【摘要】 "目的 "評估m(xù)iR-9-3p對ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）基因及蛋白表達(dá)的影響。方法 "采用HepG2細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、miR-9-3pmimics轉(zhuǎn)染、實(shí)時定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）以及Western blotting免疫印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分析miR-9-3p對細(xì)胞ABCA1 mRAN及蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果 "①miR-9-3p轉(zhuǎn)染組miR-9-3p水平較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001），證明轉(zhuǎn)染成功；②兩組ABCA1 mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；③miR-9-3p轉(zhuǎn)染組ABCA1蛋白水平較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論 "miR-9-3p能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ABCA1蛋白表達(dá)，但對轉(zhuǎn)錄水平未見顯著影響。

【關(guān)鍵詞】 "miR-9-3p；HepG2細(xì)胞；ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1；細(xì)胞轉(zhuǎn)染；Western blotting免疫印跡

中圖分類號 "Q78;R541.4 " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼 "A " "文章編號 "1671-0223（2023）06--03

miR-9-3p是microRNA家族成員之一，在機(jī)體血管發(fā)育過程以及血管性疾病如動脈栓塞及狹窄過程中產(chǎn)生作用，研究表明其對于血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、心肌細(xì)胞的增生等過程具有調(diào)節(jié)作用，但其是否在冠心病相關(guān)基礎(chǔ)病變中產(chǎn)生作用，尚未見報(bào)道[1-2]。然而，miR-9-3p與動脈粥樣硬化性疾病的關(guān)系及其作用機(jī)制尚不明確。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿miR-9-3p表達(dá)水平顯著低于正常人[3]，但miR-9-3p是否通過調(diào)節(jié)冠心病的危險(xiǎn)因素-血脂發(fā)揮作用尚未表明。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）是體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，形成膽汁酸排除，其在膽固醇表達(dá)水平方面發(fā)揮重要作用[4]，關(guān)于miR-9-3p是否對細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，未見報(bào)道。HepG2細(xì)胞是肝細(xì)胞類型之一，能夠模擬肝細(xì)胞代謝過程，本實(shí)驗(yàn)以此細(xì)胞為研究對象，探討miR-9-3p是否對細(xì)胞ABCA1的表達(dá)產(chǎn)生影響。

1 "資料與方法

HepG2細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

1.1 "細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞用PBS洗2次，將配制好的miR-9-3p轉(zhuǎn)染復(fù)合物，分別加入到6孔板中，加入Opti-MEM培養(yǎng)基750μl/孔，混合均勻，于 37℃、5.0﹪CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2 "細(xì)胞qRT-PCR

1.2.1 "細(xì)胞總RNA的提取 "轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)束后輕柔剝離細(xì)胞，使細(xì)胞脫落并進(jìn)一步應(yīng)用裂解液裂解，吸取上清液，加入等體積的異丙醇加入離心管，留取試管底部白色沉淀物，吸取75%的乙醇1ml緩慢沿管壁加入離心管，離心后棄去。于室溫下干燥5min，使乙醇完全揮發(fā)，加入70～80μl DEPC處理水溶解沉淀，待miRNA沉淀完全溶解后，-80℃冰箱保存。

1.2.2 "細(xì)胞mRNA qRT-PCR "引物序列：

ABCA1：5'ATGTGGAGTTCTTTGCCCTCCTGA3'（上游）

5'CTTTCGTTTGTTGCCGCCACTGTA3'（下游）

β-actin：5'ACAGAGCCTCGCCTTTGC3'（上游）

5'CCACCATCACGCCCTGG3'（下游）

以β-actin作為本部分實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，配置反應(yīng)體系為：2×Step SYBR?RT-PCR Buffer 4 10μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 1.0μl、PCR Forward Primer（10μM）1.0μl、PCR Reverse 引物（10μM） 1.0μl、總RNA4.0μl、無酶水3μl，總反應(yīng)體系一共20μl。

反轉(zhuǎn)錄條件：42℃30min、95℃10min 1個循環(huán)，PCR反應(yīng)條件：95℃10s、60℃60s 40循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄反應(yīng)的Ct值，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。

1.3 "Western blot

1.3.1 "細(xì)胞總蛋白的提取 "實(shí)驗(yàn)細(xì)胞完成miR-9-3pmimics轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用緩沖液清洗3次之后再應(yīng)用RIPA裂解液，使實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行充分的裂解，并獲得細(xì)胞內(nèi)的總蛋白水平。再應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)方法檢測細(xì)胞內(nèi)的總蛋白水平，之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳實(shí)驗(yàn)后，取目的蛋白條帶，并進(jìn)一步設(shè)定為恒流的200毫安進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1h。轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)完成之后，將膜用TBST的緩沖液進(jìn)行清洗，在搖床機(jī)上進(jìn)行封閉1h。配制一抗體以及一抗稀釋液，將封閉好的膜放入配好的一抗稀釋液，4℃搖床進(jìn)行過夜。配制二抗與二抗稀釋液，將封閉后的膜放入配好的二抗稀釋液，常溫下載搖床機(jī)上搖3h。經(jīng)過二抗孵育完成之后，應(yīng)用TBST緩沖液進(jìn)行清洗3次，加入顯色液，并記錄實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1.3.2 "考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度 "實(shí)驗(yàn)用分光光度，進(jìn)行測定并仔細(xì)的計(jì)算每個實(shí)驗(yàn)管中蛋白的吸光度值，并且制作出本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先吸取3μl的待測蛋白液體，加入到100μl的考馬斯亮藍(lán)顯色液之中，再次應(yīng)用分光光度，詳細(xì)的計(jì)量，并仔細(xì)的計(jì)算出吸光度值，再次計(jì)算出需要檢測的蛋白濃度。

1.3.3 "電泳分離蛋白分子并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜 "首先將膜放入封閉液中，并在搖床上進(jìn)一步的進(jìn)行封閉1h。第一步加一抗，在4℃中維持，并在搖床上過夜。第二步加二抗，在常溫中維持，并在搖床上持續(xù)搖3h，二抗孵育完成后，經(jīng)TBST洗滌3次，并加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 "數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料使用“±s”表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 "結(jié)果

2.1 "miR-9-3p 轉(zhuǎn)染效率

miR-9-3p轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-9-3p表達(dá)水平21.692±3.150，對照組1.342±0.554，miR-9-3p轉(zhuǎn)染組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），證明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，見表1。

miR-9-3p轉(zhuǎn)染組ABCA1 mRNA水平為1.293± 0.562，對照組為1.162±0.576，兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表2。

2.3 "miR-9-3p對ABCA1蛋白水平的影響

miR-9-3p轉(zhuǎn)染組ABCA1的蛋白水平0.426±0.122，對照組0.783±0.134，miR-9-3p轉(zhuǎn)染組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖1，表3。

3 "討論

冠心病（coronary heart disease，CHD）是目前我國乃至世界范圍內(nèi)威脅人類健康的第一大慢性疾病。隨著時代的變遷，CHD的發(fā)病率及治病率、致死率逐年增高，CHD是心肌梗死乃至心源性猝死的前驅(qū)期表現(xiàn)，如不早期發(fā)現(xiàn)、診斷CHD并預(yù)防進(jìn)展，那將降低人類平均壽命及生存質(zhì)量。

CHD的危險(xiǎn)因素包括心腦疾病家族史、既往心血管疾病病史、高血壓、男性、老齡、吸煙及高血糖、高血脂等代謝性疾病，然而，血脂代謝紊亂，尤其是膽固醇及低密度脂蛋白代謝異常往往是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。ABCA1是位于細(xì)胞膜上的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)受體是調(diào)節(jié)血脂代謝的關(guān)鍵因子，目前研究其功能顯示，在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程即將血液中的膽固醇以及脂代謝物質(zhì)逆轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在肝臟進(jìn)一步通過代謝變?yōu)槟懼崤懦w外[6-7]。在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中許多組織參與其中，主要包括肝臟、腸道、血管等，ABCA1的主要分布范圍為巨噬細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、小腸細(xì)胞、血管內(nèi)皮等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜，在血脂代謝的逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程發(fā)揮重要作用[8-9]。

目前的研究報(bào)道顯示，如建立ABCA1表達(dá)減少的小鼠模型，可以觀察到小鼠發(fā)生動脈粥樣硬化的比率顯著增高，并且病癥重，血管狹窄程度重[10]。目前miRNAs對ABCA1在膽固醇代謝方面的調(diào)控作用已有報(bào)道，有研究學(xué)者Xu等[11]概述了miR-34a在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇流出、炎癥和動脈粥樣硬化中的中心作用，其可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平發(fā)揮作用，研究進(jìn)一步表明miR-34a是治療心臟代謝疾病的一個有前途的靶點(diǎn)。循環(huán)中miR-106a-5p/miR-320a，其作為ABCA1/CPT1的上游靶向抑制劑，協(xié)同調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝的進(jìn)展，導(dǎo)致ABCA1表達(dá)水平顯著減少，誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝紊亂在酒精性脂肪肝發(fā)病中發(fā)揮協(xié)同作用[12]。還有研究顯示miR-33a和miR-144的表達(dá)增加，其靶ABCA1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；它可能與患者的原發(fā)性動脈高壓相關(guān)，并因此導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊[13]。 還有研究表明，與轉(zhuǎn)染miR-200b-3p抑制劑和小干擾物-ABCA1的泡沫細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-200b-3p抑制劑的泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)含量顯著增加，而膽固醇流出量顯著降低。miR-33在體內(nèi)的沉默增加了ABCA1的肝表達(dá)和血漿HDL水平。因此，miR-33似乎同時調(diào)節(jié)肝臟中的HDL生物發(fā)生和細(xì)胞膽固醇流出[14]。

學(xué)者研究顯示，不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿miR-9-3p表達(dá)水平相較于正常人顯著降低，通過受試者工作特征曲線表明其對于不穩(wěn)定型心絞痛具有一定診斷價(jià)值[3]。因此研究miR-9-3p與ABCA1表達(dá)水平的關(guān)系，能夠從基因?qū)用嫔钊腙U述CHD患者其膽固醇代謝調(diào)節(jié)異常的真正原因。本研究發(fā)現(xiàn)miR-9-3p轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞ABCA1蛋白水平顯著低于陰性對照組，而miR-9-3p轉(zhuǎn)染組與對照組相比ABCA1 mRNA表達(dá)水平無顯著性差異，提示miR-9-3p可能通過轉(zhuǎn)錄后水平蛋白翻譯等過程參與ABCA1蛋白表達(dá)的調(diào)控。目前已經(jīng)有研究證實(shí)miR-9-3p在膽固醇代謝的調(diào)節(jié)酶如脂肪酰輔酶A基因具有調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)膽固醇代謝等[15]，該研究也證實(shí)其具有調(diào)節(jié)脂代謝因子表達(dá)的作用。

綜合以上，miR-9-3p能夠抑制脂蛋白調(diào)節(jié)因子ABCA1蛋白表達(dá)，但對ABCA1mRNA水平未見顯著影響，可能是通過轉(zhuǎn)錄后翻譯等過程對其蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，確切機(jī)制有待于之后的研究進(jìn)一步證實(shí)。

4 "參考文獻(xiàn)

[1] Zhuang G， Wu X， Jiang Z， et al. Tumour-secreted miR-9 promotes endothelial cell migration and angiogenesis by activating the JAK-STAT pathway[J]. EMBO， 2012，31（17）： 3513-3523.

[2] Zhang J， Chintalgattu V， Shih T， et al. MicroRNA-9 is an activation induced regulator of PDGFR-beta expression in cardiomyocytes[J]. Mol Cell Cardiol， 2011，51（3）： 337-346.

[3] 李斯，孫雅楠.不穩(wěn)定型心絞痛患者miR-9-3p水平及臨床意義[J].中國老年學(xué)雜志，2019，39（11）：2583-2586.

[4] 程愛娟，毛用敏，崔讓莊.ABCA1基因啟動子區(qū)-14bp和ZNF位點(diǎn)多態(tài)性與血脂水平及冠心病易感性的關(guān)聯(lián)分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012，29（1）：56-59.

[5] 王波，王臨池，趙翼洪，等.2009-2013年蘇州20歲及以上居民冠心病發(fā)病率變化趨勢及類型分析[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015（24）：2952-2956.

[6] Schmitz G，Buechler C.ABCA1：Regulation， trafficking and association with heteromeric proteins[J].Ann Med，2002，34：334-347.

[7] Srivastava N.ATP-binding cassette transporterA1-key roles in cellular lipid transport and atherosclerosis[J].Mol Cell Biochem，2002，237：155-164.

[8] Oram JF，LawnRM.ABCA：The gatekeeper for eliminating excess tissue cholesterol[J].Lipid Res，2001，42：1173-1179.

[9] Singaraja RR，Brunham LR，Visscher H，et al.Efflux and athero-sclerosis the clinical and biochemical impactofvariations in the ABCA1 gene[J]. Arterioscler Thromb Vasc Bio，2003，200：1322-1332.

[10] Vaisman BL， Lambert G， Amar M， et al. ABCA1 overexpression leads to hyperalphalipoproteinemia and increased biliary cholesterol excretion in transgenic-mice[J].J Clin Invest， 2001，108（2）：303-309.

[11] Xu Y， Xu Y， Zhu Y， et al. Macrophage miR-34a is a key regulator of cholesterol efflux and atherosclerosis[J].Mol Ther，2020，28（1）：202-216.

[12] Li J， Qi J， Tang Y， et al. A nanodrug system overexpressed circRNA_0001805 alleviates nonalcoholic fatty liver disease via miR-106a-5p/miR-320a and ABCA1/CPT1 axis[J].J Nanobiotechnology，2021，19（1）：363.

[13] Huesca-Gómez C，Torres-Paz YE，Martínez-Alvarado R，et al.Association between the transporters ABCA1/G1 and the expression of miR-33a/144 and the carotid intima media thickness in patients with arterial hypertension[J].Mol Biol Rep，2020，47（2）：1321-1329.

[14] Rayner KJ，Suárez Y，Dávalos A，et al.MiR-33 contributes to the regulation of cholesterol homeostasis[J].Science，2010，328（5985）：1570-1573.

[15] Xu J， Hu G， Lu M， et al. MiR-9 reduces human acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase-1 to decrease THP-1 macrophage-derived foam cell formation[J].Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai），2013，45（11）：953-962.

[2023-01-09收稿]