張 雪(綜述), 柳美蘭(審校)

缺血性心臟病(ischemic heart disease,IHD)的發(fā)病率及病死率均呈逐年上升趨勢。IHD是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)發(fā)生的危險(xiǎn)因素[1]。IHD的主要病理生理原因是動(dòng)脈粥樣硬化,血流逐漸阻塞導(dǎo)致心臟組織氧合不良,伴有內(nèi)皮功能障礙和年齡相關(guān)性血管生成反應(yīng)下降[2]。心肌缺血壞死后若不及時(shí)進(jìn)行干預(yù),將導(dǎo)致心室重構(gòu),進(jìn)一步促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生[3]。盡管可以通過溶栓、經(jīng)皮冠脈介入及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等治療方式開通閉塞和狹窄的冠狀動(dòng)脈,及時(shí)搶救瀕臨缺血壞死的心肌,防止心功能進(jìn)一步下降,降低病死率[4]。但部分患者由于冠狀動(dòng)脈生理的因素而無法進(jìn)行以上治療。因此,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)治療被認(rèn)為是較好的治療方式[5]。血管生成是導(dǎo)致新血管形成的復(fù)雜過程,可以治療從重要器官和組織進(jìn)出的病理受損或缺乏的血液流動(dòng)有功能的血管系統(tǒng),通過運(yùn)送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)、清除垃圾及輸送免疫細(xì)胞,對維護(hù)組織和器官正常運(yùn)行至關(guān)重要[6]。新血管生成由VEGF誘導(dǎo)且同時(shí)需要許多細(xì)胞和蛋白質(zhì)的參與。除了細(xì)胞因子、基因治療外,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)還分泌微囊泡/外泌體,為治療IHD提供了一種新的血管生成治療方法[7]。本文對細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、基因或細(xì)胞外囊泡誘導(dǎo)血管生成作一綜述。

1 血管生成

血管生成是由缺血/缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)的適應(yīng)性反應(yīng)。血管生成是指從現(xiàn)有的血管中形成新的血管,隨后在體內(nèi)擴(kuò)張血管網(wǎng)絡(luò)的過程[8]。通過血管生成過程產(chǎn)生微血管將有助于恢復(fù)缺血組織和細(xì)胞的血液和氧氣供應(yīng),從而減少缺血/缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。研究顯示,治療性血管生成可加強(qiáng)這一過程,從而改善缺血心肌的血供[9]。治療性血管生成涉及外源性給藥,促進(jìn)新生血管形成后的生長,以恢復(fù)組織的循環(huán)。在正常生理情況下,機(jī)體通過產(chǎn)生精準(zhǔn)數(shù)量的促血管生成生長因子使血管生成維持穩(wěn)定狀態(tài),如VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)[10]。在病理生理狀態(tài)下,血管生成機(jī)制可分為3個(gè)基本步驟:(1)激活;(2)ECs的增加和轉(zhuǎn)移;(3)管腔結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)形成[11]。血管生成生長因子可以直接與受體結(jié)合或間接激活ECs,開啟下游信號(hào)通路,促使毛細(xì)血管新生。通過周圍的外周細(xì)胞、周細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)定信號(hào)的影響重新建立穩(wěn)態(tài)[12]。靜脈生成是內(nèi)皮祖細(xì)胞在毛細(xì)血管的位置組裝,而動(dòng)脈生成是通過發(fā)芽和腸套疊從現(xiàn)有的血管形成新的血管的一個(gè)過程[13]。研究表明,新生血管的形成不僅依賴于原有血管的發(fā)芽,而且還來自于從骨髓循環(huán)的內(nèi)皮祖細(xì)胞,這些內(nèi)皮祖細(xì)胞與新生血管結(jié)合并促進(jìn)新生血管的形成[14]。

2 促血管生成細(xì)胞因子

促血管生成生長因子通常以納米顆粒作為載體,通過增加局部濃度促進(jìn)血管生成直接轉(zhuǎn)移到靶組織,通過轉(zhuǎn)錄、病毒載體或DNA質(zhì)粒間接促進(jìn)其基因表達(dá)[6]。CVD患者的心肌細(xì)胞和ECs經(jīng)常暴露于缺氧和炎癥中,從而刺激缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)。HIF可通過HIF-1α途徑增加各種促血管生成因子的數(shù)量,進(jìn)而促進(jìn)血管生成。VEGF長期以來被認(rèn)為是血管生成過程中的中樞調(diào)節(jié)因子。VEGF-A通過激活酪氨酸激酶和破壞ECs黏附連接處VEGF受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)/鈣黏蛋白5復(fù)合物的穩(wěn)定性,提高血管的通透性[15],恢復(fù)ECs的完整性和血管功能。因此,它可以補(bǔ)償缺血缺氧,保護(hù)受損的心肌,缺氧和營養(yǎng)缺乏會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1,PGC-1)的激活。PGC-1是線粒體功能的主要調(diào)節(jié)因子,通過提高VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管生成。PGC-1進(jìn)一步協(xié)同激活孤核受體-α(estrogen-related receptor-alpha,ERR-α)以控制獨(dú)立于HIF的血管生成途徑[16]。Jin等[17]發(fā)現(xiàn),缺氧也能誘導(dǎo)ECs產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),這表明自分泌周期可以通過核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)依賴性過程介導(dǎo),激活HIF,上調(diào)VEGF,促進(jìn)血管生成。這在ECs中形成了TNF-α/NF-κB/HIF/VEGF信號(hào)級聯(lián)。Guo等[18]發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,CD163+巨噬細(xì)胞通過CD163/HIF1α/VEGF-A通路參與VEGF-A的表達(dá)。膜聯(lián)蛋白A1直接誘導(dǎo)心肌巨噬細(xì)胞向血管生成和修復(fù)表型極化,刺激心肌巨噬細(xì)胞釋放大量VEGF-A,從而誘導(dǎo)血管生成和心臟修復(fù)[19]。對照臨床試驗(yàn)未能證明在安全載體劑量下的治療功效。由于VEGF在分泌后仍然緊密地定位在每個(gè)產(chǎn)生細(xì)胞周圍的微環(huán)境中,即使在幾十或幾百微米的距離上,不同的生長因子濃度也不會(huì)均勻分布。因此,即使在某些區(qū)域表達(dá)過量,總VEGF劑量相當(dāng)?shù)?也足以引起異常的血管生長。如果可以實(shí)現(xiàn)生長因子濃度或表達(dá)水平的均勻分布,則可以控制生理血管生成[13]。bFGF也稱為成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2),是FGF家族的成員。FGF主要通過RAS/MAP激酶途徑與FGF受體結(jié)合和激活,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、遷移和分化等生物學(xué)功能[6]。FGF與VEGF的受體不同,FGF受體被發(fā)現(xiàn)在ECs和平滑肌細(xì)胞上表達(dá),這有助于形成成熟的血管網(wǎng)絡(luò)。FGF-2是各種細(xì)胞類型的有絲分裂原、周細(xì)胞的募集因子和細(xì)胞外基質(zhì)的生產(chǎn)者[20-21]。HGF及其受體在心臟、腎臟和肝臟等受傷組織中高度表達(dá),以誘導(dǎo)這些器官的血管生成。HGF誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈ECs系中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2,MMP-2)和尿激酶的表達(dá),MMP的酶功能對于繼續(xù)促進(jìn)血管生成過程至關(guān)重要,HGF上調(diào)MMP以消化基底膜,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)溶解及喪失完整性[20-22]。雖然研究發(fā)現(xiàn),生長因子具有顯著的血管生成特性,但由于其半衰期短且體內(nèi)生物穩(wěn)定性差,其療效較差。

3 蛋白質(zhì)/基因治療

新血管生成是由VEGF誘導(dǎo)的,同時(shí)需要許多細(xì)胞和蛋白質(zhì)的參與[23]。利用蛋白質(zhì)或基因在細(xì)胞水平上刺激血管生成是一種成熟的治療方法。蛋白質(zhì)治療可通過靜脈、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或心肌內(nèi)注射重組血管肽進(jìn)行?；蛑委熒婕巴庠春怂徂D(zhuǎn)移到靶細(xì)胞,以刺激所選基因的持續(xù)治療表達(dá)。蛋白質(zhì)的局限性是外源蛋白在靶組織中的半衰期較短[24],降低了治療效益,臨床試驗(yàn)采用基因治療延長蛋白的表達(dá)時(shí)間?；蜣D(zhuǎn)移可能是病毒性的,也可能是非病毒性的。其一直以來使用腺病毒載體作為載體,已被證明可以提高DNA轉(zhuǎn)移的效率[2]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)中Ad-VEGF165與質(zhì)粒DNA-VEGF165的心肌內(nèi)注射。Ad-VEGF165可使心肌灌注程度提高[25]。有研究使用同時(shí)編碼VEGF和PDGF的組合質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)其對ECs遷移和血管形成具有誘導(dǎo)作用[26]。因此,采用這種配對方法,同時(shí)給予FGF-2和PDGF-β可以顯著改善大鼠和兔缺血后肢模型的側(cè)支網(wǎng)絡(luò)形成和血液灌注[27]。同時(shí)使用2種或2種以上的蛋白質(zhì)、基因,或蛋白質(zhì)和基因的結(jié)合,是一種更有效、更穩(wěn)定的促進(jìn)血管生長的方法。第一代心血管VEGF臨床試驗(yàn)中,VEGF蛋白遞送也被用于治療糖尿病患者的慢性足部潰瘍,但療效有限。限制VEGF功效的主要問題是其治療劑量,例如通過基因遞送,已被證明具有較大難度,較低劑量的基因治療載體無效,較高劑量的基因治療載體則會(huì)迅速引起異常血管生長[28-29]。

4 細(xì)胞治療

細(xì)胞治療是通過控制心臟缺血時(shí)的自分泌和旁分泌機(jī)制來刺激和調(diào)節(jié)治療性血管生成的生物途徑的最佳選擇,骨髓細(xì)胞(bone marrow-derived cells,BMCs)受到關(guān)注[30]。目前的干細(xì)胞研究集中在通過改善細(xì)胞歸巢、結(jié)合細(xì)胞療法和使用駐留細(xì)胞群來優(yōu)化細(xì)胞治療[31]。研究顯示,慢性IHD患者使用BMCs治療后心臟功能得到改善,且具有安全性[32]。有研究表明,在急性心肌梗死和慢性缺血性心肌病動(dòng)物模型中,MSCs移植后整體體積減小了約7%,心功能改善了約11%[33]。Karantalis等[34]研究也證實(shí),冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者心肌內(nèi)注射MSCs可使注射部位的血管新生,瘢痕減少,改善組織灌注及區(qū)域功能。MSCs的心臟保護(hù)作用得益于其促進(jìn)新生血管形成的能力,原因可能為:(1)MSCs分泌可溶性旁分泌因子,促進(jìn)血管生成;(2)MSCs能夠分化成形成血管基礎(chǔ)的ECs、周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。這些過程都參與了MSCs對IHD疾病的作用機(jī)制,促進(jìn)MSCs血管生成主要是通過分泌CXCL1、CXCL5、CXCL6、CXCL8、HGF等細(xì)胞因子[35-36]。這種類型的治療性血管生成還存在一些問題。移植的細(xì)胞可能在組織/器官(如心臟)中具有不可預(yù)測和不可控的行為,心肌內(nèi)直接注射是將細(xì)胞或副產(chǎn)物直接注射到損傷組織中,通常需要開胸手術(shù),可能會(huì)引起術(shù)后疼痛和增加患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)。因此,干細(xì)胞試驗(yàn)效率降低和移植后生存率低[37]。

5 外泌體

BMCs可迅速從骨髓中動(dòng)員并重新招募到缺血心臟,促進(jìn)血管生成和心臟修復(fù)。近年來的研究表明,MSCs的作用主要是通過分泌旁分泌因子,包括抗凋亡因子、促血管生成因子和外泌體,而不是通過分化為心肌細(xì)胞[38]。對旁分泌信號(hào)的高度關(guān)注,促使人們更多地關(guān)注細(xì)胞外囊泡,而不僅是細(xì)胞本身。這些囊泡中最受關(guān)注的是外泌體,外泌體被廣泛地認(rèn)為是無細(xì)胞治療的候選者[39]。外泌體是一種納米大小的顆粒,從質(zhì)膜釋放為多泡體。它被認(rèn)為是細(xì)胞之間通信、免疫調(diào)節(jié)、增殖、細(xì)胞衰老和分化的重要媒介,通過將各種生物活性物質(zhì)如mRNA、microRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞[40]。MSCs衍生的外泌體對促進(jìn)血管生成、抗細(xì)胞凋亡及抗炎方面發(fā)揮心臟保護(hù)作用。越來越多的證據(jù)表明,HIF-1α增強(qiáng)的血管生成在介導(dǎo)心臟保護(hù)中起著關(guān)鍵作用,Exo-HIF-1α對缺血心臟的促血管生成和保護(hù)作用是通過VEGF和PDGF介導(dǎo)的。此外,缺氧損傷的ECs的血管生成、增殖和遷移也被Exo-HIF-1α所改善[41]。Huang等[40]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-126通過激活PI3K/Akt和MAPK/ERK通路以及釋放VEGF和bFGF因子,促進(jìn)MSCs向ECs的分化。在缺氧組織中,SDF-1和CXCR-4也是細(xì)胞遷移的重要因素。缺血的心肌和血管組織分泌SDF-1來吸引CXCR-4表達(dá)的細(xì)胞。Shi等[35]發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR-4可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)BMCs向心肌梗死的遷移。因此,MSCs分泌的旁分泌因子在新生血管形成過程中發(fā)揮重要作用。

6 結(jié)語

IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,介入治療和藥物治療在心血管治療方面取得了巨大突破。CVD患者逐年增多,其發(fā)病率和病死率均較高。為了減少IHD造成的危害,新的醫(yī)學(xué)療法需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來證明。促血管生成是治療IHD的一種較有前景的方法。但是在基因治療方面,血管生成基因治療誘導(dǎo)的增量毛細(xì)血管水平的血管化,本身可能不足以改善大肌區(qū)血管重建術(shù),挽救缺血心肌。腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)染也可能會(huì)誘導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng),從而損害缺血心肌的功能。另外,血液和氧氣的短缺也會(huì)影響注射的干細(xì)胞。尤其是干細(xì)胞移植后生存率低、移植途徑等都限制了MSCs治療發(fā)展。近年來,研究探討了多種新策略來增強(qiáng)基于干細(xì)胞的療法,細(xì)胞來源的外泌體也降低了使用細(xì)胞療法的限制。在缺氧、酸中毒和氧化應(yīng)激反應(yīng)中,微囊泡的釋放增加,增強(qiáng)MSCs的旁分泌作用。另外,血管生成與動(dòng)脈粥樣硬化的沖突是IHD促血管生成治療中存在的問題。新生血管有利于缺血心肌,而脆弱和出血的新生血管也會(huì)導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定、破裂和出血。未來需要更多的研究來解決這些問題。