王文靜，陳 通，崔琬晶，郭亞飛，潘秀云，鄧天龍,*

(1.海洋資源化學與食品技術教育部重點實驗室，天津科技大學 化工與材料學院，天津 300457；2.湖北省益欣鹽產業(yè)技術研究院有限公司，湖北 孝感 432400)

1 前言

作為人類生命必需的十四種微量元素之一，硒在人體中發(fā)揮著不可或缺的作用。通過合成谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還原蛋白還原酶、蛋氨酸亞砜還原酶等氧化還原酶，清除有害自由基及過氧化物，起到抗衰老作用[1]。硒還能保護細胞結構，調節(jié)細胞免疫，提升機體免疫力，并在預防心血管疾病，拮抗重金屬和污染物、抑制腫瘤、護肝、防治風濕及呼吸道疾病等諸多方面起到重要的作用[2]。人體所需的硒大部分靠膳食獲取，直接或間接來源于植物。

硒可分為無機硒和有機硒兩大類。植物樣品中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ) 等無機酸較少，大部分以硒蛋白、硒多糖、硒核酸等大分子硒及硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代乙硫氨酸(SeEt)等小分子有機硒化物的形式存在[3]。如在壺瓶碎米薺中，主要以硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸的形式存在，富硒西蘭花中主要以硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸形式存在，富硒大豆主要是硒代蛋氨酸以及少量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和亞硒酸鹽[4]。不同形態(tài)硒的營養(yǎng)功能、安全性、生物活性差異明顯，因此植物中硒形態(tài)的分析對合理開發(fā)富硒植物和科學補硒至關重要。

然而，植物中硒的形態(tài)種類繁多且不穩(wěn)定，且各形態(tài)的硒含量較低，其形態(tài)分析檢測具有挑戰(zhàn)性。因此，科學合理的前處理對方法的構建至關重要。在前處理過程中，既要避免原始硒形態(tài)的轉化，又不能引入污染物，并能滿足具體檢測需求。在此基礎上，簡便、高效、綠色的前處理技術受到越來越多的關注。

實驗中常采用濕法消解、微波消解、石墨爐消解、干灰化等方法處理植物樣本以測定其總硒含量[5]，但由于這些方法反應劇烈，容易使蛋白質發(fā)生變性或者分解，各硒形態(tài)被破壞或發(fā)生轉化，因此不能應用于硒的形態(tài)分析。植物樣品基體復雜，硒與氨基酸、蛋白質等相結合形成各種小分子或大分子形態(tài)，種類復雜多樣，需要根據(jù)硒的形態(tài)與植物樣本的特點、檢測需求采取相應的前處理技術。

2 植物樣品硒形態(tài)分析的前處理技術

2.1 液相萃取法(LPE)

液相萃取法是硒形態(tài)分析中應用最為廣泛的前處理技術，主要包括水提取法、酸提取法、醇提取法、酶提取法、加壓液體萃取法等方法。為提高提取效率，同時會輔以攪拌、震搖、離心、超聲、微波等技術[6]。超聲輔助提取是通過超聲波使溶液中分子運動頻率和速度增加，溶質溶劑充分接觸，從而提高提取效率；微波輔助提取則是根據(jù)物質吸收微波能力的差異性，加速樣品和溶劑間的相互作用，達到提取目的。

2.1.1 水提取法

水提取法是以去離子水為溶劑提取樣本中水溶性硒的前處理方法，適用于游離的無機硒或者非結合蛋白形式的小分子硒，如硒酸鈉、亞硒酸鈉、甲基硒代半胱氨酸等，對于以結合蛋白形式存在的大分子硒的提取效果則較差[7]。傅世利等[8]采用超聲水提法處理凍干后的臍橙樣品，經(jīng)UPLCQ-TOF-MS法測定，臍橙中SeCys2、MeSeCys和SeMet 3種形態(tài)硒的加標回收率在78.8%～92.9%之間，RSD在2.1%～7.5%間。陸奕娜等[9]針對富硒茶葉、大米樣品，建立了水提法前處理、高效液相色譜—電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術測定7種硒形態(tài)的方法，該法確定了提取最優(yōu)條件為超聲下提取2 h，提取次數(shù)為1次。張弛等[10-11]在富硒蘿卜葉、荸薺中硒的賦存形態(tài)及分布研究中采用水提法對可溶性硒進行提取，測得富硒蘿卜葉中硒水溶性蛋白硒的含量占總硒的26.78%，荸薺中水溶性蛋白質中硒的含量為17.16 μg/g。Ogra等[12]與Auger[13]等也分別將水提取方法應用到對大蒜中硒的提取過程。水提取法操作簡單，環(huán)境友好，經(jīng)濟節(jié)約，但也存在著提取效率低、適用范圍窄的缺點。

2.1.2 酸提取法

仲娜[14]采用HPLC分離技術聯(lián)用ICP - MS檢測技術分析富硒海帶樣品中的硒形態(tài)，在前處理提取劑的選擇上，比較了0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、20 mmol/L NH4AC-CH3OH(5%)及蛋白酶XIV四種提取劑，發(fā)現(xiàn)使用0.1 mol/L HCl為提取介質、超聲輔助處理時可成功提取出Na2SeO3、MeSeCys等4種硒形態(tài)，其他提取劑則提取硒的種類少或效率低。姚真真等[15]采用HPLC-ICP-MS測定蘋果中SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅵ)、SeMet、Se(Ⅳ)等5種硒形態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)采用鹽酸為提取劑時加標回收率差、采用鏈酶蛋白酶為提取劑時回收率的時效性差，而采用5 mmol/L檸檬酸為提取劑時回收率及時效性均較好。Cankur等[16]研究發(fā)現(xiàn)室溫下用0.1 mol/L HCl溶液水解24 h可以有效地從蒔蘿的葉、莖及根部提取小分子的硒。酸提取法多采用鹽酸、檸檬酸為提取劑，提取率較高，但容易造成硒形態(tài)的破壞或者轉化。

2.1.3 醇提取法

李娜[17]以大米和茶葉中的硒為研究對象，比較沸水、高氯酸—乙醇、甲醇—水、酶4種提取劑效果，得出甲醇—水提取效果最好，提取效率近 80%，進一步優(yōu)化提取條件，建立了植物產品中4種常見硒形態(tài)的HPLC-HG-AFS分析方法。韓丹[18]用陰離子交換色譜連接氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法(LC-HG-AFS)測定了用甲醇——水處理的植物樣品，得到SeCys、Se(Ⅳ) 、SeMet和Se(Ⅵ)的加標回收率分別為 95.7%、106.9%、93.3%和91.4%。Ouerdane等[19]在研究芥菜籽中的硒代葡萄糖苷時，發(fā)現(xiàn)其易在水提取過程中不穩(wěn)定而造成損失，而在70%甲醇溶液中則有較好提取效果。醇提取法一般用于有機硒的提取，成本相對較高。

2.1.4 酶提取法

酶提取法一般在較為溫和操作條件下進行，各硒形態(tài)之間的轉化少，因而是液相萃取法中應用最廣泛一種提取方法，常用的酶有蛋白酶K、蛋白酶XIV、鏈酶蛋白酶、胃蛋白酶等。陳貴宇等[20]采用蛋白酶K為提取劑，超聲1 h處理富硒茶葉，經(jīng)HPLC-ICP-MS分離檢測，SeCyS2、SeMC、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 5種硒形態(tài)在梯度洗脫下短時間得到了完全分離，加標回收率在 91.8%～109.4%之間。曹玉嬪[21]以馬卡、牛蒡為研究對象，超聲波輔助蛋白酶K-脂肪酶提取法進行前處理、HPLC-ICP-MS法進行測定，SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)4種硒形態(tài)加標回收率在95.4%～108.0%，并應用于田七7種形態(tài)硒的提取。超聲和微波是酶提取法常用的兩種輔助方法，曾鳳澤等[22]研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取相對于震蕩和超聲更能保持酶的活性，采用微波輔助蛋白酶XIV前處理、HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術測定靈芝中的6種硒形態(tài)，提取率高達99.2%，加標回收率 91.7%～98.7%，RSD0.031%～3.2%。秦沖等[23]亦采用微波輔助蛋白酶XIV測定富硒小麥，在37 ℃提取30 min，SeMet和SeCys2即可達到最大提取量。酶提取法提取率高，但耗時較長，需要超聲、微波等技術的輔助。此外，酶解法適用范圍廣，可根據(jù)硒的賦存形態(tài)合理選擇酶種類。

2.1.5 加壓液體萃取法

加壓液體萃取是在較高溫度和壓力下采用常規(guī)溶劑對固體或半固體待測物進行提取的技術，具有提取時間短、溶劑消耗少、穩(wěn)定性高等優(yōu)點。加速溶劑萃取儀 (ASE ) 的成功研制，使該技術實現(xiàn)儀器化，變得自動化、高效化[24]。Peachey等[25]通過ASE萃取系統(tǒng)用水和酶處理富硒水芥菜，處理后的樣品經(jīng)HPLC - ICP - MS測定顯示，其含有SeMC、SeMet、硒酸鹽、亞硒酸鹽等多種形態(tài)的硒。

加壓液體萃取在傳統(tǒng)液相萃取法的基礎上大大縮短了提取時間，同時在安全性、節(jié)約性方面優(yōu)點顯著，具有良好的發(fā)展前景。

2.1.6 其他液相萃取法

除以上幾種常用的提取方法，其他液相萃取的方法還有鹽提法、堿提法等，或是將幾種提取方法協(xié)同。胡婷[26]優(yōu)化了HPLC-UV-HG-AFS法測定植物中4種硒形態(tài)的方法，研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助25 mmol/L乙酸銨的前處理方式可將植物樣品中4種硒形態(tài)成功分離，分離度、回收率均能滿足實驗要求。韓婷婷等[27]建立了以1.5 mol/L KOH為提取劑、IC - HG - AFS檢測膠州灣海產品中硒形態(tài)的方法，分析海帶中硒的加標回收率為87%，相對標準偏差RSD3.2%。張路夢[28]、高二東[29]分別采用堿提法提取富硒茶葉中的硒蛋白，證明了茶葉中硒蛋白多呈堿溶性。Stefanka等[30]采用水——胃蛋白酶—胰蛋白酶三步法提取法處理蘑菇樣品，成功提取出4種形態(tài)的硒，提取效率高于一步提取法。Mounicou等[31]為研究大蒜中的硒形態(tài)，建立了一種順序提取法，依次用水、酶、鹽酸、亞硫酸鹽，二硫化碳處理樣品，該方法可以根據(jù)硒的不同來源(水溶性結合硒、細胞壁結合硒、蛋白質結合硒、元素結合硒和硒化物)有針對性的提取不同形態(tài)的硒。

2.2 固相萃取法(SPE)

作為一種常用的前處理技術，固相萃取法主要用于液體樣品分離、純化、濃縮。Yan等[32]制備了5-磺基水楊酸功能化磁鐵礦納米粒子，成功提取出腐乳汁中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet及SeCys2四種硒形態(tài)。Yathavakilla等[33]采用陽離子交換固相萃取結合ICP-Ms檢測出芥菜葉片中含MeSeMet、MeSeCys及少量SeMet。孟昭榮等[34]制備了一種交聯(lián)殼聚糖，用以富集藍莓樣品中的痕量硒，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的加標回收率分別在96.6%～107.3%與96.9%～106.3%之間。Torres等[35]采用XAD樹脂作為橄欖油樣品預濃縮的吸附劑，采用UPLC-ESI-MS法測定，硒氨基酸的回收率在84%～97%之間，檢出限為0.09 μg/kg。固相萃取法在富集的同時又能除去雜質，相較于液相萃取法，該法試劑消耗少，富集倍數(shù)高、選擇性強，容易實現(xiàn)與分析儀器的聯(lián)用。但是，只能處理液體樣品的特點增加了該方法的局限性。

2.3 液相微萃取(LPME)

液相微萃取是在液相萃取的基礎上發(fā)展而來的一種新型綠色前處理技術。其原理是目標物在樣品和提取劑之間達到分配平衡，從而實現(xiàn)目標物的提取。根據(jù)取樣方式可分為直接液相微萃取、頂空液相微萃取等。Chen等[36]采用懸浮液滴固化微萃取法結合電熱汽化電感耦合等離子體質譜法檢測茶葉中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)及有機硒，該方法RSD在5.5%以內，富集因子高達500。熊珺等[37]建立了頂空單滴液相微萃取與GC-MS聯(lián)用測定食品中揮發(fā)性有機硒的方法，將該方法應用于大蒜中二甲基硒和二甲基二硒的分析，兩者的加標回收率分為93.5%和90.6%。與傳統(tǒng)液相萃取相比，液相微萃取具有試劑消耗小、操作簡單、環(huán)境友好等優(yōu)點，且能集采樣、萃取、濃縮步驟為一體，便于實現(xiàn)與儀器的聯(lián)用[38]，在痕量元素的分析中潛力極大。

2.4 固相微萃取(SPME)

固相微萃取是一種新型的前處理方法，與固相萃取不同，其原理并非是萃取全部待測物，而是基于待測物在水樣和固定相涂層之間的分配。根據(jù)萃取方式，分為直接法、頂空法、膜保護法等。平衡后的纖維頭可直接插入GC或HPLC的進樣室，樣品經(jīng)熱解進入色譜柱，實現(xiàn)快速測樣。Gionfriddo等[39]基于廣泛應用的固相微萃取結合—氣相色譜—三重四極質譜(SPME-GC-QqQMS)方法，提出了一種新的富硒和普通馬鈴薯硒形態(tài)的分析方法，使用氯甲酸丙酯-丙醇混合物初步衍生后按照以上方法提取、分離、檢測，SeMet、MeSeCys回收率82.3%～116.3%。龔亮等[40]選擇二乙烯苯—碳分子—聚二甲基硅氧烷為吸附涂層，建立了頂空固相微萃取結合GC-MS測定食品中兩種揮發(fā)性有機硒的方法，將該方法應用于大蒜，檢測出二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe)的含量分別為4.87 μg/kg和0.25 μg/kg，加標回收率在84.6%～102.5%，相對標準偏差7.1%～9.4%，可用于食品中揮發(fā)性有機硒的分析。固相微萃取無需溶劑、簡單快速、安全性高，且裝置便攜，易實現(xiàn)自動化，近年來發(fā)展迅速。

完整的硒形態(tài)分析不僅包括前處理，還有后續(xù)的分離與檢測。目前，硒的形態(tài)分離主要依靠色譜技術，如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC) 、離子色譜(IC)、毛細管電泳技術(CE)等，檢測技術則有電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)、原子吸收光譜(AAS)、原子發(fā)射光譜(AES)等。目前，色譜分離與光譜分析儀器聯(lián)用技術被廣泛應用于硒的形態(tài)分析[41]，如高效液相色譜—氫化物發(fā)生—原子熒光聯(lián)用技術(HPLC-HG-AFS)、氣相色譜—電感耦合等離子體質譜聯(lián)用技術(GC-ICP-MS) 等。其中高效液相色譜—電感耦合等離子體質譜聯(lián)用技術(HPLC-ICP-MS) 因其檢出限低、靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強等諸多顯著性優(yōu)點而被廣泛應用于硒形態(tài)分析研究。

3 結論

樣品前處理是保證分析準確性的關鍵步驟，植物樣品基質復雜，其中的硒形態(tài)種類多、易轉化，需要根據(jù)植物樣本及硒形態(tài)特點、檢測方法的需求采取恰當?shù)那疤幚矸绞?。目前，液相萃取法是硒形態(tài)分析中傳統(tǒng)的前處理技術，其中超聲波輔助蛋白酶提取法效率最高、應用最為廣泛，加壓液體萃取法提取快、消耗溶劑少，具有良好的發(fā)展前景。近年來，液相微萃取、固相微萃取等微型化樣品前處理技術因具有操作簡單、環(huán)境友好等優(yōu)點，逐漸被應用于植物樣品中硒形態(tài)的研究。高效分離技術與靈敏的檢測技術相結合是當前硒形態(tài)分析技術的主流，隨著聯(lián)用分析技術的發(fā)展，硒形態(tài)的分析更加快速而準確。未來硒形態(tài)分析將向著提取分離檢測一體化、連續(xù)化、自動化、綠色化、超痕量方向發(fā)展，這也將促使植物樣品硒的前處理技術在微型化、簡便性、高效性等方面進一步發(fā)展。