夏 杰，王 蓉

中性粒細胞胞外誘捕網促進腫瘤轉移

夏 杰，王 蓉

（黃岡職業(yè)技術學院 李時珍中醫(yī)藥研究院，湖北 黃岡 438002）

轉移是腫瘤患者病情惡化、死亡以及治療失敗的主要原因。中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）不僅是中性粒細胞的一種免疫機制，還通過多種策略促進腫瘤的轉移。中性粒細胞被招募至轉移位點形成NETs，參與轉移前生態(tài)位的形成；NETs促進上皮細胞向間充質細胞轉變，使得腫瘤細胞獲得遷移和侵入能力；NETs粘附、截留循環(huán)腫瘤細胞，促其定植和增殖；NETs增強腫瘤細胞線粒體功能，改變腫瘤細胞能量代謝，喚醒休眠的微轉移腫瘤細胞；NETs通過包裹的方式“裝甲化”腫瘤細胞，使其免受攻擊。

中性粒細胞胞外誘捕網；腫瘤轉移；轉移前生態(tài)位；上皮細胞間充質轉化；循環(huán)腫瘤細胞；免疫逃逸

中性粒細胞可通過吞噬作用、釋放顆粒內容物、產生活性氧(ROS)等途徑殺滅微生物，是機體抵御病原體入侵的第一道防線。Brinkmann、Reichard等在2004年發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在針對病原體發(fā)揮免疫作用時可以釋放出一種能夠捕獲、殺滅病原體的網狀結構物質，這種網狀結構物質源自構成染色體的DNA、組蛋白以及各種抗菌肽，并將這種網狀結構稱之為中性粒細胞胞外誘捕網（Neutrophilextracellular traps, NETs）[1]。中性粒細胞因釋放NETs而死亡的過程稱為NETosis。釋放NETs是中性粒細胞的重要免疫機制之一，對病原體發(fā)揮著有效的殺傷作用，但過度的NETs形成也與各種疾病的病理損傷有關，如血栓形成、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性肺損傷等。近年來，還發(fā)現(xiàn)NETs與腫瘤的轉移有關。轉移是腫瘤患者病情惡化、死亡以及治療失敗的主要原因。本文基于這些研究成果，綜述了NETs參與腫瘤轉移相關研究的進展。

1 NETs參與轉移前生態(tài)位的建立

對于腫瘤的轉移，英國醫(yī)生Steven Paget在一個世紀前提出了“種子和土壤”假說。他認為，“種子”是癌細胞，“土壤”是癌細胞繁殖的局部生態(tài)系統(tǒng)，腫瘤在患者體內轉移不是隨機的，總是選擇一個適于生存和增值的環(huán)境定植，例如乳腺癌傾向于轉移到肺、骨、肝等部位。美國學者Rosandra N Kaplan在2005年的研究表明，原發(fā)腫瘤在轉移發(fā)生前可以誘導某些組織器官的微環(huán)境發(fā)生適應性變化，為腫瘤轉移進行前期準備，并首次提出了轉移前生態(tài)位（Premetastatic niches，PMN）這一概念[2]。

Wang J、Hossain M等利用小鼠模型開展的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟無菌炎癥病灶中的中性粒細胞可以反向遷移至血管系統(tǒng)，并沿著循環(huán)系統(tǒng)進一步遷移到肺和骨髓[3]。這可以理解為中性粒細胞遷移到特定位點參與創(chuàng)建一種適應性微環(huán)境，為將要發(fā)生的某一事件，如腫瘤細胞轉移，提前布局。

很多證據表明中性粒細胞可以被招募到PMN，并通過NETs和促炎介質的釋放幫助重塑局部微環(huán)境，從而進一步促進腫瘤細胞轉移和增殖。例如，Yang L、Liu Q等的研究表明，乳腺癌和結腸癌患者的肝轉移灶中NETs含量豐富，血清NETs與早期乳腺癌患者肝轉移的發(fā)生呈正相關。在對小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟或肺部的NETs對循環(huán)中的腫瘤細胞具有趨化作用，腫瘤細胞上的跨膜蛋白CCDC25是NETs-DNA受體，它能感知細胞外DNA，隨后激活ILK-β-parvin通路以增強腫瘤細胞侵襲性。這種NETs介導的轉移在CCDC25基因敲除細胞中消失。臨床研究也表明，CCDC25在原發(fā)腫瘤細胞上的表達與患者預后不良密切相關[4]。他們的另一項研究證明，NETs促進直腸癌細胞肝轉移。用脫氧核糖核酸酶（DNase）降解NETs-DNA，顯著減少了NETs相關的肝轉移。其原理是，NETs在肝臟中捕獲、扣押直腸癌細胞，但對癌細胞并無殺傷性，反而增加了腫瘤細胞的定植和增殖能力，這一現(xiàn)象與NETs誘導的腫瘤白介素8(IL-8)表達升高有關，因為阻斷IL-8活性可有效地消除NETs相關的轉移現(xiàn)象[5]。此外，過量產生的IL-8反過來激活中性粒細胞NETs的形成，從而形成一個促進直腸癌肝轉移的正循環(huán)。

Lee W、Ko SY等的研究也證明了NETs與PMN的關系。已知卵巢癌優(yōu)先轉移到大網膜，發(fā)生大網膜轉移前中性粒細胞會提前遷入，并在卵巢癌相關炎癥因子的刺激下形成NETs。臨床研究表明，在早期卵巢癌婦女的大網膜中檢測到NETs存在。NETs通過趨化、扣押循環(huán)卵巢癌細胞從而促進其轉移。肽酰基精氨酸脫亞胺酶4 (PAD4)是NETs形成所必需的一種酶，PAD4基因敲除卵巢癌小鼠模型大網膜轉移減少，使用PAD4抑制劑阻斷NETs形成也可以降低卵巢癌的大網膜轉移[6]。因此，中性粒細胞的遷入和NETs的形成在大網膜創(chuàng)建了一個有利于卵巢癌轉移的PMN，通過阻斷NETs預防轉移的治療策略還需要進一步臨床驗證。

2 NETs促進上皮細胞向間充質細胞轉化

上皮細胞-間充質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是一種復雜的細胞過程。在這一過程中，癌細胞失去極性和粘附性，獲得間充質細胞的特性，遷移和侵入能力增強，EMT還使得癌細胞獲得抗凋亡能力，讓癌細胞從原發(fā)部位轉移到繼發(fā)位點過程中得以生存下來。多項研究表明，EMT激活與NETs相關。

Pieterse E、Rother N等將NETs與內皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NETs通過降解血管內皮鈣粘蛋白(CD144)和隨后激活Wnt/β-catenin信號通路誘導EMT，NETs相關中性粒細胞彈性蛋白酶是誘導EMT的關鍵[7]。NETs還被證明可以通過上調ZEB1和SNAI1等EMT轉錄因子的表達，促使人乳腺癌細胞的上皮形態(tài)改變?yōu)殚g充質表型[8]。

Jin W、Yin H等在人類胰腺癌微環(huán)境中也觀察到類似的結果。NETs顯著上調了與EMT相關的幾種蛋白質的mRNA水平，其中IL-1β可通過激活胰腺癌細胞EGFR/ERK信號通路誘導EMT。抗IL-1β抗體可通過阻斷EGFR/ERK通路來消除NETs誘導的EMT。抑制NETs的形成和阻斷IL‐1β都可以有效地減弱胰腺癌進展[9]。因此，針對NETs的靶向處理，可能對某些癌癥患者帶來希望。

3 NETs促進循環(huán)腫瘤細胞定植

目前，通過手術切除依然是癌癥治療的主要措施。然而，手術本身與腫瘤轉移有關，主要原因是在手術過程中，因手術損傷導致腫瘤細胞脫落進入血液和淋巴循環(huán)，進而發(fā)生轉移[10]。比如，肝癌患者手術切除后，循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)數(shù)量可顯著增加。CTC可以粘附于內皮細胞并滲出，然后定植、增殖形成轉移病灶。此外，手術應急會導致組織和循環(huán)中炎癥因子激增，先天免疫細胞數(shù)量增加。Najmeh S、Cools-Lartigue J等研究發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境下NETs形成增加，人和小鼠肺腫瘤細胞β1整合素表達的上調。循環(huán)腫瘤細胞易黏附于NETs，而腫瘤細胞β1整合素與這一粘附作用相關。黏附于NETs的腫瘤細胞促進肝轉移，使用脫氧核糖核酸酶（DNAse）破壞NETs-DNA可以消除這種黏附，同時也減少轉移的發(fā)生[11]。

另外，NETs可以通過誘導血栓形成，從而促進癌細胞轉移[12]。NETs可作為血小板和凝血因子結合、激活的平臺，是血栓形成的有效誘導劑[13]。H4組蛋白、瓜氨酸化的H3組蛋白 可激活血小板；NETs帶負電荷，還能激活FXII，從而激活內源性凝血途徑途徑[14]?；罨难“逵挚梢杂行дT導NETs形成。因此，NETs與血栓形成的這種相互促進作用是癌癥相關血栓形成的基礎，這也可能是NETs防止病原體擴散的策略，但同時也可能是循環(huán)腫瘤細胞截留、定植的機制之一。

4 NETs促進微轉移病灶腫瘤細胞生長

循環(huán)腫瘤細胞定植后，通常處于營養(yǎng)缺乏、血供不足的不利環(huán)境中，腫瘤細胞會進入一種休眠狀態(tài)潛伏下來，形成一種暫時不生長的微轉移病灶（Micrometastatic disease）。這可能是原發(fā)腫瘤手術切除很長時間后仍然出現(xiàn)轉移的原因之一。許多研究表明，NETs可通過多種途徑促進微轉移病灶腫瘤細胞生長。

4.1 NETs“喚醒”微轉移病灶休眠腫瘤細胞

雖然還不完全了解是什么觸發(fā)了這“休眠”和“喚醒”信號之間的平衡變化，但局部炎癥與這些休眠腫瘤細胞的覺醒有關。Albrengues J、Shields MA等將實驗小鼠鼻內灌注脂多糖（LPS）或暴露于煙草煙霧，在小鼠肺內形成的持續(xù)性炎癥，發(fā)現(xiàn)肺部有NETs的形成，并且肺部先前休眠的乳腺癌微轉移細胞快速增殖形成轉移病灶。分析表明，這一現(xiàn)象與兩種NETs相關蛋白有關，中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在細胞外基質中裂解層粘連蛋白，重構的層粘連蛋白通過激活整合素α3β1信號通路誘導休眠癌細胞增殖。利用DNase降解NETs-DNA，這一過程則被抑制[15]。因此，休眠腫瘤細胞的“喚醒”機制與NETs密切相關。

4.2 NETs改變微轉移病灶腫瘤細胞能量代謝

Yazdani HO、Roy E等的研究表明，NETs可以改變微轉移病灶腫瘤細胞能量代謝。他們發(fā)現(xiàn)，PAD4敲除小鼠（不能形成NETs）皮下腫瘤植入和肝轉移生長緩慢，線粒體密度、ATP生成以及線粒體生發(fā)蛋白顯著降低。而在NETs富足環(huán)境中，腫瘤細胞線粒體密度增加，氧化磷酸化水平提高，ATP生成增多，定植率提高。在機制上，NETs釋放的中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)激活腫瘤細胞上的TLR-4，導致PGC-1α上調，增加線粒體生物發(fā)生[16]。因此，NETs可以直接改變腫瘤細胞的代謝程序，從而促進腫瘤生長。

4.3 NETs“裝甲化”微轉移病灶腫瘤細胞

手術應激后的中性粒細胞趨化因子受體1（CXCR1）和趨化因子受體2（CXCR2）表達上調。IL-8是人類腫瘤細胞大量產生的一類趨化因子，在IL-8和一些炎癥介質的作用下，中性粒細胞遷移至腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME），并誘導NETs形成。在NETs存在的情況下，CD8+細胞、自然殺傷(NK)細胞對腫瘤細胞的破壞作用下降，微轉移病灶腫瘤細胞生存率顯著提高。Teijeira證明這種保護作用的機制是NETs對腫瘤細胞的包裹，減少CD8+、NK細胞與腫瘤細胞的直接接觸，以實現(xiàn)免疫逃逸的目的。這一現(xiàn)象可以理解為腫瘤細胞在NETs的包裹下被“裝甲化”，從而免受攻擊。使用DNAse降解NETs解除“裝甲化”，腫瘤細胞也隨即失去保護作用[17]。我們有理由相信，NETs對原發(fā)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤細胞、轉移腫瘤細胞都有類似的保護作用，因此，NETs是腫瘤轉移的一個重要促進因素。

綜上所述，轉移是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。NETs雖然是中性粒細胞重要的免疫機制之一，但在腫瘤的轉移過程中，NETs卻發(fā)揮著推波助瀾的作用。針對NETs的靶向治療可以作為降低腫瘤轉移率的策略之一。

[1]BRINKMANN V, REICHARD U, GOOSMANN C, et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria[J]. Science, 2004 (5663): 1532-1535.

[2]KAPLAN R N, RIBA R D, ZACHAROULIS S, et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow pro-genitors initiate the pre-metastatic niche[J].Nature,2005,438(7069): 820- 827.

[3]WANG J, HOSSAIN M, THANABALASURIAR A, et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair[J]. Science,2017,358:111–116.

[4]YANG L, LIU Q, ZHANG X, et al. DNA of neutrophil extracellular traps promotes cancer metastasis via CCDC25[J]. Nature,2020, 583:133–138.

[5]YANG L, LIU L, ZHANG R, et al. IL-8 mediates a-positive loop connecting increased neutrophil extracellular traps (NETs) and colorectal cancer liver metastasis[J]. Cancer, 2020,11: 4384–4396.

[6]LEE W, KO S Y, MOHAMED M, et al. Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum[J]. Journal of Experimental Medicine,2018, 216: 176–194.

[7]PIETERSE E, ROTHER N, GARSEN M, et al. Neutrophil extracellular traps drive endothelial-to-mesenchymal transition[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2017, 37:1371–1379.

[8]MARTINS-CARDOSO K, ALMEIDA V H,BAGRI K M, etal. Neutrophil extracellular traps (NETs) promote pro-metastatic phenotype in human breast cancer cells through epithelial–mesenchymal transition[J]. Cancers,2020, 12:1542.

[9]JIN W, YIN H, LI H, et al. Neutrophil extracellular DNA traps promote pancreatic cancer cells migration and invasion by activating EGFR/ERK pathway[J].Journal of cellular and molecular medicine,2021, 25:5443–5456.

[10]TOHME S, SIMMONS R L,TSUNG A, et al. Surgery for cancer: A trigger for metastases[J]. Cancer research,2017, 77:1548–1552.

[11]NAJMEH S, COOLS-LARTIGUE J, RAYES RF, et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via β 1-integrin mediated interactions[J]. Cancer,2017, 140: 2321–2330.

[12]CEDERVALL J, HAMIDI A, OLSSON AK, et al. Platelets, NETs and cancer[J]. Thrombosis research,2018, 164: S148–S152.

[13]DEBONT C M, BOELENS W C, PRUIJN G J M, et al. NETosis, complement, and coagulation: A triangular relationship[J]. Cellular & molecular immunology,2019,16:19–27.

[14]BERENDS E T, KUIPERS A, RAVESLOOT M M, et al. Bacteria under stress by complement and coagulation[J]. Fems microbiology reviews,2014, 38:1146–1171.

[15]ALBRENGUES J, SHIELDS M A, NG D, et al. Neutrophil extracellular traps produced during inflammation awaken dormant cancer cells in mice[J]. Science,2018, 361: eaao4227.

[16]YAZDANI H O, ROY E, COMERCI A J, et al. Neutrophil extracellular traps drive mitochondrial homeostasis in tumors to augment growth[J]. Cancer research,2019,79:5626 –5639.

[17]TEIJEIRA A, GARASA S, GATO M, et al. CXCR1 and CXCR2 chemokine receptor agonists produced by tumors induce neutrophil extracellular traps that interfere with immune cytotoxicity[J]. Immunity,2020, 52, 856–871.

R73-370

A

1672-1047（2023）04-0117-03

10.3969/j.issn.1672-1047.2023.04.29

2023-07-04

黃岡職業(yè)技術學院科研項目“中性粒細胞胞外誘捕網促進腫瘤轉移機制的研究”（2022C2012109）。

夏杰，男，湖北黃岡人，生物醫(yī)學工程碩士，講師。研究方向：基礎醫(yī)學。

[責任編輯：曾華]