陳 菲，李 麗，包春娟

鐵死亡是一種與傳統(tǒng)細(xì)胞凋亡、壞死、自噬不同的新型細(xì)胞程序性死亡，其主要機(jī)制是在鐵離子或酯氧合酶的作用下，催化細(xì)胞的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的活性氧，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[1]。其中鐵胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與鐵蛋白自噬釋放鐵離子、不飽和脂肪酸聚合和氧化均需利用病理技術(shù)手段來鑒定。因此，涉及普魯士藍(lán)與油紅O染色兩類特殊染色技術(shù)，常規(guī)方法是用連續(xù)2張組織切片分別染色、觀察結(jié)果，弊端是無法在1張切片上直觀展示兩者的相關(guān)性。本文首次采用肺鐵死亡模型樣本進(jìn)行前固定，冷凍切片后將兩種染色套染，最終在1張切片上呈現(xiàn)鐵顆粒和脂滴的分布關(guān)系，以鑒定造模成功與否，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料冷凍組織OCT包埋劑(Thermo NEG50)，一次性刀片(Thermo MX35 ULTRA)，蘇木精(Thermo Hematoxylin 7211)，普魯士藍(lán)染色試劑盒(Solarbio G1422)，油紅O染色試劑盒(珠海貝索614041)，針式濾膜過濾器(Millipore 0.22ìm SLGP033RB)，5 mL無菌注射器，4%多聚甲醛，蔗糖溶液，巴氏滴管，吸水紙，緩沖甘油，冷凍切片機(jī)(Thermo NX70)，顯微鏡(Olympus BX51)。

1.2 方法

1.2.1冷凍切片 小鼠肺鐵死亡標(biāo)本10例，戊巴比妥處死后取肺組織，分割成單葉后立即置于4%多聚甲醛中，瓶口處塞入棉球使組織完全浸泡液體于4 ℃冰箱固定24 h、轉(zhuǎn)入15%蔗糖溶液8 h、30%蔗糖溶液24 h脫水處理，待肺葉沉底后，取出放于吸水紙上，吸除多余水分并擠適量冷凍組織OCT包埋劑浸泡15 min(圖1)。冷凍托盤加入少量OCT，待凝固后放置肺葉呈橢圓形方向涂膠包埋速凍、制片(圖2)。切片厚8 μm，貼于粘附載玻片，自然風(fēng)干備用。

1.2.2普魯士藍(lán)與油紅O套染 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分染色，均選用商品化試劑盒。(1)新鮮配置亞鐵氰化鉀和稀鹽酸混合液(將A1：Perls stainA與A2：Perls stainB等量混合)，在肺組織切片上滴染1 min，顯微鏡下控制，用巴氏滴管吸取去離子水充分清洗后，瀝水、平鋪于濕盒。(2)取油紅O染液與水3 ∶1混合，用注射器吸取并接入針式濾膜過濾器上端，勻速推注射器使染液經(jīng)過濾器從下端流出，均勻滴在切片組織上[2]，30 s后用巴氏滴管從側(cè)面清洗。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，去離子水清洗3次，緩沖甘油封固。

2 結(jié)果

肺組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，普魯士藍(lán)與油紅O套染顯示，鐵顆粒呈藍(lán)綠色，脂滴呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖3)。鐵顆粒與脂滴的分布廣泛，兩者既有獨(dú)立區(qū)域也有共染區(qū)域(圖4)，肺鐵死亡模型造模成功。

①②③④

3 討論

隨著鐵死亡的深入分析，如鐵過載導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、帕金森綜合征等)、急性腎損傷、心臟缺血性損傷、遺傳性血色病、腫瘤的發(fā)生與鐵死亡失衡亦有關(guān)聯(lián)[3-6]，對于缺血-再灌注損傷模型的建立有重大意義。普魯士藍(lán)與油紅O套染法在同一張切片上可直觀了解鐵離子與脂質(zhì)的關(guān)系，整個染色操作簡便、用時短，對鐵顆粒及脂質(zhì)有良好保護(hù)作用，其優(yōu)勢已成為特殊染色中不可或缺的技術(shù)手段。

本套染技術(shù)難點(diǎn)在于肺組織主要由各級支氣管分支及終末的大量肺泡組成含有大量氣體的海綿狀結(jié)構(gòu)。新鮮肺組織行冷凍切片易形成大面積空洞造成組織丟失；油紅O染色為防止脂滴被破壞僅能使用冷凍切片；普魯士藍(lán)染色多為石蠟切片，冷凍切片方法鮮有報道，染色時間需嚴(yán)格把控。因此，將肺組織前固定再行冷凍切片的設(shè)計方案，既能有效減少肺部空氣，又可保存鐵顆粒及脂滴的形態(tài)，其可行度高。本科室經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)摸索及重復(fù)后，已獲得穩(wěn)定及良好的染色效果：(1)4%多聚甲醛較為溫和、穿透力較強(qiáng)并能使組織硬化，可有效保護(hù)抗原、細(xì)微結(jié)構(gòu)及脂類物質(zhì)，常用于冷凍切片、細(xì)胞培養(yǎng)、心臟灌注等；蔗糖梯度脫水能減少組織中水分的殘留[7]。4%多聚甲醛及蔗糖溶液均用0.01 mol/L PBS配制最佳，其具有鹽平衡可調(diào)整pH值，起緩沖、溶解保護(hù)試劑的作用，可有效防止甲醛氧化生成甲酸，使長時間浸泡的鐵離子溶解丟失。因此，首選PBS作為溶劑。(2)肺組織較為特殊，固定時切忌漂浮狀態(tài)。由于肺內(nèi)含空氣體積較輕，易漂浮于固定液表面，放入器皿時用紗布或棉球覆蓋，固定液為體積的30～50倍，搖床振蕩可促進(jìn)肺固定[8]；也可用4%多聚甲醛灌注后再取材固定。(3)肺葉取出時需吸除多余水分，用適量OCT包埋劑浸泡15 min以上，使包埋劑充分滲透到組織內(nèi)部，填充疏松的肺泡腔，與包埋劑更融合。(4)若組織較小或較薄時，冷凍托盤需加入少量OCT包埋劑墊高，需在常溫涂抹后再冷凍，避免溫差過大導(dǎo)致組織在切片過程中脫落。包埋劑沿長軸呈橢圓形涂抹使切片受力面積小，減少皺褶產(chǎn)生；冷凍切片必須使用粘附載玻片，不宜立即水洗，應(yīng)自然風(fēng)干30 min以上再操作，可有效防止脫片。(5)普魯士藍(lán)與油紅O染色套染順序?qū)Y(jié)果影響較小，本實(shí)驗(yàn)先用油紅O染色再套染普魯士藍(lán)，由于使用了針式濾膜過濾器[2]，避免異丙醇分色且整個操作用時短，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。如使用傳統(tǒng)油紅O染色法建議先染脂滴，防止異丙醇清洗導(dǎo)致普魯士藍(lán)褪色。(6)普魯士藍(lán)染液應(yīng)現(xiàn)配、現(xiàn)用，勿使用金屬鐵制品容器，清洗切片時以去離子水為宜，防止普通水中含有鐵質(zhì)影響染色結(jié)果。染色時間應(yīng)嚴(yán)格控制，避免過染。(7)區(qū)分核固紅與油紅O的顏色，本實(shí)驗(yàn)選用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，染色效果良好。封片使用起保濕作用的緩沖甘油，切忌使用含乙醇或二甲苯的封片劑，導(dǎo)致脂滴溶解。該套染方法已獲得研究者認(rèn)可，順利完成50余例肺鐵死亡模型的染色，建議推廣使用。