王世凱(綜述)， 薛林濤(審校)

體外受精-胚胎移植技術(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)發(fā)展至今近30年，盡管臨床治療和胚胎體外培養(yǎng)技術不斷優(yōu)化完善，但該技術的每移植周期臨床妊娠率仍然在40%左右，且多胎妊娠率居高不下[1]。目前降低多胎妊娠最有效的方法是單胚胎移植，而單胚胎移植的關鍵是選擇最具發(fā)育潛能的胚胎進行移植，這也是胚胎評估工作中面臨的最主要挑戰(zhàn)。近年來，臨床工作者希望發(fā)掘一種可以客觀評估胚胎發(fā)育潛能的參數，如基因組學[2]、蛋白組學[3]、代謝組學[4]、線粒體DNA含量[5]和活性氧檢測[6]等，但這些評估方法的準確性不一且操作復雜或需要特殊且昂貴的儀器而沒有得到廣泛使用。目前對胚胎發(fā)育潛能的評估仍是采用在特定時間點對胚胎進行形態(tài)學評價的靜態(tài)評估方法。這種評估方法對于2個觀察點之間的胚胎發(fā)育細節(jié)是不清楚的，多數研究也證實形態(tài)學評估胚胎發(fā)育潛能具有局限性[7-8]，因此開發(fā)更為準確客觀的胚胎評估體系是亟需解決的問題。近年來，隨著延時成像監(jiān)測技術(time-lapse imaging monitoring technology,time-lapse)的發(fā)展和應用，彌補靜態(tài)評估2個觀察點之間缺失的信息。time-lapse是一種瞬時曝光連續(xù)拍攝的成像技術，能夠精確記錄胚胎從受精到囊胚發(fā)育的整個過程，并通過智能數據分析建立胚胎質量評估的數據模型。該技術可以發(fā)現(xiàn)靜態(tài)胚胎評估難以發(fā)現(xiàn)的分裂事件，例如各種異常分裂模式和胚胎發(fā)育的動態(tài)時間參數，這些動態(tài)參數和胚胎發(fā)育潛能具有密切相關性[7-8]。臨床實踐中挑選發(fā)育潛能較好的胚胎進行移植，不僅可以提高胚胎著床率與妊娠率，還可以減少移植胚胎數和降低多胎妊娠的發(fā)生率[9-10]。本文針對time-lapse在體外受精-胚胎移植中應用現(xiàn)狀和研究進展進行綜述。

1 time-lapse在受精評估中的應用

1.1原核的評估時間 在體外受精中原核的出現(xiàn)和形成標志著受精的完成，原核一般在受精后6 h開始出現(xiàn)，靜態(tài)評估系統(tǒng)中受精的評估時間在受精后(17±1)h，但這個觀察時間段并不是最佳的觀察時間。有臨床研究通過在受精后(17±1)h評估22 308個受精卵，結果顯示大約8%的原核需要在早于這個時間段評估，在這個時間段評估原核可能會有部分正常受精的原核過早消失而評估為異常受精或未受精，降低了正常受精率[11]。Barrie等[12]采用time-lapse分析了78 348個胚胎的受精情況，其結果顯示對受精評估的最佳時間為受精后(16.5±0.5)h，并建議對目前的共識進行修改，以減少錯過評估受精的機會。還有研究也顯示使用time-lapse評估的正常受精率顯著高于靜態(tài)評估系統(tǒng)(71.44% vs 64.07%)[13]。使用time-lapse評估受精情況，可以不受評估時間的限制完整地觀察到原核的出現(xiàn)和消失事件，避免正常受精的原核過早消失而錯過評估時間。

1.2原核的形態(tài)評估 評估原核形態(tài)一般采用原核數量、大小、位置和核仁數目、排列方式的Scott-Z評分系統(tǒng)[14]，但這種評估方法對于預測胚胎發(fā)育的價值一直存在爭議。因為原核在發(fā)育過程中其排列位置和原核中的核仁分布及排列并不是固定不變的，而是動態(tài)發(fā)育的，且該評估方法受觀察時間點影響較大。Coticchio等[15]使用time-lapse回顧分析了500個受精卵原核的27個動態(tài)參數，包括雌雄原核的出現(xiàn)和消失、兩原核的運動方式、原核的并列位置和胞漿暈的出現(xiàn)和消失等，其結果顯示雌雄原核大約在受精后6.2 h同時出現(xiàn)。雌原核總是在第二極體附近出現(xiàn)，雄原核可出現(xiàn)在胞漿中不同位置，可以預測2個原核并置位置，而且雌原核總是朝向雄原核靠攏。同時也發(fā)現(xiàn)原核并置位于卵膜邊緣與胚胎的直接分裂(1個細胞分裂為3個細胞)具有密切相關，細胞暈消失到原核消失之間的時間間隔可以高度預測卵裂球數量和碎片的比例(P<0.01)。該研究數據代表了人類受精卵原核期最詳細的形態(tài)動力學描述，而這些動態(tài)數據在靜態(tài)評估中很難發(fā)現(xiàn)，利用這些指標可以進一步細化成能夠預測胚胎發(fā)育潛能的新算法。

2 time-lapse在胚胎發(fā)育潛能評估中的應用

2.1胚胎評估方法 評估胚胎發(fā)育潛能仍然是輔助生殖實驗室工作人員面臨的最大挑戰(zhàn)之一。在這個領域，卵裂期胚胎的評估目前仍然是依賴于胚胎的發(fā)育速度、碎片比例和卵裂球的均一性等形態(tài)特征作為主要參數的形態(tài)學評估方法；囊胚期評估主要參考Gardner等[16]提出的方法，采用囊胚的發(fā)育速度、擴張程度、內細胞團細胞和滋養(yǎng)外胚層細胞等指標對囊胚的形態(tài)進行評估。這兩種形態(tài)學評估方法依然是評估胚胎和囊胚發(fā)育潛能的主要方法。隨著time-lapse的廣泛應用，針對該技術的胚胎發(fā)育潛能評估方法的研究也越來越多。目前大部分評估標準都是采用動態(tài)時間參數和動態(tài)分裂模式兩部分的綜合評分，最后再結合胚胎形態(tài)學評分得到最終評分。

2.2動態(tài)時間參數在胚胎發(fā)育潛能評估中的應用 靜態(tài)評估方法中早期卵裂的評估時間為受精后(28±1)h，D2的評估時間為(44±1)h，D3的評估時間為(68±1)h，D5囊胚期的評估時間為(116±2)h[11]。胚胎在體外發(fā)育過程中并非按照預期的時間節(jié)點發(fā)育，非連續(xù)的評估方法不一定能夠反映真實的胚胎發(fā)育潛能，而time-lapse的連續(xù)性評估方法可能更能反映胚胎的發(fā)育潛能。在time-lapse評估方法中大部分采用受精后到2細胞時間(t2)、3細胞(t3)、4細胞(t4)、5細胞(t5)、2細胞到3細胞的時間(CC2=t3-t2)和3細胞到4細胞的時間(S2=t4-t3)等動態(tài)時間參數來預測胚胎發(fā)育潛能[17]。Meseguer等[18]回顧性分析了247個種植成功或失敗的移植胚胎的卵裂時間，他們發(fā)現(xiàn)了最具胚胎發(fā)育潛能預測性的參數有：t5(48.8～56.6 h)、S2(≤0.76 h)和CC2(≤11.9 h)。另一項回顧性隊列研究分析了165對夫婦的834個胚胎，使用time-lapse分析形態(tài)動力學參數與培養(yǎng)后囊胚形成之間的關系，結果顯示t2、t3、t4、t5、S2和CC2等參數與囊胚形成率和優(yōu)質囊胚率具有密切相關性[19]。之前的研究也證實胚胎動力學參數t2、t3和t4與優(yōu)質胚胎和囊胚形成顯著相關[20]。使用這些胚胎發(fā)育的動態(tài)時間參數結合形態(tài)學評估可以更好地預測胚胎的發(fā)育潛能，提高臨床妊娠率。

2.3動態(tài)分裂模式在胚胎發(fā)育潛能評估中的應用 胚胎的動態(tài)分裂模式是在time-lapse評估中發(fā)現(xiàn)的多種異常分裂，包括直接分裂(一個細胞直接分裂為≥3個細胞，direct cleavage，DC)、逆分裂(在8細胞前2個獨立的細胞重新融合為1個細胞，reverse cleavage，RC)、無序分裂(第一次分裂時細胞無規(guī)則分裂為≥4個細胞并伴隨大量碎片的產生，chaotic cleavage，CC)、多核(在2細胞或4細胞階段任何一個細胞出現(xiàn)多核，multinucleation，Mn)等異常分裂事件，而這些異常分裂在靜態(tài)評估時是不能被發(fā)現(xiàn)的。有研究顯示DC與正常分裂的胚胎相比，優(yōu)質胚胎率(46.9% vs 59.4%)和囊胚形成率(11.7% vs 43.1%)顯著降低，種植率(3.7% vs 18.0%)也有降低的趨勢[7，21]。Liu等[8]回顧分析RC對胚胎發(fā)育潛能的影響，其結果顯示出現(xiàn)RC胚胎的優(yōu)質胚胎率顯著降低，與未出現(xiàn)RC的胚胎相比，胚胎種植率更低(0/22 vs 29/131)，結果證實RC顯著損害胚胎發(fā)育而導致種植潛能下降。與CC異常分裂相關的研究結果顯示，與對照組(無CC)比較，CC的胚胎在D3卵裂期評估時胚胎形態(tài)評分較差，高度碎片化胚胎的比率較高和顯著降低囊胚形成率(14.1% vs 42.3%，P<0.01)，有CC的胚胎具有較差的發(fā)育潛能[7]。這種異常分裂模式顯著影響胚胎發(fā)育潛能，可以作為首先排除的標準。胚胎發(fā)育過程中卵裂球的多核現(xiàn)象比較常見，一般認為多核現(xiàn)象會影響胚胎的發(fā)育潛能，降低胚胎種植率和臨床妊娠率。Ergin等[22]回顧性分析511個卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期共686個胚胎，研究了多核胚胎的形態(tài)動力學對胚胎發(fā)育潛能和臨床妊娠率的影響。結果顯示，與無多核胚胎的周期相比，多核胚胎的臨床妊娠率(23.4% vs 44.0%)和種植率(23.3% vs 43.6%)顯著降低，通過time-lapse觀察多核現(xiàn)象與較低的種植率和臨床妊娠率顯著相關。有研究也顯示，異常分裂胚胎的優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率和可凍囊胚率均顯著低于分裂正常胚胎(P<0.05)，胚胎的種植率和臨床妊娠率均顯著低于正常組(P<0.05)[23]。胚胎動態(tài)分裂模式是預測胚胎體外發(fā)育效率和種植潛力的一個很有價值的參數，在臨床應用中這些異常分裂可以在胚胎評估中作為排除指標，選擇分裂正常的胚胎移植可以顯著提高臨床妊娠率和降低流產率。

3 time-lapse的胚胎篩選模型的臨床應用現(xiàn)狀

自time-lapse技術的廣泛應用以來，單一的動態(tài)時間參數或動態(tài)分裂模式評估也存在一定的局限性，對于胚胎發(fā)育潛能的預測能力還有一定局限性。胚胎篩選模型就是綜合了動態(tài)時間參數、動態(tài)分裂模式和胚胎形態(tài)學三者參數，通過賦予各種參數不同權重后得出的計算方法來預測胚胎發(fā)育潛能。2011年Meseguer等[18]首次將胚胎篩選模型應用到臨床，以t5、CC2、S2和直接分裂、多核等異常分裂模式作為指標將胚胎質量分為5個級別，通過邏輯回歸分析建立了一個回歸模型，受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線顯示該模型對胚胎的發(fā)育潛能具有較高的預測價值[ROC曲線下的面積(AUC)=0.720]。隨后他們團隊在2015年對該模型進行了擴大樣本量和對參數適當修改優(yōu)化，回顧性分析了1 664個周期，其中799個周期用于建立胚胎篩選模型，865個周期用于驗證其預測能力。該研究使用t3、CC2和t5時間參數和直接分裂、不均衡卵裂、多核等異常分裂現(xiàn)象作為指標將胚胎級別分為A、B、C、D、E 5個級別，其結果顯示隨著胚胎級別的降低，胚胎的種植率也顯著降低，邏輯回歸分析結果顯示該模型對胚胎的種植率具有較好的預測價值(AUC=0.61)[24]。Liu等[25]的研究以原核消失時間、t5、CC2、2和直接分裂、RC和細胞間接觸點等異常分裂模式作為指標將胚胎質量分為A+、A、B、C、D、E、F 7個等級，ROC曲線分析表明該模型對胚胎種植率有顯著預測能力(AUC=0.762，P=0.000)。另一項大樣本量的回顧性分析使用了3 275個胚胎建立篩選模型預測D3胚胎質量和11 218個胚胎預測囊胚形成，以原核消失、t2、t3和t5等指標將胚胎質量分為1、2、3、4、5共5組，其結果顯示此模型預測D3胚胎的種植率的AUC值為0.650，預測囊胚形成率的AUC值為0.745[9]。上述幾項回顧性研究均顯示胚胎篩選模型可以使胚胎學家更準確和客觀地進行胚胎選擇，也可以更好地預測胚胎的發(fā)育潛能，有利于在臨床中為患者挑選發(fā)育潛能最優(yōu)的胚胎進行移植，提高周期的臨床妊娠率，縮短患者達到妊娠的時間。

4 time-lapse在胚胎非整倍檢測中的應用

在體外受精-胚胎移植周期中胚胎的種植率仍然較低，胚胎的倍性是影響胚胎種植失敗和反復流產的重要原因之一。有研究顯示在體外發(fā)育的卵裂期胚胎的非整倍體率約有65%，而囊胚的非整倍體率也有45%左右[26]。目前對胚胎的非整倍體檢測主要是應用胚胎植入前遺傳學檢測。但該檢測需要技術準入、檢測費用昂貴和對胚胎的有創(chuàng)操作等缺點限制了其廣泛應用。time-lapse可以提供胚胎發(fā)育的大量詳細的動態(tài)參數，使得更多臨床工作者開始研究胚胎發(fā)育動態(tài)參數與胚胎倍性的相互關系，希望可以應用相關動態(tài)參數來預測胚胎的倍性。一項研究納入530個PGT周期1 730個囊胚，比較整倍體囊胚和非整倍體囊胚的胚胎動力學參數的差異，其結果顯示S2、t4、開始形成囊胚時間、擴張囊胚時間和囊胚孵出時間兩組存在顯著差異，這些參數可能可以預測胚胎的倍性[27]。Chawla等[28]的研究共納入430個胚胎使用CGH微陣列分析整倍體胚胎和非整倍體胚胎形態(tài)動力學參數之間的差異，結果顯示原核消失時間(tPNf)、t2、t5、CC2、t5-t2的平均持續(xù)時間在整倍體和非整倍體胚胎之間有顯著差異。國內也有學者研究了550個評分在5BC和5CB及以上的囊胚，采用單核苷多態(tài)性芯片技術檢測胚胎的倍性，比較整倍體胚胎和非整倍體胚胎的胚胎形態(tài)動力學參數，其結果顯示胚胎早期形態(tài)動力學參數t4、S2和晚期形態(tài)動力參數囊胚孵出時間可能成為預測胚胎整倍性的重要指標[29]。然而，也有學者的研究認為胚胎的形態(tài)動力參數在整倍體和非整倍體胚胎之間沒有顯著差異，并不能預測胚胎的倍性[30]。一項納入13項研究的薈萃分析結果顯示，沒有單一或組合的形態(tài)動力學參數可以預測胚胎的倍性，因此，形態(tài)動力學參數還不能作為預測胚胎整倍體的替代指標[31]。總之，對于形態(tài)動力學參數預測胚胎整倍體的研究結果不一致，需要大樣本的前瞻性隨機對照研究證實，因此使用time-lapse來預測胚胎整倍體要慎重。

5 time-lapse應用的安全性

5.1time-lapse培養(yǎng)箱的安全性 time-lapse技術實質就是在培養(yǎng)箱內加裝內置攝像裝置，每間隔一定時間對胚胎進行自動拍照，再通過軟件合成就可以看到胚胎發(fā)育的實時圖像。醫(yī)療設備廣泛應用的安全性值得考慮，time-lapse培養(yǎng)箱是否會影響胚胎的培養(yǎng)效果也值得關注。胚胎很容易受外在環(huán)境影響，需要一個穩(wěn)定的體外培養(yǎng)環(huán)境來保證胚胎的發(fā)育，而time-lapse的另一優(yōu)勢就是觀察胚胎時不用像傳統(tǒng)培養(yǎng)箱那樣把胚胎從培養(yǎng)箱中取出，以保持與母體相似的環(huán)境，這樣就可以大大減少開關培養(yǎng)箱的次數來維持胚胎處于一個恒定的培養(yǎng)條件，減少外界因素的影響，更有利于胚胎的生長發(fā)育。一項隨機對照的臨床研究納入59例患者的676個卵母細胞隨機分配到time-lapse培養(yǎng)箱和常規(guī)培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，主要評估指標是受精后D2、D3的胚胎質量、D5的囊胚形成率和胚胎種植率，其結果顯示兩組的D2、D3的胚胎質量、D5的囊胚形成率和妊娠結局沒有顯著差異，time-lapse培養(yǎng)箱可以得到和常規(guī)培養(yǎng)箱相似的培養(yǎng)結果[32]。另一項隨機對照研究共納入386例ICSI周期的患者，其中195例被分配到time-lapse組，191例被分配到常規(guī)培養(yǎng)組，主要觀察指標為胚胎種植率和胚胎形態(tài)分級。研究結果顯示兩組胚胎種植率無顯著差異，但time-lapse組D2的優(yōu)質胚胎的比例顯著高于常規(guī)培養(yǎng)組(40.4% vs 35.2%)[33]。有研究結果也證實，time-lapse培養(yǎng)對胚胎在體外的生長發(fā)育沒有顯著影響，而且可以實時監(jiān)測胚胎發(fā)育的動態(tài)過程，可以為胚胎的選擇提供更多信息[13]。這些研究均證實time-lapse培養(yǎng)是安全的，在臨床上可以更好地用于對胚胎發(fā)育潛能的預測評估。

5.2time-lapse的光暴露 time-lapse需要每間隔5～10 min曝光一次進行拍照，有研究顯示胚胎頻繁暴露在可見光下可能對其在體外發(fā)育不利，影響胚胎種植率[34]。而現(xiàn)在time-lapse每次拍照所需的曝光時間極短，全程體外培養(yǎng)每枚胚胎所曝光時間總和與常規(guī)觀察方法暴露在光源下的時間基本相同。Nakahara等[35]前瞻性地對比分析了常規(guī)培養(yǎng)箱和每間隔15 min拍照的time-lapse培養(yǎng)箱的光效應對胚胎發(fā)育的影響，結果顯示兩組在受精率和優(yōu)質胚胎率方面沒有顯著差異，說明time-lapse培養(yǎng)箱的光效應對胚胎體外發(fā)育沒有顯著影響。有回顧性研究結果也顯示使用每間隔10 min拍照頻率和每小時7個等距的焦平面連續(xù)拍攝6 d并沒有對體外胚胎的發(fā)育產生顯著影響，說明該項技術可以安全有效地用于臨床[13]。

6 time-lapse應用的局限性

目前大部分研究都趨向time-lapse可通過動態(tài)參數結合胚胎形態(tài)學建立能顯著預測胚胎的發(fā)育潛能的胚胎篩選模型，在臨床上可顯著提高胚胎的種植率。但也有研究顯示通過time-lapse挑選胚胎并不能提高胚胎種植率和臨床妊娠率。2018年的一項單中心、隨機、開放標簽、主動對照的研究納入600例患者比較time-lapse分級分類模型的D3單個卵裂期胚胎移植和常規(guī)形態(tài)學選擇D5囊胚移植的臨床結局，其結果顯示與采用常規(guī)形態(tài)選擇的D5單囊胚移植相比，采用分級分類模型的D3單胚胎移植的臨床妊娠結局明顯較低[36]。對于該技術對預測胚胎發(fā)育潛能的準確性需要更多大樣本的隨機對照試驗去證實。臨床應用上time-lapse也有局限性：(1)建立的胚胎篩選模型受胚胎實驗室的培養(yǎng)條件和所使用的設備品牌不同的影響，并不能在每個生殖中心通用，需要根據自己實驗室的實際情況對某一模型進行修改和優(yōu)化以適用于本中心[37]。(2)用于胚胎動態(tài)時間參數和動態(tài)分裂模式等參數的定義沒有權威的共識定義，各個生殖中心所用的參數不盡相同，對其他研究者參考價值不大。Ciray等[38]對time-lapse動態(tài)參數規(guī)范定義，仍需要不斷優(yōu)化和完善。(3)胚胎在體外的發(fā)育受較多的因素的影響，例如受精方式、培養(yǎng)液品牌、促排方案和精子質量等[39-40]，在對動態(tài)參數進行權重計算時也要充分考慮上述影響因素，使動態(tài)評估方法更具有效性和實用性。

7 結語

time-lapse已廣泛應用于體外受精-胚胎移植周期中，不僅克服了靜態(tài)學評估的局限，而且可以提供更多的預測胚胎發(fā)育潛能的參數，使選擇移植胚胎更加客觀和方便。通過該技術建立的胚胎篩選模型可以顯著提高胚胎的種植率，改善臨床妊娠結局。同時該技術也存在一定的局限性，在胚胎染色體整倍體預測效率及胚胎篩選模型的通用性等問題上，仍需要大樣本的前瞻性隨機對照研究來證實其有效性，使該技術不斷優(yōu)化和完善，為在體外受精-胚胎移植中的胚胎發(fā)育潛能評估提供一個全新途徑。