【摘要】" 目的" 通過動物試驗(yàn)，探討補(bǔ)陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠行為學(xué)及腦組織能量代謝和線粒體功能的影響。方法" 應(yīng)用90只健康雄性小鼠，分為模型組、陽性對照藥組（鹽酸多奈哌齊0.45mg/kg）、大劑量組（補(bǔ)陽還五湯37.06g/kg）、中劑量組（補(bǔ)陽還五湯18.53g/kg）、小劑量組（補(bǔ)陽還五湯9.26g/kg）以及假手術(shù)組（灌服同體積生理鹽水），每組各15只小鼠。進(jìn)行行為學(xué)測試和腦組織能量代謝及線粒體形態(tài)檢測。結(jié)果" 在定位巡航試驗(yàn)中，補(bǔ)陽還五湯組（3個(gè)劑量組）小鼠的逃避潛伏期比模型組更短，平均游泳距離比模型組更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。在空間探索試驗(yàn)中，補(bǔ)陽還五湯組小鼠的穿越平臺區(qū)次數(shù)比模型組更多，目標(biāo)象限停留時(shí)間比模型組更長，相對象限停留時(shí)間比模型組更短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。在跳臺試驗(yàn)中，補(bǔ)陽還五湯組小鼠的停留潛伏期比模型組更短，錯誤次數(shù)比模型組更少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。補(bǔ)陽還五湯組小鼠的三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸肌酸（PCr）比模型組更高。在改善線粒體功能方面，補(bǔ)陽還五湯組小鼠的線粒體A250光吸收值、線粒體膜電位比模型組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。上述試驗(yàn)中，補(bǔ)陽還五湯大劑量組小鼠的檢測結(jié)果均優(yōu)于中劑量組和小劑量組（Plt;0.05）。結(jié)論" 補(bǔ)陽還五湯能夠改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，改善腦組織能力代謝及線粒體功能，具有治療AD的作用。

【關(guān)鍵詞】" 補(bǔ)陽還五湯；阿爾茨海默??；CREB/PGC-1α通路；線粒體功能

中圖分類號" R285.5" " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）10--04

阿爾茨海默?。ˋD）是一種復(fù)雜、難治的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，智能衰退是該病的主要特征。病情的持續(xù)進(jìn)展會加重患者的記憶、認(rèn)知功能損害，同時(shí)還會產(chǎn)生異常的情感行為表現(xiàn)，重癥患者完全喪失自理能力[1]。AD具體病因及發(fā)病機(jī)制不詳，目前主要采用藥物治療，常規(guī)應(yīng)用鹽酸多奈哌齊，用于增強(qiáng)膽堿能的神經(jīng)功能，進(jìn)而改善患者的認(rèn)知障礙，可以在一定程度上延緩病情進(jìn)展[2]，但尚無治愈該病的方法。中醫(yī)認(rèn)為AD屬于“呆癥”“癡呆”范疇，與患者的腎虛髓虧、氣虛血瘀、腦失濡養(yǎng)等病機(jī)有關(guān)，應(yīng)用具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)功效的補(bǔ)陽還五湯方劑進(jìn)行治療[3]。為了解補(bǔ)陽還五湯對AD的治療作用機(jī)制，本研究通過動物試驗(yàn)，分析補(bǔ)陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠行為學(xué)及腦組織能量代謝和線粒體功能的影響，結(jié)果報(bào)告如下。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

（1）試驗(yàn)動物：健康雄性小鼠90只，周齡5～10周；體重18～25g，平均21.08±2.02g。

（2）試驗(yàn)藥物：補(bǔ)陽還五湯（黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、地龍、紅花、桃仁七味中藥，生藥用量按40∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1比例制備水煎劑），選擇鹽酸多奈哌齊（陜西方舟制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030582）作為陽性對照藥，溶于生理鹽水，形成0.1mg/ml溶液。

（3）試劑：Aβ1-42（上海拜力生物科技有限公司）。

（4）試驗(yàn)儀器：SMARTWM Morris水迷宮（北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司），stoelting51700全自動腦立體定位儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司），DT-200小鼠跳臺測試儀（上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司），DB011型避暗試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）。

1.2" 動物造模及分組處理

在動物造模的過程中，將小鼠麻醉，經(jīng)過消毒后。切開小鼠頭頂正中位置，形成縱向切口。在前鹵向后1.4mm、向右1.4mm的位置，進(jìn)行打孔操作，將微量進(jìn)樣器插入，在側(cè)腦室注入Aβ1-42溶液2μl 或無菌生理鹽水2μl。其中75只小鼠注射Aβ1-42溶液，另外15只小鼠注射無菌生理鹽水（假手術(shù)組）。完成動物造模后，飼養(yǎng)小鼠7d。將90只小鼠分為6組，包括模型組、陽性對照藥組（鹽酸多奈哌齊0.45mg/kg）、補(bǔ)陽還五湯大劑量組（37.06g/kg）、補(bǔ)陽還五湯中劑量組（18.53g/kg）、補(bǔ)陽還五湯小劑量組（9.26g/kg）各15只以及假手術(shù)組（灌服同體積生理鹽水）15只。持續(xù)給藥30d后，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3" 試驗(yàn)檢測方法

1.3.1" 行為學(xué)測試" 在水迷宮試驗(yàn)中，先進(jìn)行預(yù)訓(xùn)練，將小鼠放入水中后，引導(dǎo)其尋找平臺，共訓(xùn)練1d（3次/d）。經(jīng)過預(yù)訓(xùn)練后，先后進(jìn)行定位巡航試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)、跳臺試驗(yàn)。根據(jù)以上行為學(xué)測試結(jié)果，對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評價(jià)。

1.3.2" 腦組織線粒體功能及能量代謝指標(biāo)檢測

（1）將線粒體分離緩沖液預(yù)冷處理后，對小鼠腦組織進(jìn)行沖洗，剪碎后轉(zhuǎn)移，形成勻漿液，進(jìn)行離心處理，取上清液。應(yīng)用線粒體分離緩沖液，對沉淀進(jìn)行處理，使其重懸。將勻漿液離心處理后，取上清液。將2次獲取的上清液混合，再進(jìn)行離心處理，分離上清液（胞質(zhì)組分）與沉淀（線粒體粗提物）。將沉淀置入Percoll溶液（15%濃度），重懸后，轉(zhuǎn)移至Percoll溶液（25%濃度和40%濃度）。離心處理后，獲取純化線粒體，提取后，加入線粒體儲存緩沖液（蔗糖+甘露醇+EGTA+HEPES），離心處理后，將沉淀置于線粒體儲存緩沖液中重懸。

（2）應(yīng)用純化線粒體溶解液進(jìn)行處理后，線粒體提取物被溶解，針對該過程中產(chǎn)生的可溶性蛋白進(jìn)行測定。然后應(yīng)用相關(guān)試劑盒，對線粒體的純度、腫脹度、膜電位、呼吸鏈復(fù)合物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）活性、三羧酸酸循環(huán)關(guān)鍵酶（丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶等）進(jìn)行測定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3" "SOD、MDA、GSH-PX活性的測定" "取小鼠腦組織，經(jīng)過裂解處理后，形成勻漿，經(jīng)離心處理后，取上清液，應(yīng)用試劑盒，進(jìn)行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的測定。

1.4" 觀察指標(biāo)

（1）定位巡航試驗(yàn)指標(biāo)：在水迷宮試驗(yàn)中，先進(jìn)行預(yù)訓(xùn)練，將小鼠放入水中后，引導(dǎo)其尋找平臺，共訓(xùn)練1d（3次/d）。經(jīng)過預(yù)訓(xùn)練后，進(jìn)行定位巡航試驗(yàn)。提升水位，使其高于平臺（第1象限中央）0.5cm左右。在目標(biāo)象限之外，將小鼠放入水中，記錄其找到平臺的時(shí)間，為逃避潛伏期，檢測小鼠的游泳距離，共訓(xùn)練5d（2次/d），計(jì)算平均值。

（2）空間探索試驗(yàn)指標(biāo)：在水迷宮中，將平臺撤出后，在目標(biāo)象限之外，將小鼠放入水中，觀察大鼠在水中游泳情況。在120s內(nèi)，對于小鼠的空間探索情況進(jìn)行觀察，記錄其在各象限的停留時(shí)間、路程等，共訓(xùn)練1d。降低水迷宮中水面高度，使其低于平臺1cm左右，在目標(biāo)象限之外，將小鼠放入水中，記錄其找到平臺的時(shí)間（逃避潛伏期），共訓(xùn)練1d。

（3）跳臺試驗(yàn)指標(biāo)：在小鼠離開跳臺后，會接觸通電的銅柵，記錄小鼠接觸銅柵的次數(shù)以及在跳臺上的停留時(shí)間，共訓(xùn)練2d。然后應(yīng)用避暗試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，在暗室內(nèi)通電，小鼠進(jìn)入暗室時(shí)，會受到電擊，記錄大鼠受到電擊的次數(shù)。

（4）腦勻漿液相關(guān)指標(biāo)：將小鼠殺死，取出腦組織，加入生理鹽水，形成腦勻漿液（20%濃度）。在腦勻漿液中加入0.5ml高氯酸（4%濃度），經(jīng)過離心處理后，取上清液。混合KOH溶液（20%濃度），應(yīng)用高效液相色譜（HPLC），測定三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷（AMP）、磷酸肌酸（PCr）水平。

（5）線粒體腫脹度、線粒體膜電位：取線粒體提取物（含50mg蛋白），重懸于測定緩沖液，混勻后，在25℃的條件下孵育，應(yīng)用分光光度計(jì)，測定線粒體A250光吸收值。線粒體A250光吸收值越高，說明腫脹度小。取腦組織線粒體，經(jīng)緩沖液溶解后，混勻離心，加染色混合液，在避光環(huán)境中，于37℃條件下孵育，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測，測得590nm、530nm熒光強(qiáng)度，根據(jù)兩者的比值，分析線粒體膜電位。

1.5" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1" 定位巡航試驗(yàn)結(jié)果

相比于模型組，補(bǔ)陽還五湯組（三個(gè)劑量組）小鼠在定位巡航試驗(yàn)中的逃避潛伏期相對更短，平均游泳距離相對更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。說明補(bǔ)陽還五湯可以改善模型小鼠的學(xué)習(xí)巧憶能力，且改善作用與補(bǔ)陽還五湯的劑量成正比。見表1。

2.2" 空間探索試驗(yàn)結(jié)果

相比于模型組，補(bǔ)陽還五湯組（三個(gè)劑量組）小鼠在空間探索試驗(yàn)中的穿越平臺區(qū)次數(shù)相對更多，目標(biāo)象限停留時(shí)間相對更長，相對象限停留時(shí)間相對更短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。說明補(bǔ)陽還五湯可以提高模型小鼠的空間探索能力，其作用與補(bǔ)陽還五湯的劑量成正比。見表2。

2.3" 跳臺試驗(yàn)結(jié)果

相比于模型組，補(bǔ)陽還五湯組（三個(gè)劑量組）小鼠在跳臺試驗(yàn)中的停留潛伏期相對更短，錯誤次數(shù)相對更少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。說明補(bǔ)陽還五湯可以改善模型小鼠的記憶能力，其作用與補(bǔ)陽還五湯的劑量成正比。見表3。

2.4" 腦勻漿液相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果

相比于模型組，補(bǔ)陽還五湯組（三個(gè)劑量組）小鼠的ATP、ADP、PCr相對更高，大劑量組AMP相對更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。表明補(bǔ)陽還五湯可以改善模型小鼠的腦內(nèi)能量代謝，其作用與補(bǔ)陽還五湯的劑量成正比。見表4。

2.5" 線粒體腫脹度、線粒體膜電位對比

相比于模型組，補(bǔ)陽還五湯組（三個(gè)劑量組）小鼠的線粒體A250光吸收值、線粒體膜電位相對更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。表明補(bǔ)陽還五湯可以改善模型小鼠的腦組織線粒體腫脹度及線粒體膜電位，其作用與補(bǔ)陽還五湯的劑量成正比。見表5。

3" 討論

AD的發(fā)生，對于老年人的身心健康形成嚴(yán)重的危害，隨著病情的進(jìn)展，患者會出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，生活自理能力也會逐漸降低和喪失，應(yīng)該及早進(jìn)行治療[4]。在AD的藥物治療中，選擇具有增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)功能功效的治療藥物，減輕認(rèn)知功能障礙，延緩病情的持續(xù)進(jìn)展[5]。目前，中醫(yī)藥方法開始應(yīng)用于AD的臨床治療中，補(bǔ)陽還五湯是治療該疾病的常用中藥方劑，通過補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的途徑，達(dá)到改善認(rèn)知功能的效果[6]。為了具體了解補(bǔ)陽還五湯對AD的治療作用，需要結(jié)合藥物對于CREB/PGC-1α通路的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行評價(jià)，結(jié)合線粒體功能的改善情況做出判斷[7]。相關(guān)研究指出，AD的發(fā)生和進(jìn)展，與線粒體能量代謝障礙、動力學(xué)異常有關(guān)[8-9]。補(bǔ)陽還五湯的應(yīng)用，可以有效調(diào)節(jié)CREB/PGC-1α通路，有效抑制線粒體功能和結(jié)構(gòu)的異常改變，減少線粒體功能損傷，恢復(fù)正常的腦內(nèi)能量代謝[10]。本試驗(yàn)中，補(bǔ)陽還五湯組的AD模型小鼠的學(xué)習(xí)巧憶能力較模型中明顯改善，并且補(bǔ)陽還五湯組的線粒體功能、腦組織能量代謝均優(yōu)于模型組。證實(shí)了補(bǔ)陽還五湯具有抑制線粒體功能和結(jié)構(gòu)的異常改變，減少線粒體功能損傷，恢復(fù)正常的腦內(nèi)能量代謝的作用。

綜上所述，在AD的治療，補(bǔ)陽還五湯具有良好的應(yīng)用效果，具有改善AD模型小鼠的行為學(xué)指標(biāo)及線粒體功能的作用。

4" 參考文獻(xiàn)

[1] 李雪，肖凱文，陳燕清，等.近十年中醫(yī)藥治療阿爾茨海默病研究的可視化分析[J].中國中藥雜志，2023，48（6）：1673-1681.

[2] 盧彥宇，方梓莊，范洋溢，等.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制與藥物治療研究進(jìn)展[J/OL].生理科學(xué)進(jìn)展：1-9[2023-04-06].https：//doi.org/10.20059/j.cnki.pps.2022.11.0095.

[3] 康焱紅，王金星，方芳，等.近10年補(bǔ)陽還五湯研究文獻(xiàn)可視化分析[J/OL].中國中醫(yī)藥信息雜志：1-6[2023-04-06].https：//doi.org/10.19879/j.cnki.1005-5304. 202209426.

[4] 李金堯，王雅夢，雷霞，等.補(bǔ)陽還五湯治療阿爾茨海默病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[J].中南藥學(xué)，2022，20（10）：2265-2271.

[5] 黃洋，孫英新，曾妙，等.補(bǔ)陽還五湯及其組分治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（19）：212-218.

[6] 董曉紅，王悅陽，賈佩華，等.基于炎癥反應(yīng)探討補(bǔ)陽還五湯對AD模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2020，34（4）：15-18.

[7] 牛雯穎，袁茵，鄧思瑤，等.補(bǔ)陽還五湯對氣虛血瘀模型大鼠血小板生物學(xué)指標(biāo)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（7）：3261-3265.

[8] 李欣儒，柴世凡，李蔚然，等.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制相關(guān)基因生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[J/OL].中國組織工程研究：1-6［2023-04-06].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1581.R.20230228.1050.008.html.

[9] 薛慧，安麗鳳，曲巖，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的補(bǔ)陽還五湯治療阿爾茲海默癥的作用機(jī)制研究[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（11）：1692-1697.

[10] 馮月男，孫思邈，凌爽，等.基于NF-κB/HMGB1炎性信號通路探討補(bǔ)陽還五湯對氣虛血瘀大鼠的保護(hù)機(jī)制[J].中藥材，2022，45（10）：2482-2486.

[2022-04-13收稿]