【摘要】 "目的 "探討血漿miR-124水平與冠心病（CHD）的關(guān)系，評(píng)估血漿miR-124用于CHD無創(chuàng)診斷的價(jià)值。方法 "收集醫(yī)院診斷的CHD患者共30例為CHD組及健康人員28例為對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測兩組血漿中miR-124的表達(dá)水平；應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC），分別分析血漿miR-124對(duì)于CHD的診斷價(jià)值，進(jìn)一步分析其診斷效果。結(jié)果 "單因素分析顯示，CHD組血漿miR-124水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；多因素Logistic回歸分析顯示，血漿miR-124水平降低發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=110.245; 95%CI：1.019～375.963）。血漿miR-124診斷CHD的AUC=0.812（95%CI：0.686～0.938）；根據(jù)約登指數(shù)最大原則，篩選出血漿miR-124診斷CHD的臨界值為0.003156（2-?CT轉(zhuǎn)換后）。血漿miR-124診斷CHD靈敏度73.333%，特異度100.000%，Kappa值為0.726，診斷結(jié)果與實(shí)際結(jié)果具有較高的一致性，且無漏診。結(jié)論 "血漿miR-124的表達(dá)水平與CHD有關(guān)系，血漿miR-124水平降低發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，對(duì)CHD的診斷有一定價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 "miR-124；冠心病；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；受試者工作特征曲線

中圖分類號(hào) "R541.4 " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 "A " "文章編號(hào) "1671-0223（2023）04--04

目前，對(duì)冠心?。╟oronary heart disease，CHD）的診斷主要依賴于臨床醫(yī)生對(duì)患者臨床癥狀的判斷，進(jìn)行心電圖檢查以及進(jìn)一步的冠狀動(dòng)脈造影術(shù)進(jìn)行確診，在疾病早期仍缺乏無創(chuàng)性診斷的手段。microRNA是一類非編碼的小分子RNA，在動(dòng)植物以及人類組織細(xì)胞中廣泛存在，在蛋白質(zhì)形成過程中通過轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，參與細(xì)胞增生、分化，調(diào)控細(xì)胞的凋亡[1-2]。miR-124是miRNA家族的組成部分，根據(jù)目前的研究可知，miR-124在血管皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞功能上發(fā)揮調(diào)節(jié)的作用[3-4]。CHD患者由于血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞功能障礙引發(fā)血管狹窄，但其血漿miR-124表達(dá)水平是否會(huì)發(fā)生變化尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診的CHD患者為對(duì)象，探討血漿miR-124表達(dá)水平與CHD的關(guān)系及其臨床意義。

1 "對(duì)象與方法

1.1 "研究對(duì)象

選取2018年1月至2020年1月醫(yī)院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查確診的CHD患者30例為CHD組（病例組），同期選擇醫(yī)院年齡、性別等與CHD組患者相匹配的健康人員28例為對(duì)照組。本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有研究對(duì)象對(duì)研究內(nèi)容知情，并均簽署了知情同意書。

（1）CHD納入標(biāo)準(zhǔn)：首先參照2011年《美國心臟學(xué)會(huì)以及不穩(wěn)定型心絞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》，CHD患者需要滿足以下特點(diǎn)之一方可診斷：①既往存在心絞痛的癥狀，但近1個(gè)月內(nèi)，癥狀加重或發(fā)作頻繁；②心絞痛癥狀為近1個(gè)月之內(nèi)新發(fā)生的；③靜息性心絞痛的發(fā)作：在休息或者安靜時(shí)發(fā)作的心絞痛；④患者近1個(gè)月內(nèi)心絞痛癥狀發(fā)作的持續(xù)時(shí)間長，并且經(jīng)含服硝酸酸甘油治療后效果差的。其次經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查后提示至少一支冠狀動(dòng)脈血管其直徑狹窄程度≥50%。

（2）CHD排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有先天性心臟病或心臟瓣膜受累的，臨床確診的嚴(yán)重的充血性心衰患者；②目前合并各臟器嚴(yán)重疾病及免疫類、腫瘤類疾病，其他循環(huán)系統(tǒng)疾病如嚴(yán)重的腦血管病、下肢動(dòng)脈栓塞等；③近3個(gè)月出現(xiàn)各種損傷血管的疾病，近1個(gè)月出現(xiàn)各種急性炎癥感染等。

1.2 "資料收集

通過問卷及查閱病歷資料，收集研究對(duì)象的年齡、性別、現(xiàn)病史、既往史、吸煙史及體檢指標(biāo)，包括體重、身高、BMI（體重kg/身高m2）、空腹血糖（FPG）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.3 "實(shí)驗(yàn)室檢測方法

1.3.1 "標(biāo)本采集 "早8點(diǎn)在行冠狀動(dòng)脈造影之前，空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行靜脈采血，離心機(jī)分離血漿，收集血標(biāo)本。

1.3.2 "冠狀動(dòng)脈造影檢查術(shù) "經(jīng)評(píng)估，CHD患者具有冠狀動(dòng)脈造影的手術(shù)指征，并且無臨床禁忌，由科室專業(yè)心血管介入醫(yī)生，對(duì)患者進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影檢查術(shù)，在病情需要時(shí)行冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張輸或支架植入術(shù)。

1.3.3 "血漿總RNA提取 "應(yīng)用mirVana Paris Kit反應(yīng)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)試劑盒的說明書，按步驟分步提取血漿中的總RNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將提取的標(biāo)本放置于-80℃的冰箱內(nèi)凍存保留。

1.3.4 "cDNA的合成 "本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)采用Taqman探針法進(jìn)行，第一步配置RT-PCR的反應(yīng)體系：10×緩沖液0.8μl、RNA 4.5μl、dNTP 0.2μl、抑制劑為 0.1μl、無水的RNase 0.4μl、RNA引物1.5μl、RTase 0.5μl，總體系為8μl，經(jīng)充分搖勻后離心機(jī)離心，全過程均需在冰板上進(jìn)行操作。反應(yīng)條件設(shè)置為：16℃60 分鐘、42℃ 60分鐘、85℃ 5分鐘、4℃下保持循環(huán)。

1.3.5 "qRT-PCR 配置 "輕輕吸取各種物質(zhì)配置反應(yīng)體系，其中2×TaqMAN universal PCR Master 混合物為10μl、無水RNase 5μl、TaqMAN 探針為1μl、cDNA為 4μl，其總反應(yīng)量為20μl，充分震蕩搖勻后離心。反應(yīng)條件設(shè)定：模板預(yù)變性為95℃經(jīng)10 分鐘，中模板變性為95℃經(jīng)15 秒、60℃經(jīng)60 秒進(jìn)行退火，共40次循環(huán)；試驗(yàn)中的樣本均做一個(gè)副管，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)要重復(fù)3次，記錄每一次實(shí)驗(yàn)的CT值，經(jīng)計(jì)算取平均值錄入，后期再次經(jīng)2-?CT轉(zhuǎn)換，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 "數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。計(jì)數(shù)資料計(jì)算百分率，兩組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料使用“±s”表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用“M（P25，P75）”來表示，兩組間中位數(shù)比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。多因素分析采用Logistic回歸模型。雙側(cè)檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 "結(jié)果

2.1 "兩組臨床特征比較

CHD組BMI水平、吸煙比例顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001），兩組性別、年齡、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表1。

2.2 "兩組血漿miR-124表達(dá)水平比較

CHD組血漿miR-124表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

2.3 "血漿miR-124表達(dá)水平與冠心病關(guān)系的多因素分析

以是否冠心病為因變量（是=1，否=0），以血漿miR-124表達(dá)水平是否降低（是=1，否=0）及上述分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，血漿miR-124表達(dá)水平與冠心病仍然存在關(guān)系（Plt;0.05），血漿miR-124水平降低發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，見表3。

2.4 "血漿miR-124表達(dá)水平診斷CHD的價(jià)值評(píng)估

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血漿miR-124表達(dá)水平診斷CHD曲線下面積為0.812（95%CI：0.686～0.938），說明血漿miR-124表達(dá)水平可用于CHD診斷。根據(jù)約登指數(shù)最大原則，篩選出血漿miR-124診斷CHD的臨界值為0.003156（2-?CT轉(zhuǎn)換后），見圖1。

2.5 "血漿miR-124用于CHD的診斷結(jié)果

以血漿miR-124表達(dá)水平（2-?CT轉(zhuǎn)換后）lt;0.003156為診斷CHD的標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，血漿miR-124診斷CHD的靈敏度為73.33%，特異度為100.00%，Kappa值為0.726，表明診斷結(jié)果無誤診，且與實(shí)際結(jié)果具有中高度一致性，具有臨床應(yīng)用價(jià)值，但有一定的漏診率。

3 "討論

miRNA是一類短的，保守、單鏈和非編碼RNA分子，它作為靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解[5]。miRNA作為多種生理或病理過程中的重要調(diào)節(jié)因子正在逐漸被認(rèn)識(shí)，包括血管生成。miR-124是miRNA的組成部分，目前的研究證實(shí)miR-124具有調(diào)節(jié)心血管發(fā)育及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用[3-4]。

miR-124在心臟相關(guān)血管新生中發(fā)揮一定的作用，有研究表明其通過抑制CD151的作用發(fā)揮促進(jìn)的心臟血管生成，加重患者的心力衰竭[6]。miR-124據(jù)報(bào)道可以顯著抑制血管生成以及MCF7細(xì)胞中的腫瘤生長[7]。此外，miR-124在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中能夠下調(diào)和抑制膠質(zhì)瘤中的血管生成[8]。此外，miR124的水平與多種心血管疾病相關(guān)，在急性冠狀動(dòng)脈綜合征相關(guān)動(dòng)脈閉塞的患者中miR-124表達(dá)顯著增加，觀察到這種水平可能是緊急冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建的指標(biāo)[9]。吸煙者動(dòng)脈粥樣硬化以及晚期動(dòng)脈粥樣硬化疾病患者miR-124水平越高[10]，在某些特定的試驗(yàn)中還能夠觀察到循環(huán)miR-124表達(dá)顯著變化，被確定為心臟驟停的預(yù)后指標(biāo)[11]。然而，miR-124在CHD患者血漿中的表達(dá)水平目前尚未見報(bào)道。該研究顯示與對(duì)照組相比，CHD組血漿miR-124表達(dá)水平顯著降低，通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)其對(duì)CHD的診斷具有一定準(zhǔn)確性。根據(jù)約登指數(shù)最大原則，篩選出血漿miR-124診斷CHD的臨界值為0.003156（2-?CT轉(zhuǎn)換后），miR-124降低發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，血漿miR-124診斷CHD靈敏度73.333%，特異度100.000%，Kappa值為0.726，說明其診斷CHD與臨床診斷高度一致，但有一定漏診率。

綜上所述，血漿miR-124的表達(dá)水平與CHD有關(guān)系，血漿miR-124水平降低發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，并且對(duì)CHD的診斷有一定價(jià)值。

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[2022-12-26收稿]