形成,12h后模型效果達(dá)到峰值,此后即使不做干預(yù),紅腫熱痛癥狀亦逐漸緩解。這提示本實(shí)驗(yàn)GA模型復(fù)制與臨床GA急性發(fā)作相符合,這也提示臨床GA發(fā)作12 h內(nèi)是治療的黃金時(shí)間可極大地緩解GA發(fā)作癥狀。

濕邪為有形之邪,血脂便是其生化物質(zhì)基礎(chǔ)之一,脂代謝紊亂則表明脾失健運(yùn),導(dǎo)致運(yùn)化水濕、分清泌濁的功能失職,為濕熱證的發(fā)展創(chuàng)造了內(nèi)在條件[25]。呂文亮等[26]采用“人工氣候箱+肥甘飲食+鼠傷寒沙門菌”法建立濕熱證模型可引發(fā)血循環(huán)中LDL-C升高而HDL-C降低。李華鋒等[27]和闕鐵生等[28]采用“高脂飲食+高溫高濕+大腸埃希菌灌胃”法制備的溫病濕熱證中TC、TG、LDL-C水平顯著增加,HDL-C水平顯著減少。由此可見脂代謝紊亂是濕熱證特征之一。此外臨床橫斷面研究表明脂代謝異常是GA誘發(fā)因素之一[29]。本實(shí)驗(yàn)中模型組A和模型組B的TG、TC和LDL-C水平顯著高于正常對(duì)照組和GA對(duì)照組,HDL-C水平則顯著低于正常對(duì)照組和GA對(duì)照組,說(shuō)明兩種造模方式均發(fā)生脂代謝紊亂,大鼠出現(xiàn)濕熱證表現(xiàn),且對(duì)GA發(fā)作有促進(jìn)作用。

GA屬炎癥性疾病的一種,其最大特征是MSU晶體沉積誘發(fā)炎癥發(fā)作。先天免疫在GA發(fā)作的自我緩解機(jī)制中發(fā)揮重要作用,單核/巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞組分。MSU晶體作為一種“危險(xiǎn)信號(hào)”因子,在GA發(fā)作的啟動(dòng)、放大和維持中發(fā)揮重要作用,主要與IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子相關(guān)[30]。這些促炎因子主要由于單核/巨噬細(xì)胞被MSU晶體誘導(dǎo)活化而產(chǎn)生。有生物活性的成熟IL-1β被當(dāng)作GA發(fā)作的始動(dòng)因子,其可通過(guò)活化IL-1受體通路刺激炎癥因子和趨化因子,募集大量中性粒細(xì)胞。TNF-α可激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,從而促進(jìn)其他細(xì)胞因子的合成和釋放,也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外TNF-α可刺激黏附因子的大量分泌,隨后黏附因子與白細(xì)胞共同作用損傷關(guān)節(jié)細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨[31],這可能與GA患者劇烈疼痛相關(guān)。Liu等[32]發(fā)現(xiàn)MSU晶體刺激單核細(xì)胞,可刺激單核細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α,且呈時(shí)間依賴性。另有研究表明IL-6有助于誘發(fā)GA炎癥,是激活MSU介導(dǎo)的NLRP3炎性體激活所必需的炎癥因子[33]?；颊逫L-6表達(dá)檢測(cè)可反映GA病情發(fā)展變化[34]。徐曉辰等[35]探討GA患者不同時(shí)間點(diǎn)血清炎性因子的變化,結(jié)果表明IL-1β、IL-6及TNF-α在炎癥過(guò)程中可能存在共同作用。研究報(bào)道,30年前David Baltimore和Ranjan Sen發(fā)現(xiàn)一個(gè)在炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,即NF-κB,其含了一個(gè)二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族,對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控以及幾乎所有生物中細(xì)胞的增殖、生化和凋亡都至關(guān)重要[36]。MSU晶體、促炎因子(如:IL-1β、IL-6和TNF-α)和脂多糖等胞外刺激均可誘導(dǎo)NF-κBp65轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[37]。研究表明MSU晶體主要通過(guò)兩種途徑誘導(dǎo)NF-κB活化:(1)在大多數(shù)細(xì)胞中,其通常以p65/p50二聚體形式存在,p65主要承擔(dān)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。MSU晶體可能與toll樣受體2和toll樣受體4結(jié)合,導(dǎo)致NF-κBp65的核易位,最終誘導(dǎo)NF-κB活化。(2)MSU晶體可誘導(dǎo)由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域、亮氨酸重復(fù)序列和熱蛋白結(jié)構(gòu)域組成的NLRP3炎癥小體的活化,活化的NLRP3炎癥小體可激活效應(yīng)蛋白胱冬肽酶-1,最終導(dǎo)致成熟IL-1β的產(chǎn)生[38]。成熟的IL-1β能夠通過(guò)IL-1受體通路誘導(dǎo)NF-κB的活化。以上諸多文獻(xiàn)均證明NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α在GA發(fā)作中的重要作用,同時(shí)也有研究表明濕熱證與炎癥密切相關(guān)[39]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB表達(dá)呈現(xiàn)模型組B＞模型組A＞GA對(duì)照組＞正常對(duì)照組,說(shuō)明模型組A、模型組B和GA對(duì)照組大鼠均表現(xiàn)出明顯炎癥反應(yīng)。此外模型B炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)高于模型組A,總體而言說(shuō)明生物因子與單純濕熱環(huán)境相比,生物因子對(duì)于炎性因子的啟動(dòng)可反應(yīng)“熱”致病因子靶點(diǎn)所在。

綜上所述,本研究結(jié)果表明兩種造模方式均可誘導(dǎo)濕熱證“證”和GA“病”的臨床表現(xiàn)。從脂代謝和炎癥因子指標(biāo)觀察二者既有共性也有各自特點(diǎn),但毋庸置疑高脂高糖飲食是脂代謝紊亂的直接影響因素,且脂代謝可作為“濕”致病因子靶點(diǎn),炎性因子可作為“熱”致病因子靶點(diǎn)。綜合比較生物因子對(duì)于大鼠炎癥影響更明顯,可作為濕熱證GA病證結(jié)合模型中“熱”靶點(diǎn)量化評(píng)價(jià)指標(biāo)。將“病”和“證”相結(jié)合制備濕熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合模型可為探明中醫(yī)藥治療作用和機(jī)理研究提供可行的動(dòng)物模型選擇。