許佳歡別亞男陳千晴陳柏羽歐寶芳謝水林吳少瑜*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣州 510515;2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,廣州 511436;3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣州 510006)

先兆子癇(pre-eclampsia,PE)是一種累及多器官的妊娠相關(guān)疾病,其發(fā)病機(jī)制是不同程度的胎盤灌注不良引起可溶性因子釋放,導(dǎo)致母體血管內(nèi)皮損傷,從而致使高血壓和多器官功能障礙[1-2]。PE引起的胎盤損傷可導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限、流產(chǎn)以及死胎死產(chǎn)。PE是孕產(chǎn)婦圍產(chǎn)期死亡主要原因之一。2019年全球疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告顯示,每年約有1800萬婦女患有妊娠高血壓疾病,約27 800名孕產(chǎn)婦死亡[3]。在過去的二十年中,先兆子癇的預(yù)防治療取得了重大進(jìn)展,主要包括孕前咨詢、圍產(chǎn)期血壓控制和并發(fā)癥管理、胎兒及時(shí)分娩和產(chǎn)后監(jiān)測(cè)等[4]。但除分娩外,沒有其他更有效的靶向性治療方案,目前也缺乏特效藥物延緩疾病進(jìn)展。因此,建立PE動(dòng)物模型,對(duì)揭示其相關(guān)分子機(jī)制和探索有效的靶向治療方案提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

小鼠模型因與人類的高度同源性以及相似的循環(huán)系統(tǒng),在PE研究中被廣泛使用和接受[5]。模擬小鼠PE樣癥狀的方法包括手術(shù)操作、近交系交配、外源性藥物誘導(dǎo)以及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等[6]。其中外源性藥物主要是通過干擾免疫系統(tǒng)從而誘導(dǎo)PE的發(fā)生。先天模式識(shí)別受體家族Toll樣受體 (Toll-like receptors, TLR) 的激活會(huì)誘發(fā)妊娠依賴性高血壓、腎功能不全、內(nèi)皮功能障礙和胎盤損傷[7]。在本研究中,我們使用不同的TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)PE,并評(píng)估TLR4激動(dòng)劑脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)[8]和TLR7/8激動(dòng)劑雷西莫特(Resiquimod, R848)[9]在構(gòu)建PE模型方面的異同點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性CD-1小鼠12只,8～12周齡,體重30～40 g;SPF級(jí)雌性CD-1小鼠24只,8～12周齡,體重20～40 g;購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001],飼養(yǎng)于廣州華騰生物科技有限公司[SYXK(粵)2020-0237]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)廣州華騰生物科技有限公司倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(HTSW211214),嚴(yán)格遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(上海麥克林生化科技有限公司,L861706);雷西莫特 (MedChemExpress,144875-48-9);小鼠ELISA試劑盒(soluble FMS-like tyrosine kinase 1, sFlt-1,ml002064; soluble endothelial factor, sEng,ml002193)(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,R510-22)。大小鼠無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量分析系統(tǒng)(ZS-Z,北京眾實(shí)科技有限公司);全自動(dòng)生化分析儀(Thermo Indiko Plus)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與造模處理

孕鼠的獲得:將24只雌性小鼠與12只雄性小鼠按雌雄2∶1的比例合籠飼養(yǎng)過夜;在第2天9:00檢查雌性小鼠的陰道栓,若見陰道栓定義為妊娠第0天(記為E0)。

動(dòng)物分組與造模處理:將24只孕鼠隨機(jī)分為4組:脂多糖對(duì)照組、脂多糖組、R848對(duì)照組、R848組,每組6只。脂多糖對(duì)照組于妊娠第13、14、15、16、17天(E13、E14、E15、E16、E17)尾靜脈注射200 μL生理鹽水;脂多糖組于妊娠第13、14、15、16、17天尾靜脈注射40 μg/kg LPS;R848對(duì)照組于妊娠第13、15、17天腹腔注射200 μL R848溶劑(5% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+50% saline);R848組于妊娠第13、15、17天按10 mg/kg的劑量腹腔注射R848。

1.3.2 孕鼠無創(chuàng)血壓測(cè)量

分別在妊娠第12、14、16、18天(E12、E14、E16、E18) 上午8:00～11:00,使用尾動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)儀測(cè)量孕鼠血壓,每只孕鼠測(cè)量3次,結(jié)果取均值。

1.3.3 孕鼠尿蛋白/尿肌酐比值測(cè)定

收集孕鼠妊娠第17天17:00～妊娠第18天8:00的尿液,使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿蛋白與尿肌酐含量。

1.3.4 ELISA檢測(cè)孕鼠血清sFlt-1和sEng水平

在妊娠第18天,采用眼眶靜脈采血收集各組孕鼠血液于促凝管中,4℃靜置30 min后,3000 r/min離心10 min收集上清。根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)血清中sFlt-1和sEng的含量。

1.3.5 HE染色

在妊娠第18天,采用眼眶取血后,使用10 mL異氟烷過量麻醉處死孕鼠,開腹取出子宮,剝離胎盤,剖出胎鼠進(jìn)行計(jì)數(shù)與稱重。收集孕鼠的胎盤組織、子宮,于10%甲醛固定、乙醇脫水,經(jīng)石蠟包埋、連續(xù)切片(厚度4 μm)后按常規(guī)步驟進(jìn)行HE染色,觀察各組織的病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行繪圖。對(duì)正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計(jì)量資料使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法或Tamhane’sT2法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠尾動(dòng)脈收縮壓比較

于妊娠第13天開始給予相應(yīng)藥物后,LPS對(duì)照組與R848對(duì)照組相比,尾動(dòng)脈收縮壓水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。與LPS對(duì)照組相比,LPS組尾動(dòng)脈收縮壓水平顯著升高(P＜0.0001)。與R848對(duì)照組相比,R848組尾動(dòng)脈收縮壓水平顯著升高(P＜0.0001)(圖1、表1)。LPS組和R848組均出現(xiàn)孕鼠妊娠期高血壓。

表1 各組孕鼠尾動(dòng)脈收縮壓(mmHg, n=6)Table 1 The systolic blood pressure of the tail artery of pregnant mice in each group

圖1 四組孕鼠妊娠第12、14、16、18天尾動(dòng)脈收縮壓(n=6)Figure 1 The systolic blood pressure of caudal artery of pregnant mice in four groups on the 12th, 14th, 16th and 18th day of pregnancy

2.2 各組孕鼠尿蛋白/尿肌酐比值比較

使用終點(diǎn)法測(cè)定孕鼠尿蛋白,氧化酶法測(cè)定孕鼠尿肌酐,求得比值后發(fā)現(xiàn),與LPS對(duì)照組相比,LPS組比值升高(P＜0.05)。R848組與R848對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖2)。

圖2 四組孕鼠尿蛋白/尿肌酐結(jié)果(n=6)Figure 2 Results of urinary protein/creatinine of pregnant mice in four groups

2.3 各組孕鼠胎鼠情況比較

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析(圖3A),各組胎鼠數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖3B)。LPS對(duì)照組與R848對(duì)照組胎鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),但與LPS對(duì)照組相比,LPS組的胎鼠體重略有下降(P＜0.05)。與R848對(duì)照組相比,R848組胎鼠體重顯著下降(P＜0.0001)(圖3C)。提示LPS和R848誘導(dǎo)的先兆子癇模型會(huì)影響胚胎的發(fā)育。

圖3 四組孕鼠胎鼠大體觀察、數(shù)量及體重結(jié)果(n=6)Figure 3 Results of gross observation, number and weight of pregnant mice in four groups

2.4 各組孕鼠血清中sFlt-1和sEng的表達(dá)量

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4),與R848對(duì)照組相比,LPS對(duì)照組的各因子表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。LPS組與LPS對(duì)照組相比,sFlt-1和sEng的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。R848組相比較于R848對(duì)照組,sFlt-1和sEng的表達(dá)升高(P＜0.01)。

圖4 各組孕鼠血清中sFlt-1和sEng的表達(dá)水平結(jié)果(n=3)Figure 4 Results of sFlt-1 and sEng expression level in serum of pregnant mice in four groups

2.5 病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示(圖5),LPS對(duì)照組和R848對(duì)照組的胎盤中迷路可見大量血竇,血竇大小正常,血竇周圍見大量合胞體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層,細(xì)胞形態(tài)正常。LPS組胎盤組織與LPS對(duì)照組相比無明顯差異。而R848組的全部孕鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的胎盤病變:胎盤組織迷路可見大量藍(lán)紫色鈣鹽沉積,合胞體滋養(yǎng)層廣泛增生并伴有大量鈣化,可見細(xì)胞灶狀壞死,滋養(yǎng)層內(nèi)血竇數(shù)量明顯減少。

圖5 四組孕鼠胎盤、子宮HE染色Figure 5 HE staining of placenta and uterus of four groups of pregnant mice

此外,子宮HE染色結(jié)果顯示,LPS對(duì)照組和R848對(duì)照組子宮的黏膜層見大量絨毛樣結(jié)構(gòu),上皮完整,上皮細(xì)胞胞質(zhì)豐富,形態(tài)正常,固有層見較多毛細(xì)血管,管腔大小正常。與LPS對(duì)照組比較,LPS組2/3孕鼠的子宮的黏膜層絨毛輕度水腫,大量毛細(xì)血管增生及充血擴(kuò)張,伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與R848對(duì)照組比較,R848組全部孕鼠的子宮的黏膜上皮高度水腫,絨毛明顯增厚,固有層結(jié)締組織增生明顯,毛細(xì)血管增生及淤血擴(kuò)張,組織內(nèi)可見小范圍輕度出血,伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

先兆子癇是一種多系統(tǒng)妊娠特異性疾病,其發(fā)病機(jī)制主要涉及兩個(gè)階段:胎盤異常和母體綜合征的發(fā)展[10]。因此構(gòu)建合適的動(dòng)物模型有助于更好地了解其發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法。小鼠胎盤在結(jié)構(gòu)上類似于人類胎盤,具有高度的功能保護(hù)[11]。目前,構(gòu)建小鼠PE模型的方法主要有:(1)使用手術(shù)誘導(dǎo)法,降低胎盤灌注壓[12]。此方法產(chǎn)生類似于伴有胎兒生長(zhǎng)受限的晚發(fā)性PE病理效應(yīng)。由于手術(shù)是在胎盤發(fā)育后進(jìn)行的,不影響螺旋動(dòng)脈正常重塑,一般用于胎盤缺血和胎盤功能不全的研究;(2)近交系交配:雄性DBA/2近交系小鼠與CBA/J近親繁殖[13], 此方法可引起半異體胎盤的免疫排斥反應(yīng),及主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)與母體不相容性導(dǎo)致流產(chǎn);(3)基因編輯:storkhead box 1過表達(dá)[14]、吲哚胺2,3-雙加氧酶敲除[15],此方法使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控與PE相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)影響胎盤和胎兒,因此必須考慮胎兒基因組改變對(duì)病理或表型的影響;(4)外源性藥物誘導(dǎo):血管緊張素II型1受體[16]、TLR激動(dòng)劑[17]、L-NAME(ng-nitro-larginine methyl ester, 硝基-L-Arg-甲基酯)[18],這些藥物中的絕大多數(shù)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),通常在胎盤發(fā)育發(fā)生后引入,模擬晚發(fā)性PE的慢性炎癥狀態(tài);(5)全身性腺病毒感染和滋養(yǎng)層特異性轉(zhuǎn)基因方法[19],全身性腺病毒感染因其肝中靶基因的腺病毒攝取和錯(cuò)誤表達(dá)可導(dǎo)致母體假病毒性肝炎,產(chǎn)生與PE無關(guān)聯(lián)性的其他癥狀。滋養(yǎng)層特異性慢病毒轉(zhuǎn)基因方法僅在胎盤的滋養(yǎng)層部分表達(dá)靶基因,可避免產(chǎn)生脫靶或繼發(fā)性效應(yīng)。上述造模方法可產(chǎn)生PE部分或全部特征,及一些與人類PE臨床不具相關(guān)性的輔助表型,但由于存在發(fā)病機(jī)制和功能活性的差異以及病理進(jìn)程的不一致,仍需建立更可靠的PE動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證以提高向人類轉(zhuǎn)化效率。

LPS是一種細(xì)菌內(nèi)毒素,作用于細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4[20]。LPS給藥是常用的PE造模方法。在免疫細(xì)胞中,LPS可以觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放和活性氧的產(chǎn)生[21]。Li等[8]于妊娠7.5～17.5 d在CD-1小鼠中注射LPS,隨后觀察到血壓升高,胎盤胎兒血管面積、滋養(yǎng)層侵襲和螺旋動(dòng)脈重塑減少,纖維蛋白沉積和腎小球腫脹的腎損傷。

TLR7和TLR8通過與內(nèi)體或吞噬體中的配體結(jié)合來識(shí)別細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[22]。與正常孕婦相比,PE患者的胎盤中合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中的TLR7和TLR8表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn),用TLR7/8激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PE小鼠,其滋養(yǎng)層細(xì)胞的TLR7和TLR8的蛋白質(zhì)水平增加,出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、炎癥和胎盤功能障礙的表征[9]。

在本研究中,與相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組相比,LPS模型組和R848模型組均出現(xiàn)了妊娠期高血壓(收縮壓≥140 mmHg/舒張壓≥90 mmHg)。尿蛋白/尿肌酐結(jié)果顯示,LPS組出現(xiàn)蛋白尿,但R848組并沒有出現(xiàn)蛋白尿,這可能與TLR8在小鼠中抑制TLR7的介導(dǎo)作用有關(guān),從而對(duì)腎有保護(hù)作用[23]。盡管如此,胎盤TLR7/8的過度激活可誘發(fā)妊娠依賴性高血壓和內(nèi)皮功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn),LPS組和R848組的胎兒體重低于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05),這表明胎兒生長(zhǎng)受限。與此同時(shí),HE染色結(jié)果表明,LPS組和R848組子宮均出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且R848組胎盤組織可見灶狀壞死。因此,本研究成功地構(gòu)建了使用TLR4激動(dòng)劑LPS和TLR7/8激動(dòng)劑R848誘導(dǎo)的PE動(dòng)物模型。

在先兆子癇中,胎盤分泌的過量sFlt-1,通過結(jié)合局部和循環(huán)血液中的血管生成蛋白(vascular endothelial growth factor, VEGF)和胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor, PlGF),抑制其傳導(dǎo),從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障[24]?？寡苌傻鞍譻Eng是一種胎盤衍生的可溶性 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor-β, TGF-β) 共受體,抑制TGF-β1與其受體和下游信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)合,引起TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)[25]。sEng在先兆子癇患者血清中的表達(dá)量與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在妊娠大鼠中,相比于單獨(dú)使用,sEng和sFlt-1的聯(lián)用產(chǎn)生先兆子癇的體征和癥狀更嚴(yán)重[26]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,sEng和sFlt-1表達(dá)量升高的R848模型組比sEng和sFlt-1含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的的LPS模型組的先兆子癇表征更嚴(yán)重,如胎兒體重下降更明顯、胎盤嚴(yán)重病變。

綜上所述,LPS和R848均能構(gòu)建出與人類PE病理相似(新發(fā)高血壓或伴有蛋白尿、胎盤功能障礙以及其他器官功能障礙等[6])的PE動(dòng)物模型。LPS在妊娠和非妊娠動(dòng)物中都可誘導(dǎo)全身炎癥,其機(jī)制為慢性炎癥狀態(tài)的持續(xù)激活,這表明LPS引起的表型可能不是妊娠特異性的[27]。根據(jù)胎盤HE染色結(jié)果表明,R848構(gòu)建的PE模型表征更為嚴(yán)重,且給藥方式為腹腔注射,操作簡(jiǎn)單。同時(shí),在R848模型小鼠循環(huán)中發(fā)生了抗血管生成與促血管生成的不平衡:與對(duì)照組相比,R848組小鼠血清的sFlt-1和sEng表達(dá)上升,暗示TLR7/8介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)可能通過調(diào)節(jié)sFlt-1和sEng的表達(dá)從而抑制母胎界面的血管生成,參與PE的發(fā)生發(fā)展[28-29]。因此,針對(duì)TLR7/8開發(fā)的ssRNA或者小分子抑制劑可能通過促進(jìn)新生血管的生成阻斷PE的進(jìn)展。

本研究建立的TLR7/8誘導(dǎo)的PE樣小鼠模型是較為新穎且有相關(guān)數(shù)據(jù)支持的模型[30]。該模型不僅具有妊娠期特有的高血壓以及合并胎兒生長(zhǎng)受限等不良妊娠結(jié)局的PE樣表型,而且具有類似人類PE胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足的病理特征。進(jìn)一步提示了母胎界面TLR7信號(hào)通路異常在PE發(fā)病過程中的重要作用,并為研究PE的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)合適的動(dòng)物模型。