楊福 李景鵬 余麗霞 周利斌

（1 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長春 130012；2 中國科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000；第一/通訊作者：yangfu@iga.ac.cn）

農(nóng)作物輻射誘變是指利用各種射線對生物體進(jìn)行輻射誘發(fā)產(chǎn)生變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)對后代突變材料進(jìn)行篩選鑒定，直接或間接選育新品種的過程。常見的輻射誘變主要有x 射線、γ 射線、中子、離子束及多種因素結(jié)合的空間誘變[1]。在重離子束輻射農(nóng)作物誘變育種方面，1989年余增亮等[2]首創(chuàng)了低能重離子束（30 MeV/u 以下）注入技術(shù)用于農(nóng)作物品種改良，之后研究人員先后培育出水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物新種質(zhì)及品種，取得了較好的社會經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。20世紀(jì)90年代，中國科學(xué)院近代物理研究所利用蘭州國家重離子加速器（HIRFL）裝置對農(nóng)作物干種子進(jìn)行重離子束輻射，先后培育出優(yōu)良的小麥及甜高粱等農(nóng)作物品種，并得到了推廣應(yīng)用[5-6]。重離子是指重于元素周期表中2 號元素He 并被電離的粒子[7]，將其通過大型加速器裝置加速而形成具有較高能量的射線就是高能重離子束（80 MeV/u 以上）[8]。實(shí)踐證明，高能重離子束輻射作為一種新的誘變技術(shù)，在穿過生物介質(zhì)時，將大量能量沉積在其徑跡上，引起DNA 單鏈或雙鏈斷裂、堿基突變和缺失[7，9]，造成DNA 鏈的錯誤修復(fù)或非同源末端重組[8]；它不僅具有能量高、穿透能力強(qiáng)、生物效應(yīng)高、損傷小等特點(diǎn)，與以往輻射技術(shù)相比，輻射誘變的效率比60Co-γ 射線等要高出10 倍[1，10]，可大幅度提高突變率，使突變率達(dá)到5.7%以上[11]。2013年中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所與中國科學(xué)院近代物理研究所緊密合作、優(yōu)勢互補(bǔ)，開展了高能重離子束（12C6+）輻射北方粳稻的誘變育種工作。經(jīng)過10年的研發(fā)，創(chuàng)建了高能重離子束輻射北方粳稻“少而精”誘變育種技術(shù)體系，開辟了一條水稻育種新途徑。首先，精選親本，選擇遺傳背景豐富、一般配合力高、抗稻瘟病、綜合性狀優(yōu)良的材料作輻射親本；其次，輻射親本種子量少，一般為200～250 粒，而60Co-γ 射線輻射通常需要幾千粒或更多[12]；再次，M1、M2種植群體小，一般M1幾十株，M22 000 株左右；最后，后代材料盡早抓住少數(shù)有益突變性狀，跟蹤不放。目前，利用該技術(shù)已獲得1 000 多份突變體，變異類型豐富，優(yōu)良性狀多。自2020年開始，先后有輻射優(yōu)良突變品系東稻122、東稻275、東稻812等通過吉林省農(nóng)作物品種審定。為了凝練研究成果，使高能重離子束輻射北方粳稻“少而精”誘變育種技術(shù)體系得到更好應(yīng)用，筆者將高能重離子束輻射北方粳稻誘變育種的經(jīng)驗(yàn)及技術(shù)層面的一些問題歸納總結(jié)，期望為今后水稻高能重離子束輻射誘變育種工作提供一些參考。

1 輻射親本的選擇

大量育種實(shí)踐證明，親本的選配是育種成敗的關(guān)鍵。優(yōu)良作物品種的培育必須站在“巨人的肩膀”上，高能重離子束輻射親本的選擇也是一樣。常規(guī)育種中，玉米有骨干自交系，水稻也有骨干親本之說法，目前最先進(jìn)的作物分子設(shè)計育種也需要引用“底盤品種”的概念。理想的親本是各育種單位經(jīng)過長期育種實(shí)踐篩選、總結(jié)出來的，一般親本之一都具有在生產(chǎn)上應(yīng)用時間較長、推廣面積大、綜合性狀好等特點(diǎn)。但長期的育種實(shí)踐表明，綜合性狀好的品種不一定是好的親本，而好的親本除綜合性狀優(yōu)良之外，一般配合力也要高。總之，輻射親本選擇的“試金石”應(yīng)該是輻射后能夠誘變出符合水稻育種目標(biāo)的優(yōu)異突變性狀相對要多，短時間內(nèi)能培育出優(yōu)良突變新種質(zhì)或新品種。這需要長期育種實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，更需要從分子水平上系統(tǒng)分析骨干親本/品種的重要基因區(qū)段、關(guān)鍵基因及等位基因（群）的遺傳變異規(guī)律，并開發(fā)高效的分子標(biāo)記，做長期的基礎(chǔ)或應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作。

目前，高能重離子束輻射北方粳稻親本的選擇與其它育種方法一樣，應(yīng)傾向于選擇綜合優(yōu)勢強(qiáng)、抗稻瘟病、品質(zhì)優(yōu)且一般配合力高的材料。筆者結(jié)合多年常規(guī)雜交組配后代親本分布情況分析發(fā)現(xiàn)，吉林省通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的通禾899 綜合性狀優(yōu)良，且一般配合力高，后代材料遺傳性好。2013年選用通禾899作為高能重離子束輻射親本，輻射誘變后代材料變異類型豐富，獲得了大量的突變種質(zhì)資源和優(yōu)良品系，并從2020年開始，陸續(xù)審定了東稻122、東稻275、東稻812 和東稻862，還有大量后代材料正在抗稻瘟病、耐鹽堿及品質(zhì)鑒定過程中。此外，近些年還選擇了30 多個在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣面積較大、國內(nèi)優(yōu)質(zhì)水稻獲獎品種作輻射親本，也取得了良好的誘變成果，創(chuàng)制了許多優(yōu)異突變后代。

2 輻射方法

2.1 輻射部位

主要以輻射水稻種子的胚為主。水稻主要靠種子繁殖，胚是由受精卵（合子）發(fā)育而成的新一代植物體的雛型（即原始體），具有胚芽、胚根和盾片等器官，是種子中最重要的組成部分，水稻的遺傳信息通過胚傳遞給后代；另外，種子還具有容易攜帶、輻射方便、體積小、易保存、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，是最佳的輻射部位。

2.2 輻射數(shù)量

不同的輻射源輻射處理種子的數(shù)量有很大的差異。如60Co-γ 射線等，一般輻射幾千粒種子甚至更多，而利用高能重離子束輻射處理水稻種子的數(shù)量較少。按照筆者的經(jīng)驗(yàn)，如果每個M1單株分蘗10～15 個，每穗100 粒，按照每穗結(jié)實(shí)率5%計算，每穗結(jié)實(shí)5 粒，1個M1的半不育株大約結(jié)實(shí)50～75 粒，如果有50 個M1單株，可產(chǎn)生至少2 500 粒種子。按出苗率80%計算，可得苗2 000 株，可插100 m2本田，按平均突變率5%計算，可產(chǎn)生100 份突變株。因此，一般處理200～250粒為宜。如2013年3月采用高能重離子束（12C6+）輻射通禾899 種子150 粒，播種成活23 棵苗并插秧，結(jié)實(shí)均為半不育植株，平均結(jié)實(shí)率5%，共收獲種子1 400粒左右，下年種植成M2代，出現(xiàn)大量變異株，秋季選拔了78 份變異單株，突變率5.7%。

2.3 輻射劑量

適宜的輻射劑量是獲得良好誘變效果的前提和保證。如60Co-γ 射線等引起的輻射誘變，在一定劑量范圍內(nèi)，突變率與劑量呈正相關(guān)。近幾年，利用蘭州重離子加速器裝置（HIRFL）生物輻射終端（TR4），采用高能重離子束碳（12C6+）輻射水稻種子，胚部朝上，能量80 MeV/u，劑量率20 Gy/min，摸索出150～180 Gy 為適宜輻射劑量。目前，在輻射劑量的選擇上一般廣泛采用半致死劑量，即照射后植株的成活率與死亡率各占50%左右，結(jié)實(shí)率在30%以下[12]。半致死劑量是對大量被誘變材料M1代植株的成活率或死亡率進(jìn)行統(tǒng)計而得出的，在對一個新的植物或農(nóng)作物材料進(jìn)行輻射誘變時，必須先摸索出半致死劑量，做到有的放矢。但半致死劑量只是體現(xiàn)在M1植株的成活率上，并不說明只有采用半致死劑量輻射后代就一定能夠出現(xiàn)較多的有益突變，輻射誘變育種的最終目標(biāo)是使被輻射材料發(fā)生更多的有益突變，從中選擇符合當(dāng)前育種目標(biāo)需要的材料進(jìn)而培育出新品種。因此，在高能離子束輻射誘變育種實(shí)踐中不需過分關(guān)注半致死劑量，半致死劑量只作為輻射劑量的參考，至于半致死劑量與出現(xiàn)有益突變的概率有沒有直接的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究?！耙蚴露恕?，無論劑量如何，只要在誘變后代材料中出現(xiàn)有益突變，就抓住不放，跟蹤到底。如在進(jìn)行高能重離子束碳（12C6+）輻射誘變北方粳稻的育種科研工作中，一般采用輻射劑量150～180 Gy，M1植株的成活率及結(jié)實(shí)率都明顯降低，一般成活率在10%～30%之間，結(jié)實(shí)率在30%以下，但后代材料都有不同類型的突變體出現(xiàn)，只是突變率高低有差異。至于哪個輻射劑量產(chǎn)生的有益突變多還需要今后進(jìn)一步跟蹤調(diào)查并進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計分析。

3 后代材料的種植與選擇

確定M1代種植群體大小是根據(jù)M2代群體所需數(shù)量來決定，而M2代群體大小以是否能出現(xiàn)符合育種目標(biāo)要求的優(yōu)良類型和植株為依據(jù)，一般M2群體要10 000 株以上[12]。從以往的經(jīng)驗(yàn)看，采用60Co-γ 射線輻射水稻后代材料的種植規(guī)模相對較大，尤其是M2群體。昭道祖[13]報道的我國著名水稻品種原豐早是采用60Co-γ 射線輻射科字6 號干種子，從M1每個主穗上收取幾粒種子，M2代種植群體達(dá)到14 400 個單株，從中選出4 個早熟株，其中1 單株比原品種早熟40 多d，性狀良好（代號692-1），經(jīng)過5 個世代、2年多的時間育成比原品種早熟45 d 的原豐早；夏英武等[14]報道了水稻品種浙輻802 在M1代共收獲6 kg 種子，M2代種植成20 萬株，采用混合法經(jīng)多次早熟性選擇育成。后代材料種植群體，除了需要增加育種試驗(yàn)田面積之外，更重要的是大大增加育種工作者田間選種的工作量，尤其是在東北進(jìn)行水稻育種，秋季決選是一年中重要的環(huán)節(jié)，秋季田間決選應(yīng)該下“繡花”功夫。但東北秋季初霜期早，如黑龍江省第二積溫帶常年初霜期為9月25日，吉林省長春地區(qū)常年初霜期為9月28日[15]，每年秋季決選時間非常短，如果群體過大、不同生態(tài)區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)次多，難以集中精力對好的材料進(jìn)行耐心細(xì)致選拔，會導(dǎo)致“走馬觀花”，甚至搞“突擊”，嚴(yán)重影響決選效果。采用高能重離子束輻射誘變技術(shù)M1、M2代種植群體規(guī)模較小，一般M1種植幾十株，M2代種植2 000 株左右。如水稻新品種東稻122、東稻275 等的選育是利用高能碳重離子束（12C6+）輻射150 粒通禾899 種子，M1成活23 株苗，成活率15.3%，M2代種植1 400 株，按變異性狀如抽穗期、株高、穗型、粒型、芒的有無等選拔了78 份變異單株，再經(jīng)3 代種植穩(wěn)定后選育出來的。每個世代選擇都從群體著眼，個體入手，一旦出現(xiàn)優(yōu)良株系就跟蹤不放，一跟到底。此外，既要選品種，也要選中間材料，兩條腿走路，同時開展多點(diǎn)試驗(yàn)，邊試驗(yàn)、邊示范、邊推廣。

4 其他一些問題

4.1 輻射親本的敏感性

同一作物的不同品種對輻射的敏感性不同[5]。水稻種子輻射后M1植株損傷程度因處理材料不同也表現(xiàn)不同，有的材料對輻射有較高耐性，反應(yīng)遲鈍，有的則表現(xiàn)高度敏感。如綏粳18、中科發(fā)5 號、通禾66 等表現(xiàn)鈍感，龍稻18、吉粳809 等表現(xiàn)敏感。但無論是敏感還是鈍感，不同材料對輻射敏感性差異的產(chǎn)生原因還不十分清楚。王佳琪等[16]選取了12 個東北粳稻品種進(jìn)行高能碳離子束（12C6+）輻射處理，結(jié)果表明，與通禾66相比，吉粳809 對高能碳離子束輻射更敏感，而抗氧化系統(tǒng)如其H2O2、O2·-和丙二醛（MDA）含量在二者輻射敏感性差異中起著重要作用。

4.2 M1 材料的天然雜交

水稻雄性不育是指雄性器官發(fā)育不完善，花粉異常，不能自交結(jié)實(shí)，而雌性器官發(fā)育正常，能夠接受外來花粉正常結(jié)實(shí)的現(xiàn)象。利用EMS 誘變水稻品種黃花占種子，經(jīng)過M1、M2代連續(xù)田間篩選得到雄性不育突變體材料[17]；利用60Co-γ 射線輻射誘變粳稻品種松香早粳種子也獲得了水稻雄性不育突變體[18]。在誘發(fā)小麥突變后代過程中也難以避免受竄粉造成的天然異交混雜[19]，CALDECOTT 等[20]的實(shí)驗(yàn)證明，在利用熱中子對燕麥Markton 品種進(jìn)行輻射誘變后代中，很多突變體可能不是輻射來的，而是由于輻射導(dǎo)致雄性器官不育而雌性器官還具有生理功能、可接受外來授粉引起的。以此推測，水稻種子經(jīng)高能重離子束輻射后，一般生理損傷將在M1代出現(xiàn)，如果種植時不設(shè)置隔離，個別M1單株也很可能出現(xiàn)小穗雌性器官發(fā)育正常而雄性器官發(fā)育受阻或花粉敗育等現(xiàn)象，也可接受外來可育花粉進(jìn)行隨機(jī)天然雜交。把這部分材料種植成M2代時實(shí)際就是雜交的F1，而真正的高能重離子束輻射導(dǎo)致的半不育M1，在種到M2代時會出現(xiàn)突變株，這種天然雜交的F1很可能也當(dāng)作突變材料被選出來，下一年種植成M3代實(shí)際是雜交的F2代，會發(fā)生分離。而真正選出來的M2代變異單株下一年種植成M3代，按照誘變育種的一般規(guī)律M3應(yīng)該是基本穩(wěn)定的，可推斷這個M2代單株來源的M3株系行是真正的輻射誘變來的，因此，由所選的M2代單株下一年全部種成M3株系行，從其穩(wěn)定情況來推測M2代真實(shí)的突變率。如果是單基因引起的“隱性大突變”，往往突變性狀在早期世代的M3、M4就基本穩(wěn)定了，這部分突變基本可以斷定是由高能重離子束輻射誘變來的；如果在M5、M6代才開始穩(wěn)定，不排除突變是天然雜交來的。確切的結(jié)果，還需要把被高能離子束輻射處理的M1代隔離和不隔離種植，分析下一年M2代的突變情況才能得出令人信服的結(jié)論。

4.3 高世代的“瘋狂分離”

從筆者的研究來看，一般高能重離子束輻射后代大多數(shù)在早代（M3～M4）就基本穩(wěn)定，也有在M5～M6代穩(wěn)定的，這部分材料不排除有外來花粉天然雜交的可能，但仍然有少部分在高世代如M9代及以后世代發(fā)生分離或瘋狂分離的現(xiàn)象。推測，如果輻射導(dǎo)致花粉敗育雌蕊正常從而產(chǎn)生了天然雜交，按照一般的后代分離規(guī)律在M5～M6代也基本穩(wěn)定了（排除天然遠(yuǎn)緣雜交），而M9代以后仍然分離或瘋狂分離的現(xiàn)象很難用常規(guī)雜交育種后代的分離規(guī)律來解釋。筆者認(rèn)為，這部分材料很有可能還是高能重離子束輻射誘變來的，因?yàn)楦吣苤仉x子束能量高、穿透能力強(qiáng)，能夠引起被輻射水稻DNA 單鏈或雙鏈斷裂等團(tuán)簇?fù)p傷[25]，從而引起遺傳物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜變化而導(dǎo)致的。

4.4 突變材料的變異性狀

據(jù)統(tǒng)計，與其輻射親本通禾899 相比，突變材料在抽穗期、株高、株型、穗型、粒型、穗粒數(shù)、千粒重等性狀上普遍發(fā)生了變異[11]。親本生育期為146 d，突變材料生育期變異在130～151 d 之間，如2020年通過吉林省品種審定的水稻新品種東稻122 生育期為132 d，比通禾899 早熟14 d，且耐鹽堿性突出；2022年審定的東稻812 生育期138 d，比通禾899 早熟8 d，且穗粒數(shù)更多。

4.5 突變材料的分子選擇

通過人為對突變材料進(jìn)行田間表型選擇是有效的，但增大了育種者的工作量，有時還把環(huán)境因素影響的性狀選擇出來，準(zhǔn)確性不高。高通量測序鑒定技術(shù)是未來突變體篩選的發(fā)展趨勢，應(yīng)逐步建立基于定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（TILING）和高分辨溶解曲線分析技術(shù)（HRM）等突變新基因的篩選技術(shù)體系。按我們的經(jīng)驗(yàn)，在突變體早期M2代對單基因控制的質(zhì)量性狀，如長粒、香味、抗稻瘟病等性狀開展分子標(biāo)記輔助選擇，能夠減少工作量，縮短育種時間。

4.6 輻射親本的重復(fù)處理

目前，輻射誘變的缺點(diǎn)是突變的方向不確定，帶有較大的隨機(jī)性，但輻射誘變具有廣譜性，即一次誘變能夠獲得多個材料同一位置多種不同程度變異及同一材料不同位置突變。是否利用輻射誘變的廣譜特性，對如通禾899 這種在以往的輻射育種實(shí)踐中被證明是好的受體親本的材料進(jìn)行高能重離子束重復(fù)輻射，這方面也需要今后做一些有益的嘗試。

總之，高能重離子束輻射誘變育種技術(shù)與其它誘變方法（化學(xué)、60Co）和常規(guī)雜交育種相比，簡單、快捷、高效，能創(chuàng)造新的材料。一旦輻射受體親本選擇正確，突變體豐富，有益突變多，一次輻射能培育出多個水稻品種，能夠彌補(bǔ)雜交育種工作量大、周期長，“千個組合、萬里挑一”的不足。