關(guān)鍵詞： 絲素蛋白；3D 打印；軟件開發(fā)；力學(xué)性能模擬；支架

中圖分類號： R318.08 文獻標志碼： A

機體內(nèi)一些受力組織（如：骨、軟骨、韌帶等）因承受著較大的機械載荷，容易損傷。這些組織缺少血管、神經(jīng)和淋巴管，組織內(nèi)的細胞遷移及增殖能力較低，難以自我修復(fù)，往往需要借助生物支架材料進行重建和修復(fù)[1-3]。傳統(tǒng)方法（如：靜電紡絲、冷凍干燥）制備的支架材料結(jié)構(gòu)簡單，應(yīng)用范圍有限。作為一種新型成型方式，3D 打印是以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，通過逐層打印構(gòu)建特定形狀和結(jié)構(gòu)材料的方法[4]，具有可精確成型復(fù)雜結(jié)構(gòu)、便于個性化定制和批量生產(chǎn)等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[5， 6]。利用3D 打印，可制備出與缺損組織的結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能（兼具結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能等仿生特征）十分接近的支架材料，有望實現(xiàn)對應(yīng)組織個性化缺損的高效修復(fù)。但目前已研發(fā)的受力組織3D 打印支架修復(fù)材料與缺損組織的力學(xué)性能（典型受力組織的彈性模量為0.68～12.49 MPa [7]，壓縮模量為0.51～1.82 MPa[8]，壓縮強度為2～18 MPa [7， 9， 10]）相差較大，如：甲基丙烯酰明膠/聚（N-丙烯酰基2-甘氨酸）支架的彈性模量只有320 kPa[11]、海藻酸鈉復(fù)合支架的壓縮強度僅為180～1 600 kPa[12]，難以滿足相應(yīng)的力學(xué)性能仿生需求。

研究表明，3D 打印支架的力學(xué)性能不僅取決于墨水本征特性，還與打印參數(shù)（如：打印線條的直徑、打印層數(shù)、相鄰打印線條的間距等）密切相關(guān)[13]。如果能通過模擬分析軟件快速預(yù)測打印支架的力學(xué)性能，則可節(jié)省大量實驗時間，進而為開發(fā)具有結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能等仿生特征的組織特異性支架提供便利。目前用于預(yù)測支架材料力學(xué)性能的軟件通常采用有限元分析方法。ANSYS 是典型的以有限元分析為基礎(chǔ)的商用力學(xué)性能分析軟件，但其要求使用者具有一定的建模和編程基礎(chǔ)，并掌握有限元分析的理論知識[14， 15]。另外，此類軟件導(dǎo)出的支架模型數(shù)據(jù)格式因與常用的3D 打印機不匹配，不能直接用于相應(yīng)3D 打印支架的快速制備。

為滿足機體典型受力組織對支架材料較優(yōu)的強韌性要求，本文基于絲素蛋白（SF）首次開發(fā)了一種可形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的強韌支架用絲素蛋白基三元復(fù)合生物墨水絲素蛋白/丙烯酰胺/氧化細菌纖維素納米纖維（RSF/AM/OBC）。同時基于有限元分析方法開發(fā)了一款操作簡便，具備3D 打印支架建模和壓縮性能模擬分析功能的軟件。相關(guān)軟件解決了目前商用軟件建模及力學(xué)性能模擬分析操作復(fù)雜、與3D 打印機互通性差等問題。此類研究有望為快速設(shè)計并制備具有組織特異性結(jié)構(gòu)和力學(xué)仿生的強韌3D 打印支架提供重要指導(dǎo)。

1 實驗及軟件開發(fā)

1.1 試劑與儀器

家蠶繭：浙江桐鄉(xiāng)；碳酸鈉、溴化鋰：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；細菌纖維素：海南省椰國食品有限公司；四甲基哌啶氮氧化物：分析純，美國Sigma-Aldrich 公司；次氯酸鈉、氫氧化鈉、溴化鈉、鹽酸、過硫酸鈉（SPS）、乙醇：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺（AM）：純度99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）：純度99%，百靈威科技有限公司；氯化三（2，2’-聯(lián)吡啶）釕（Ⅱ）六水合物（Ru）：純度99%，美國Sigma-Aldrich 公司；小鼠成纖維（L929）細胞：上海生物化學(xué)與細胞研究學(xué)研究所；鈣黃綠素（ Calcein-AM） 、碘化丙啶（ PI） ：上海翊圣生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（ PBS） ：美國Hyclone 公司；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（雙抗）：美國Gibco 公司；培養(yǎng)基（高糖DMEM）：杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。

3D 打印機：德國Envisiontec 公司，3D-Bioplotter 型；均質(zhì)機：德國IKA 公司，T18 DS25 型；pH 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，F(xiàn)G2 型；電子萬能材料試驗機：美國Instron 公司，5969 型；熒光顯微鏡：德國Leica 公司，DMi 8 型。

1.2 絲素蛋白基材料的制備與表征

1.2.1 絲素蛋白基墨水及其水凝膠的制備 RSF 凍干粉和OBC 懸浮液的制備過程參照文獻[16-18]。為了對比不同絲素蛋白基墨水的可打印性及其對應(yīng)水凝膠的力學(xué)性能，設(shè)計了RSF 單組份、AM 單組分、RSF/AM二元復(fù)合、RSF/AM/OBC 三元復(fù)合墨水。在同時含有RSF 和AM 的組別中，固定RSF 凍干粉和AM 粉末的質(zhì)量比為m（RSF）∶m（AM） =1∶17。具體操作過程：稱取一定質(zhì)量的AM 粉末和（或）RSF 凍干粉溶解于相應(yīng)質(zhì)量的去離子水中，添加相應(yīng)質(zhì)量的光引發(fā)劑Ru、催化劑SPS 和（或）交聯(lián)劑MBA（具體配方詳見表1），攪拌均勻；三元復(fù)合墨水需再加入3 g 的OBC 懸浮液（w=4%）再次攪拌均勻；然后將配制好的墨水置于棕色瓶中避光保存。每種墨水在15 W 的白光照射下交聯(lián)10 min 后即可形成相應(yīng)的水凝膠。

1.2.2 絲素蛋白基墨水的可打印性驗證 將1.2.1 制備的墨水分別裝入棕色打印針管，依次安裝到3D 打印機上，選用內(nèi)徑340 μm 的打印針頭，相鄰線條間距設(shè)置為1 mm，針頭移動速率為8 mm/s、擠出壓力為35 kPa。最終打印成矩形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。在線條打印的同時進行白光固化。若能順利打印出該矩形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)且可維持相應(yīng)形狀，則證明墨水可打印性較好；反之，則證明墨水打印性差。

1.2.3 絲素蛋白基水凝膠及其3D 打印支架力學(xué)性能表征 利用電子萬能材料試驗機（傳感器1 kN）進行測試。

水凝膠樣品：拉伸樣品為矩形，尺寸為35 mm×4.5 mm×1 mm；單軸拉伸速率50 mm/min；彈性模量通過擬合應(yīng)力-應(yīng)變曲線中應(yīng)變?yōu)?.5%～1% 的直線斜率所得。壓縮樣品為圓柱體，直徑為11 mm，高度為7 mm，壓縮速率10 mm/min；壓縮模量通過擬合應(yīng)力-應(yīng)變曲線中應(yīng)變?yōu)?%～10% 的直線斜率得到；將應(yīng)力-應(yīng)變曲線中應(yīng)變?yōu)?0% 處的應(yīng)力作為水凝膠樣品的壓縮強度。

3D 打印支架樣品：拉伸樣品為矩形，尺寸為15 mm×4.5 mm×1 mm，線條間距為0.9 mm；壓縮樣品為圓柱體，直徑為12 mm、高度為6 mm、線條間距為0.9 mm。3D 打印支架力學(xué)性能的測試條件和計算方法同水凝膠的一樣。測試溫度為室溫，相對濕度為（50 ± 5）%。

1.2.4 絲素蛋白基3D 打印支架細胞相容性表征 將RSF/AM/OBC 打印支架放置于12 孔培養(yǎng)板中，用體積分數(shù)（φ）為75% 的乙醇分別浸泡打印支架2 h 對其進行滅菌，再經(jīng)PBS 潤洗，然后在每個打印支架上接種4×104個L929 細胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)液2 d 一換，7 d 后用Calcein-AM 和PI 對材料上的細胞染色，采用熒光顯微鏡觀察各支架中的活/死細胞情況，活細胞將被染為綠色、死細胞將被染為紅色，用Image J 軟件對支架上的活/死細胞進行計數(shù)并進一步計算細胞在支架上培養(yǎng)7 d 后的存活率。

1.3 3D 打印支架建模及壓縮性能模擬分析軟件開發(fā)及功能驗證

1.3.1 軟件開發(fā) 基于COMSOL Multiphysics 提供的App 開發(fā)器，采用JAVA 編程語言，開發(fā)3D 打印支架建模及壓縮性能模擬分析軟件。其中，利用表單編輯器繪制軟件的操作頁面，借助應(yīng)用編程接口設(shè)置了幾何建模功能和物理場，并通過有限元分析進行計算及后處理。為了提高計算準確度，底層算法基于大形變的非線性固體力學(xué)模型，底層采用的本構(gòu)方程為：

E = E₀ （1+εⁿ）

其中，E 為壓縮模量，E₀ 為零應(yīng)變彈性模量，\"為應(yīng)變，n 為應(yīng)變指數(shù)，公式中的各個變量根據(jù)材料的力學(xué)性能參數(shù)擬合得到。壓縮性能計算時，采用直接式剛度矩陣 PARDISO 求解器，計算效率相對較高。

該軟件的核心功能包括： （1）建立3D 打印支架模型：在“3D 打印支架設(shè)計”面板區(qū)域，通過設(shè)置線條直徑、相鄰線條的間距、層數(shù)、立方體支架的長度和寬度（或圓柱體支架的直徑）等參數(shù)后，點擊“繪制幾何”后即可自動繪制對應(yīng)3D 打印支架的幾何模型（圖1（a））；（2）對建立的支架模型進行壓縮力學(xué)性能模擬預(yù)測：將支架模型劃分網(wǎng)格后，在“材料屬性”面板區(qū)域輸入墨水的彈性模量、泊松比和密度參數(shù)，點擊“計算”即可模擬計算模型支架的壓縮性能。開發(fā)軟件可以展示的壓縮性能數(shù)據(jù)形式包括應(yīng)力云圖、應(yīng)變云圖、應(yīng)力-應(yīng)變曲線，相應(yīng)的圖片和應(yīng)力-應(yīng)變曲線數(shù)據(jù)均可導(dǎo)出，便于后續(xù)分析和處理（圖1（b））；（3）模型數(shù)據(jù)導(dǎo)出與3D 打印機共享：建立3D 打印支架模型后，點擊“幾何文件導(dǎo)出”，進入對應(yīng)界面后選擇相應(yīng)的格式即可導(dǎo)出幾何模型文件，可導(dǎo)出的文件格式包括STL、Parasolid、ACIS、IGES、STEP 等，相關(guān)文件可直接導(dǎo)入特定的3D 打印機中指導(dǎo)支架的快速制備（圖1（c））。

1.3.2 3D 打印支架模型設(shè)計及壓縮性能模擬預(yù)測 為驗證軟件可導(dǎo)出模型文件指導(dǎo)3D 打印，并能夠較好預(yù)測打印支架壓縮力學(xué)性能，利用所開發(fā)軟件的3D 打印支架建模功能，構(gòu)建了如表2 所示的不同高度和不同孔隙率的6 種打印支架（ 3D printing scaffold， 3DS）模型。打印支架模型劃分網(wǎng)格后，輸入擬用生物墨水RSF/AM/OBC 的特征參數(shù)：彈性模量為3 100 kPa（1.2.3 中所測RSF/AM/OBC 水凝膠樣品的彈性模量）、泊松比為0.456（委托米格實驗室測試）、密度為1 756 kg/m3（利用已知體積的模具制備RSF/AM/OBC 水凝膠，然后用稱重法獲得該水凝膠的質(zhì)量），進一步模擬計算后得到設(shè)計支架模型的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線數(shù)據(jù)。

1.3.3 不同高度和不同孔隙率3DS 的制備 將軟件創(chuàng)建的6 種支架模型數(shù)據(jù)導(dǎo)出為STL 格式的模型文件，然后將相關(guān)模型文件導(dǎo)入到3D 打印機中。利用RSF/AM/OBC 墨水，通過3D 打印機制備出6 種與設(shè)計模型高度一致的打印支架實物。

1.3.4 不同高度和不同孔隙率3DS 壓縮力學(xué)性能實測 利用電子萬能材料試驗機進行測試。各打印支架的尺寸如表2 所示，壓縮速率10 mm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 RSF/AM/OBC 生物墨水的可打印性及對應(yīng)水凝膠的力學(xué)性能

作為一類天然生物基材料，RSF 具有良好的生物相容性和生物可降解性[19-21]，且便于加工、易于批量獲取，是組織工程支架的理想構(gòu)筑材料之一[22， 23]。因此本文選用RSF 作為開發(fā)強韌3DS 構(gòu)筑所需生物墨水的重要成分。

在組織工程支架的多種成型加工方法中，3D 打印能夠精確成型具有仿生結(jié)構(gòu)的組織工程支架。單獨的RSF 墨水由于自身特性的限制不能3D 打印且制成水凝膠的力學(xué)強度和韌性也較差[24]。相關(guān)文獻報道表明其可以通過與其他材料形成互穿網(wǎng)絡(luò)或者雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并進一步借助納米顆?；蚶w維的復(fù)合等來獲得性能增強的絲素蛋白基復(fù)合生物墨水[25， 26]。細菌纖維素納米纖維具有優(yōu)異的力學(xué)性能、巨大的比表面積、高持水性和良好的生物相容性[27， 28]；被氧化后，OBC 帶有帶負電荷的羧基，這增加了纖維之間的排斥力，從而使纖維能在水溶液中形成穩(wěn)定的分散狀態(tài)，可以提高絲素蛋白基墨水的可打印性[29]。然而，研究表明RSF/OBC 水凝膠的力學(xué)性能仍然較差，其壓縮應(yīng)變約為55%，壓縮模量為60～300 kPa，拉伸時較易斷裂[17]。AM 作為一種單體[30]，其交聯(lián)后形成的PAM 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻致密，具有天然高分子水凝膠不可比擬的力學(xué)性能[31]，尤其是韌性，經(jīng)測試其拉伸時斷裂伸長率可達（624.30 ± 151.06）%。因此，本文選擇以RSF 和AM 為基質(zhì)材料、OBC為填料制備可形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的RSF/AM/OBC 墨水，首先對以該墨水制成的水凝膠力學(xué)性能進行了測試，結(jié)果顯示在拉伸和壓縮時，RSF/AM/OBC 水凝膠展現(xiàn)出較好的強度和韌性：彈性模量和壓縮模量分別為（3.11 ±0.22） MPa 和（1.99 ± 0.23） MPa，壓縮強度為（7.76 ± 0.26） MPa，斷裂伸長率為（122.53 ± 11.99）%，壓縮應(yīng)變可達70% 以上（表3）。另外，由于OBC 的加入，RSF/AM/OBC 生物墨水亦具有良好的可打印性（表3）。

2.2 RSF/AM/OBC 打印支架的力學(xué)性能與細胞相容性

為滿足受力組織修復(fù)或再生的要求，理想的仿生支架需具有良好的生物相容性，并具備和受損組織高度匹配的力學(xué)性能。RSF/AM/OBC 墨水制備的3DS 具有優(yōu)異的力學(xué)性能（圖2），其彈性模量和壓縮模量分別為（1.86 ± 0.28） MPa 和（1.95 ± 0.11） MPa，壓縮強度為（6.77 ± 0.74） MPa，相關(guān)打印支架力學(xué)性能在機體受力組織的壓縮強度范圍（2～18 MPa）內(nèi)[7， 9-10]，RSF/AM/OBC 支架同時還具有良好的韌性，其斷裂伸長率為（114.03 ±14.40）%（圖2（a）），壓縮應(yīng)變可達70% 以上（圖2（b）），同樣可以滿足機體受力組織的常規(guī)變形（0.1%～100%）需求[29]。

支架良好的細胞黏附性有利于細胞在支架內(nèi)生長，從而形成新的組織。由于RSF[32]、PAM [33] 和OBC[34]組分都具有良好的生物相容性，L929 細胞在3D 打印RSF/AM/OBC 支架上培養(yǎng)7 d 后，細胞幾乎鋪滿了整個支架表面，且生長良好，形態(tài)多為梭形，細胞存活率超過92.4%（如圖3 所示），表明該支架具有良好的細胞相容性，利于種子細胞的存活和增殖。

2.3 軟件核心功能驗證

2.3.1 3DS 建模及模型數(shù)據(jù)導(dǎo)出指導(dǎo)3DS 的快速制備 為了驗證所開發(fā)軟件的建模和指導(dǎo)3DS 快速制備的功能，本研究以前述RSF/AM/OBC 三元復(fù)合生物墨水為模型材料，利用所開發(fā)軟件建立的3DS 模型文件導(dǎo)入3D 打印機中成功制備了對應(yīng)的支架材料，如圖4 所示。軟件繪制的模型導(dǎo)入到3D 打印機中形成的打印路徑與軟件建立的模型一致，這為開發(fā)軟件設(shè)計的模型數(shù)據(jù)直接快速指導(dǎo)3DS 的制備奠定了堅實基礎(chǔ)。打印支架實物與對應(yīng)的軟件模型相比有一定的差異，主要原因是RSF/AM/OBC 三元復(fù)合墨水是切力變稀漿料，在打印針頭處會產(chǎn)生擠出脹大現(xiàn)象，線條的直徑要比設(shè)計值略大。

2.3.2 3D 打印支架壓縮性能的模擬分析結(jié)果與實測結(jié)果對比 分別用軟件模擬分析和實際測試的方法得到了不同高度和孔隙率的RSF/AM/OBC 支架的壓縮力學(xué)性能數(shù)據(jù)。對比結(jié)果表明，打印支架的實測數(shù)據(jù)和軟件模擬獲得的理論數(shù)據(jù)吻合度較高，即兩種方法得到同種支架材料的應(yīng)力-應(yīng)變曲線變化趨勢高度一致（圖5）。另外，如圖5 所示，高度（打印層數(shù)）的變化對于RSF/AM/OBC 支架的壓縮力學(xué)性能影響不大，孔隙率（打印線條間距）的變化對于RSF/AM/OBC 支架的壓縮力學(xué)性能影響顯著，孔隙率越大，支架的壓縮強度越小。因此，可以通過本文開發(fā)的軟件高效地設(shè)計兼具結(jié)構(gòu)仿生和力學(xué)性能仿生的組織特異性支架材料模型，然后利用3D 打印這一成型方法快速制備出與設(shè)計支架外觀形貌和力學(xué)性能高度一致的組織特異性仿生支架材料。

3 結(jié)論

（1）開發(fā)了一種基于絲素蛋白的可形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的三元復(fù)合生物墨水RSF/AM/OBC。OBC 的加入可顯著提升生物墨水的可打印性及相應(yīng)打印支架的力學(xué)強度，丙烯酰胺的引入可保證墨水在打印過程中形成雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進而顯著提升打印支架的強韌性能。RSF/AM/OBC 墨水具有優(yōu)異的可打印性，其對應(yīng)的3D 打印支架具有強度高、韌性好、細胞相容性好等綜合優(yōu)勢，有望用于機體受力組織的修復(fù)和再生。

（2）開發(fā)的3D 打印支架模擬分析軟件操作簡便，不僅可用于3D 打印支架的建模及其壓縮力學(xué)性能的準確預(yù)測，其建立的模型數(shù)據(jù)亦可直接導(dǎo)入3D 打印機指導(dǎo)對應(yīng)支架的高效制備。相關(guān)墨水材料和軟件的開發(fā)有望為快速設(shè)計并制備具有組織特異性結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能等仿生特征的3D 打印支架提供重要指導(dǎo)。