趙士清 郭 青 葉 超 劉 越

（1 北京語(yǔ)言大學(xué)醫(yī)院，北京 100083；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨二科，北京 100700；3 北京市豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100072）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞伴隨周圍骨贅形成，以膝周疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限為主的慢性退行性疾病，屬中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇[1-2]。目前非甾體抗炎類作為KOA的主要治療藥物，主要在于緩解疼痛等癥狀，但并不能有效延緩疾病的發(fā)展，且存在消化道、腎、心血管等不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)[3]。在KOA中醫(yī)診療指南（2020年版）[2]指出，除對(duì)于有手術(shù)指征需進(jìn)行手術(shù)治療外，其余均推薦首選中西醫(yī)結(jié)合療法或單獨(dú)應(yīng)用中醫(yī)療法，由此可見(jiàn)中醫(yī)藥在KOA的治療中占據(jù)重要地位。桃紅四物湯始見(jiàn)于《醫(yī)宗金鑒》，全方由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、熟地黃及芍藥組成，該方以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血、行氣之功，使瘀血祛、新血生、氣機(jī)暢?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明桃紅四物湯具有擴(kuò)張血管、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等功能[4-5]。相關(guān)臨床研究也顯示該方治療早期KOA的疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙方面顯示出積極的療效[6-7]。但相關(guān)作用機(jī)制尚不十分明確。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法探析桃紅四物湯治療KOA的藥理機(jī)制，為臨床應(yīng)用桃紅四物湯治療KOA提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分和潛在靶點(diǎn) 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），收集桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、熟地黃、白芍的化學(xué)成分，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物利用度(OB≥30%) 和類藥性指數(shù)（DL≥0.18）篩選，選擇不同藥物的主要活性成分及潛在靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換為人類相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因，以作為桃紅四物湯活性成分基因靶點(diǎn)，隨后將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選 以“knee osteoarthritis”或“osteoarthritis of the knee”為檢索詞分別根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)特性檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，重復(fù)基因靶點(diǎn)保留1個(gè)，最終確定KOA疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因集的Venn分析 將桃紅四物湯化學(xué)有效成分的基因靶點(diǎn)與KOA相關(guān)基因集進(jìn)行Venn分析，二者共有基因即為桃紅四物湯治療KOA的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction network，PPI）將1.3得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0平臺(tái)，獲得相關(guān)信息后，通過(guò)Cytoscape 3.9.1的cytoHubba工具構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，分析各靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，并通過(guò)優(yōu)化與拓?fù)浞治龊筮x取平均值同時(shí)在度值分布（degree）、介度中心度（betweenness centrality）和接近中心度（closeness centrality）以上的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。

1.5 GO及KEGG通路富集分析 Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，選擇物種為homo sapiens，獲取具有顯著性的富集信息（P＜0.01），基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析結(jié)果選取P值最小的10條，京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）選取P值最小的20條，再應(yīng)用在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）分別進(jìn)行GO及KEGG富集氣泡圖繪制。

1.6 分子對(duì)接 將1.3中degree值前3活性成分作為配體、1.4中degree前3靶蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取靶蛋白3D結(jié)構(gòu)，用Pymol 2.4.1進(jìn)行預(yù)處理。Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取有效成分的sdf結(jié)構(gòu)，通過(guò)Chem3D軟件轉(zhuǎn)換成mol2文件。通過(guò)Autodock Tools 1.5.6軟件將受體和配體分別進(jìn)行處理，AutoDock Vina計(jì)算結(jié)合能，最終通過(guò)Pymol可視化數(shù)據(jù)。分子對(duì)接結(jié)果的平均結(jié)合能若低于-5 kcal/mol表明靶點(diǎn)蛋白和化合物具有較好的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 藥物主要活性成分和潛在靶點(diǎn) 桃紅四物湯中熟地黃（2）、白芍（13）、當(dāng)歸（2）、川芎（7）、桃仁（23）、紅花（22）藥物有效成分69個(gè)，將篩重后44個(gè)有效成分編碼ID。見(jiàn)表1。通過(guò)UniProt 轉(zhuǎn)化得到的標(biāo)準(zhǔn)基因靶點(diǎn)代碼（Gene Symbol），篩重后得到潛在靶點(diǎn)218個(gè)，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

圖1 桃紅四物湯中藥—化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 桃紅四物湯主要活性成分信息

2.2 構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)基因集 檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到2 331、38、73、368個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)基因，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)2 810個(gè)，篩重后共得到2 486個(gè)KOA相關(guān)靶點(diǎn)基因，構(gòu)成KOA疾病相關(guān)基因集。

2.3 藥物靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因集的Venn圖建立 Venn分析后得到桃紅四物湯與KOA共同靶點(diǎn)133個(gè)靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 桃紅四物湯活性成分靶點(diǎn)和KOA靶點(diǎn)Venn圖

2.4 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將133個(gè)交集靶點(diǎn)上傳STRING11.0平臺(tái)獲取蛋白之間的作用關(guān)系，通過(guò)Cytoscape3.9.1的cytoHubba工具構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）（圖3）。

圖3 桃紅四物湯治療KOA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 核心靶點(diǎn)的篩選 拓?fù)浞治龊笃淦骄戎禐?9.11，介度中心度均值為0.0054，近中心度均值約為0.599，篩選后得到10個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)表2。排名前3的分別為TNF、IL-6、AKT1。構(gòu)建“化合物—核心靶點(diǎn)”圖，見(jiàn)圖4。得到排名前三位的核心成分為MOL000098、MOL000422、MOL000006，即槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和木犀草素（Luteolin）。

圖4 桃紅四物湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎“化合物—核心靶點(diǎn)”圖

表2 桃紅四物湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎核心靶點(diǎn)

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析 GO富集分析獲得生物過(guò)程（BP）5 220條、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）分別為458和691條，共6 369條。選取每部分排名前10且P＜0.01的建立氣泡圖（圖5）。KEGG通路富集分析共得到254條信號(hào)通路，篩選排名前20條通路建立氣泡圖（圖6）。

圖5 桃紅四物湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的GO富集分析。BP：生物過(guò)程；CC：細(xì)胞組分；MF：分子功能

圖6 桃紅四物湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的KEGG富集分析

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表3，所有結(jié)合能均＜-5 kcal/mol，表明關(guān)鍵活性成分與靶蛋白之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。以每一靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分結(jié)合能最低的蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)接模式為例，進(jìn)一步說(shuō)明每一靶點(diǎn)能穩(wěn)定地對(duì)接到關(guān)節(jié)活性成分蛋白結(jié)構(gòu)活性口袋中，說(shuō)明關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)具有良好的活性（圖7）。

表3 分子對(duì)接結(jié)果

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)和活性成分結(jié)合模式分析。A：quercetin與TNF；B：Luteolin與IL-6；C:Luteolin與AKT1

3 討論

人口老齡化現(xiàn)象加重、飲食結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的肥胖人群增多，KOA發(fā)病率逐年提高[8-10]。相關(guān)流行病學(xué)研究報(bào)道，60歲以上人群發(fā)病率超過(guò)50%[11-12]。盡管KOA的診斷和治療有了很大的發(fā)展，西醫(yī)早期主要以緩解癥狀為主，但并不能有效延緩疾病的發(fā)展，直到晚期仍需行人工膝關(guān)節(jié)置換，無(wú)論是經(jīng)濟(jì)還是心理上，對(duì)患者都造成了巨大負(fù)擔(dān)和壓力，且在此期間患者生活質(zhì)量也大大降低[13-14]。KOA發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及多種物質(zhì)，受多種途徑調(diào)節(jié)[15-16]。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑的生物學(xué)效應(yīng)。作為一種傳統(tǒng)經(jīng)典復(fù)方，桃紅四物湯在臨床上被廣泛使用于治療骨折、軟組織損傷、骨關(guān)節(jié)炎等疾病，具有良好的療效[4,7,17]。該方以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血、行氣。方中以破血之品桃仁、紅花為主，力主活血化瘀；以甘溫之熟地、當(dāng)歸滋陰補(bǔ)肝、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；芍藥養(yǎng)血和營(yíng)，以增補(bǔ)血之力；川芎活血行氣、調(diào)暢氣血，以助活血之功。許季等[18]研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能夠有效緩解疼痛和關(guān)節(jié)僵硬等癥狀，同時(shí)能改善關(guān)節(jié)功能，優(yōu)化骨代謝指標(biāo)水平，在治療KOA方面具有很高的潛在價(jià)值，但其作用機(jī)制不明。在本研究中，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，我們篩選了桃紅四物湯治療KOA的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)和有效成分，并進(jìn)行了PPI、GO和KEGG富集分析，明確了相關(guān)可能作用機(jī)制及通路，同時(shí)利用分子對(duì)接分析靶點(diǎn)蛋白和化合物的結(jié)合活性，為臨床應(yīng)用桃紅四物湯治療KOA提供科學(xué)證據(jù)。

炎癥是KOA發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素[19]。促炎介質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，同時(shí)由于調(diào)亡及降解的產(chǎn)物進(jìn)一步誘發(fā)炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生，加重KOA病變程度[14]。本研究通過(guò)優(yōu)化與拓?fù)浞治龊筮x取平均值同時(shí)在degree、betweenness centrality和closeness centrality以上的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，篩選出10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，排名前3的分別為TNF、IL-6、AKT1。TNF作為一種常見(jiàn)的促炎介質(zhì)，受體包括TNFR1和TNFR2兩種類型，均在軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中表達(dá)[20]。TNF與受體結(jié)合后，激活下游的NF-κB信號(hào)通路，從而上調(diào)炎性介質(zhì)表達(dá)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生[21]。IL-6作為一種促炎因子，往往和TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用，導(dǎo)致軟骨下骨發(fā)生變化，引起炎性反應(yīng)和軟骨破壞[22]。此外，IL-6還可激活滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路，啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷[23]。研究表明，TNF、IL-6等炎性介質(zhì)的不斷積累導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解，同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[24-25]。而軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解是KOA進(jìn)展中嚴(yán)重的病理變化[26]。這進(jìn)一步說(shuō)明炎性介質(zhì)表達(dá)與KOA嚴(yán)重程度密切相關(guān)。AKT1作為PI3K/ATK信號(hào)通路中的重要調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，減輕炎性反應(yīng)，改善軟骨退變等方面發(fā)揮著重要作用[27]。秦燕等[28]研究發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞內(nèi)存在AKT1明顯下調(diào)現(xiàn)象。以上說(shuō)明桃紅四物湯治療KOA與調(diào)節(jié)TNF、IL-6、AKT1的表達(dá)密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、木犀草素是桃紅四物湯治療KOA的關(guān)鍵活性成分。槲皮素作為一種黃酮醇類化合物，可通過(guò)降低TNF、IL-6等炎性因子的表達(dá)水平達(dá)到抑制炎性反應(yīng)以保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的目的[29]。山柰酚具有抗炎活性，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞極化過(guò)程，減少炎性反應(yīng)，抑制滑膜炎癥，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，達(dá)到延緩KOA發(fā)展的目的[30]。NF-κB和MAPK通路是OA發(fā)展中與炎性反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在促炎因子的誘導(dǎo)下，NF-κB發(fā)生活化和核易位中，從而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的表達(dá)，MAPKs則在軟骨發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素可降低IL-1β、TNF等炎性因子表達(dá)水平，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[33]。以上3種主要活性成分相輔相成，共同在KOA的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抗炎、保護(hù)軟骨的作用，桃紅四物湯方治療KOA的療效提供有效證據(jù)。

GO通路富集分析顯示桃紅四物湯作用于KOA的發(fā)展過(guò)程中，主要涉及炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，提示桃紅四物湯治療KOA可能與抑制炎性反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)。KEGG通路富集分析主要涉及TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路及PI3K/Atk信號(hào)通路。IL-17的異常表達(dá)與OA的發(fā)病及疼痛程度密切相關(guān)，阻斷 IL-17信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能會(huì)緩解 KOA 相關(guān)的疼痛[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17信號(hào)通路在桃紅四物湯治療后顯著富集，提示該分子通路可能是桃紅四物湯緩解KOA疼痛的主要分子途徑。TNF屬于促炎細(xì)胞因子，可激活I(lǐng)L-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子，還可激活MMP3、MMP9、MMP13等MMP類基因，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)局部炎性反應(yīng)及軟骨組織重塑[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號(hào)通路顯著表達(dá)，提示桃紅四物湯不僅可以調(diào)控炎性反應(yīng)，還可抑制關(guān)節(jié)軟骨的降解而發(fā)揮對(duì)KOA的治療作用。PI3K/Atk信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、凋亡及分化等過(guò)程[37]。樓紅侃等[38]研究發(fā)現(xiàn)該通路通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)軟骨的保護(hù)作用，此外，PI3K/Atk信號(hào)通路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬活性，在一定程度上有利于延緩OA的發(fā)展[39]。

綜上所述，桃紅四物湯中的槲皮素、山柰酚、木犀草素等有效成分通過(guò)TNF、IL-6等關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路及PI3K/Atk信號(hào)通路，發(fā)揮降低炎性反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用達(dá)到治療KOA的目的，同時(shí)借助分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證有效活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間具有較強(qiáng)的結(jié)果活性，為今后研究桃紅四物湯治療KOA作用機(jī)制提供借鑒作用。但隨著技術(shù)的更新迭代，數(shù)據(jù)庫(kù)不斷更新，現(xiàn)有數(shù)據(jù)也隨之產(chǎn)生變化，相應(yīng)研究結(jié)果仍需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。