趙銘宇，呂 波，李 灼，潘海云，劉桂蘭

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

絕經(jīng)綜合征（menopause syndrome，MPS）的發(fā)生受性激素水平及中樞神經(jīng)遞質(zhì)變化影響。我國城市女性平均絕經(jīng)年齡（48.35±3.62）歲［1］，據(jù)統(tǒng)計局網(wǎng)站數(shù)據(jù)顯示，2008 年我國45～59 歲的女性占女性總?cè)丝跀?shù)21%，而2020 年則升至24%，隨著人口老齡化進(jìn)程，以及諸如來自社會、家庭以及心理等因素影響［2］，進(jìn)入圍絕經(jīng)期女性的比例逐年增長，女性平均有近30 年的時間在絕經(jīng)后度過［3］，因此有效預(yù)防及改善絕經(jīng)綜合征癥狀，具有重大的社會意義。

目前越來越多與生殖內(nèi)分泌相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，如Kisspeptin 基因等。Kisspeptin 基因是一類信號傳導(dǎo)神經(jīng)肽，由下丘腦Kiss-1 基因編碼，該基因可調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素分泌，與生殖功能密切相關(guān)［4］。KISS-1 基因與其受體GPR54 相結(jié)合后，刺激胞內(nèi)PLC-β 信號發(fā)送，使PIP2 代謝為二酰甘油（DAG）和肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）［5］。IP3 作為第二信使同IP3 受體（IP3R）相結(jié)合，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Ca2+的釋放，啟動細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)，通過鈣結(jié)合蛋白（CaM）等促進(jìn)下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的釋放［6］。

五加丹方具有滋補肝腎、調(diào)節(jié)陰陽、養(yǎng)血安神作用，上世紀(jì)九十年代始用于臨床，改善絕經(jīng)綜合征中多種癥狀表現(xiàn)尤其是烘熱汗出等療效顯著［7］，本實驗試圖通過對Kiss-1 細(xì)胞內(nèi)因子PLC/IP3/CaM 通路的研究，觀察五加丹方對去卵巢模型大鼠GnRH 上游因子的干預(yù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 雌性大鼠64 只，鼠齡3～4 月（由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供），合格證號：SCXK（吉）2018-0007。動物飼養(yǎng)及處理嚴(yán)格參照黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，倫理委員會批準(zhǔn)編號：201908005。

1.2 實驗藥物

五加丹方組成：刺五加50 g，生龍牡各60 g，丹參、炒酸棗仁各30 g，熟地25 g，枸杞子20 g，丹皮、赤芍、當(dāng)歸、地骨皮各15 g（門診中藥局提供）。更年安片（國藥準(zhǔn)字Z20073293）。戊酸雌二醇片（補佳樂）（批號：J20171038）。

1.3 實驗試劑及主要儀器

大鼠PLC-β 試劑盒、IP3、IP3R 試劑盒、CaM 試劑盒購于南京建成生物工程研究所。GnRH 及Calmodulin（Affinity 中國），TRIpure、Super M-MLV等由北京百泰克生物技術(shù)有限公司提供。SYBR Green 由北京索萊寶科技有限公司提供。Exicycler 96 熒光定量PCR 儀（韓國BIONEER）；Dyy-Ⅲ型電泳儀（北京六一）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與造模 隨機將64 只大鼠分為正常組（NG）10 只、模型組（MG）10 只，五加丹方高（WH）、中（WM）、低劑量組（WL）各8 只；中藥對照組（TMC）及西藥對照組（WMC）各10 只。除NG組外，余各組大鼠采用腹腔麻醉，起效后仰臥位固定大鼠，逐層進(jìn)入腹腔，摘除雙側(cè)卵巢組織，消毒止血縫合，查驗無出血關(guān)腹。摘除卵巢并觀察體征3 d后，進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片每日1 次，以連續(xù)5 d 無規(guī)律動情周期出現(xiàn)則可判定模型復(fù)制成功［8］。

1.4.2 動物給藥及取材 造模成功后，換算給藥劑量，灌胃給藥濃度為WH 組：20 g/kg 生藥，WM 組：10 g/kg 生藥，WL 組：5 g/kg 生藥，TMC 組：更年安片0.56 g·kg-1·d-1，WMC 組：補 佳 樂 片0.1 mg·kg-1·d-1；NG 組、MG 組等劑量生理鹽水，給藥周期28 d。第29 日同前使用10%水合氯醛腹腔麻醉，無菌條件下處死大鼠并按照《大鼠腦立體定位圖譜》［9］，迅速剝離出下丘腦弓狀核組織，立即用吸水紙吸凈表面水分及少許血液，當(dāng)即存放凍存管中，液氮保存并轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱備用。實驗初期，空白組灌胃死亡1 只。

1.4.3 ELISA 實驗過程 檢測時按照每1 g 與生理鹽水2 mL 的比例勻漿，3 500 r/min 20 min 制備組織勻漿液，并嚴(yán)格遵守ELISA 試劑盒要求操作，檢測各組大鼠腦組織勻漿中PLC-β1、IP3、IP3R 以及CaM 水平。

1.4.4 PCR 檢測 PCR 實驗流程及步驟：下丘腦組織勻漿后，利用Trizol 法提取總RNA，測定每組各樣本中RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄后取20 μL cDNA 樣本，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。反?yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，10 s；退火60 ℃，20 s；延伸72 ℃，30 秒，40 個循環(huán)。72 ℃，延伸2.5 min，40 ℃溫育，1 min 30 s，從60 ℃到94 ℃開始熔解，每秒1.0 ℃，25 ℃溫育1～2 min。熒光定量分析。每個樣本3 個復(fù)孔。

1.4.5 western-blot 檢測 裂解樣本，離心分離出蛋白質(zhì)抽提物，按照BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，計算出樣本蛋白濃度。制備聚丙烯酰胺凝膠，分離膠濃度為12%、15%，調(diào)整電流至最大，電壓80 V，恒壓電泳2.5 h。轉(zhuǎn)膜電壓80 V，轉(zhuǎn)印1.5 h。5%（M/V）脫脂奶粉封閉后，TBST 搖床清洗。1∶（500～2 000）稀釋一抗。ECL 化學(xué)發(fā)光。將PVDF 膜進(jìn)行掃描，用凝膠成像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清PLC-β1、CaM、IP3、IP3R 水平

與NG 組相比，MG 組PLC-β1、CaM、IP3R 水平均顯著升高（P＜0.01）；MG 組IP3 水平明顯升高（P＜0.05）。與MG 組 相 比 較，WMC 組PLC-β1 水 平顯著下降（P＜0.01）。與MG 組相比，WH、WM 組PLC-β1 水 平 明 顯 下 降（P＜0.05）。與MG 組 相 比較，WH、WM 組、WMC 組CaM 水平明顯下降（P＜0.05）。與MG 組相比，WM 組IP3 水平顯著下降（P＜0.01）；WH 組、WMC、TMC 組的IP3 水平明顯降低（P＜0.05）。與MG 組相比，WMC 組IP3R 水平明顯降低（P＜0.01），WH 組IP3R 也明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠下丘腦勻漿PLC-β1、CaM、IP3、IP3R 水平比較（±s）Tab 2 Comparison of levels of PLC-β1，CaM，IP3 and IP3R in hypothalamus homogenate of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠下丘腦勻漿PLC-β1、CaM、IP3、IP3R 水平比較（±s）Tab 2 Comparison of levels of PLC-β1，CaM，IP3 and IP3R in hypothalamus homogenate of rats in each group（±s）

注：與NG 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

IP3R組別nPLC-β1CaM IP3 76.28±14.92 141.90±15.60**96.70±21.16▲105.05±3.96*136.30±22.60**113.91±23.93*89.29±18.97▲▲7.996 NG MG WH WM WL TMC WMCF9 1 0 8 8 8 1 0 10 1.18±0.64 2.57±0.81**1.51±0.64▲1.65±0.64▲2.02±0.41*1.90±0.56*1.43±0.60▲▲3.85 88.66±26.37 224.13±59.97**125.93±15.10▲149.29±47.44 185.91±41.09**149.37±16.61▲*102.47±53.79▲5.168 75.33±15.56 144.28±21.65*79.36±23.66▲78.62±16.79▲▲133.36±19.80*83.10±29.25▲70.58±15.56▲6.558

2.2 各 組 大 鼠 下 丘 腦 組 織 GnRH、PLC-β、IP3R-1mRNA 的表達(dá)

MG 組PLC-β1 mRNA、IP3R1 mRNA 的 表 達(dá)顯著高于NG 組（P＜0.01）；WH 組、WMC 組 PLC-β 1 mRNA、IP3R1 mRNA 的表達(dá)顯著低于MG 組（P＜0.01），WM 組PLC-β1mRNA、IP3R1 mRNA 的表達(dá)也明顯低于MG 組（P＜0.05）。TMC 組、WL 組與MG 組比較，PLC-β1 mRNA、IP3R1 mRNA 的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠下丘腦弓狀核GnRH、PLC-β1、IP3R1 mRNA 表達(dá)結(jié)果比較（±s）Tab 3 Comparison of the expression of GnRH，PLC-β1 and IP3R1 mRNA in hypothalamic arcuate nucleus of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠下丘腦弓狀核GnRH、PLC-β1、IP3R1 mRNA 表達(dá)結(jié)果比較（±s）Tab 3 Comparison of the expression of GnRH，PLC-β1 and IP3R1 mRNA in hypothalamic arcuate nucleus of rats in each group（±s）

注：與NG 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別NG MG WH WM WL TMCn9 1 0 8 8 8 1 0 PLC-β1 1.000±0.060 1.75±0.156**IP3R1 1.000±0.050 1.540±0.121**GnRH 1.000±0.060 2.363±0.406**WMCF10 1.09±0.030▲▲**1.44±0.101▲**1.59±0.101**1.51±0.105 **1.02±0.032▲▲1.070±0.036▲▲*1.293±0.087▲**1.430±0.171*1.205±0.011▲**1.030±0.026▲▲1.133±0.051▲▲*1.567±0.232▲*2.143±0.500*1.537±0.229▲*1.050±0.026▲▲*11.596 33.121 2.687

2.3 各組大鼠下丘腦組織CaM、GnRH 蛋白的表達(dá)

與NG 組比較，MG 組GnRH 蛋白、CaM 蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。各給藥組GnRH 蛋白、CaM 蛋白的表達(dá)均低于MG 組（P＜0.01），WL 組CaM 蛋白的表達(dá)也明顯下降（P＜0.05）。見圖1，2及表4。

圖1 大鼠下丘腦GnRH 蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of GnRH protein in rat hypothalamus

圖2 大鼠下丘腦CaM 蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of CaM protein in rat hypothalamus

表4 各組大鼠下丘腦弓狀核GnRH、CaM 蛋白的WB結(jié)果灰度分析（±s）Tab 4 Analysis of GnRH and CaM proteins in hypothalamic arcaate nucleus of rats in each group by WB（±s）

表4 各組大鼠下丘腦弓狀核GnRH、CaM 蛋白的WB結(jié)果灰度分析（±s）Tab 4 Analysis of GnRH and CaM proteins in hypothalamic arcaate nucleus of rats in each group by WB（±s）

注：與NG 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

CaM 1.00±0.000 2.65±0.043**1.35±0.009▲▲**1.69±0.011▲▲**2.62±0.042**2.23±0.033▲▲**1.07±0.006▲▲**104.578組 別NG MG WH WM WL TMC WMCFn9 1 0 8 8 8 1 0 10 GnRH 1.00±0.000 1.94±0.026**1.14±0.018▲▲**1.32±0.024▲▲**1.63±0.033▲▲**1.38±0.031▲▲**1.03±0.019▲▲*89.553

3 討論

絕經(jīng)是女性必然經(jīng)歷的過程，由于機體激素水平及神經(jīng)遞質(zhì)的變化可引發(fā)一系列臨床癥狀，其中以血管舒縮及精神神經(jīng)癥狀早發(fā)高發(fā)，重者可誘發(fā)焦慮抑郁等心理問題［10，11］，所以對MPS 的防治尤為關(guān)鍵。中醫(yī)中藥治療MPS 療效好、副作用小，一直備受患者青睞［12］。

MPS 屬中醫(yī)學(xué)“經(jīng)斷前后諸癥”范疇［13］，既往也將其按照兼癥不同，歸屬于中醫(yī)學(xué)“臟躁”、“心悸”、“失眠”、“百合病”等疾病中。本病病機主要責(zé)之于腎，腎氣虧虛、腎陰不足乃本病發(fā)病根本。乙癸同源，由于腎陰漸衰，終致水不涵木，傷津耗血，影響肝腎之陰。王孝瑩教授認(rèn)為機體陰陽失衡后出現(xiàn)的種種癥狀可按“婦人血勞”論治，并以油煎散主之［14］。原方主治婦人氣短困倦、烘熱汗出、困倦乏力等血風(fēng)勞癥狀。王師在原方基礎(chǔ)上加味，增入滋補肝腎、養(yǎng)血安神之品，成方五加丹方，臨床應(yīng)用30年，效果顯著。

MPS 所表現(xiàn)出諸如血管舒縮、精神神經(jīng)癥狀、睡眠障礙等等，并非單一由于體內(nèi)雌激素水平的下降所引起，而是由于機體多種神經(jīng)遞質(zhì)的改變所共同參與［15］。Kisspeptin 由下丘腦Kiss-1 基因所編碼，可以作用于下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH 神經(jīng)元的上游，與GnRH 相應(yīng)受體GPR54 結(jié)合后刺激GnRH 的釋放，從而導(dǎo)致生殖軸一系列激素水平變化［16］，與生殖功能等密切相關(guān)。本研究前期報道，去卵巢模型大鼠下丘腦Kiss-1、GPR54、GnRH mRNA 表達(dá)升高，五加丹方治療組有效降低其表達(dá)，推測五加丹方下調(diào)GnRH mRNA 的表達(dá)是通過下調(diào)Kiss-1、GPR54mRNA 的表達(dá)所完成的。而Kisspeptin 通過與其受體GPR54 相結(jié)合，而后再與Gq/11α 蛋 白 結(jié) 合。PLC-β 及IP3 依 次 釋 放，IP3 與IP3 受體（IP3R）結(jié)合后啟動細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)，再 通 過CaM 等 促 進(jìn)GnRH 的 釋 放［6］。本 研 究 即 在前期研究基礎(chǔ)上，通過Kiss-1 細(xì)胞內(nèi)因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)以探討五加丹方對GnRH 因子的影響。

實驗結(jié)果顯示，與NG 組相比，MG 組PLC-β1、IP3、IP3R、CaM 水平明顯升高；PLC-β1、IP3R1、Gn-RHmRNA 的表達(dá)也顯著升高；GnRH、CaM 蛋白的表達(dá)顯著升高。前期有關(guān)五加丹方的實驗研究證實，五加丹方可明顯降低去卵巢模型大鼠血清FSH水平，其中WH 組還可使雌性大鼠去勢后血清中升高的LH 水平降低；WH、WM 組可使去勢后雌性大鼠血清中降低的E2的水平升高。與MG 組比較，WH 組、WM 組 下 丘 腦 組 織 中Kiss-1、GPR54 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），WH 組中GnRH mRNA 水平表達(dá)顯著降低（P＜0.01）［17］?？梢娙莺蟠笫笙虑鹉XGnRH 水平的升高與Kiss-1/GPR54通路中相關(guān)因子的變化趨勢成正相關(guān)，并且與IP3/CaM 系統(tǒng)中的兩種因子表達(dá)的趨勢也相同。Kiss-1同GPR54 結(jié)合以后，最終使GnRH 受到激活。去勢大鼠血清FSH 以及LH 水平升高，促性腺激素的分泌可反饋調(diào)節(jié)使下丘腦Kiss-1/GPR54 系統(tǒng)中兩因子表達(dá)升高。經(jīng)五加丹方作用后，PLC-β/IP3/CaM通路中相關(guān)基因的表達(dá)均下調(diào)，下丘腦組織中PLC-β1、IP3、IP3R 以 及CaM 的 水 平 均 有 所 降 低，PLC-β1、IP3R1 mRNA 的表達(dá)也有所降低，CaM 蛋白的表達(dá)下降，從而GnRH mRNA 和蛋白表達(dá)也下調(diào)，促性腺激素FSH 和LH 水平降低，而后兩者的升高與MPS 諸多癥狀相關(guān)［6］。

人體代謝功能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，幾乎所有疾病的發(fā)生發(fā)展都與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過度或減弱、中斷有關(guān)［18］。對于五加丹方作用于絕經(jīng)期性腺和中樞各環(huán)節(jié)的分子機制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

趙銘宇：實驗設(shè)計，數(shù)據(jù)統(tǒng)計，撰寫論文；呂波：實驗造模，藥物干預(yù)及取材；李灼：指標(biāo)檢測；潘海云：文獻(xiàn)查閱；劉桂蘭：實驗數(shù)據(jù)審核，審閱。

所有作者聲明無利益沖突關(guān)系。