蘇進達， 張海明， 趙少輝， 邢林帥， 張金楓， 謝小亮

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院結直腸外科，寧夏醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，銀川 750004）

據全球癌癥流行病學數據庫（GLOBOCAN）2020 年統(tǒng)計數據顯示[1]：結直腸癌（CRC）是全球最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居于惡性腫瘤第3 位，死亡率高居第2 位。癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫報道[2]Smad4/DPC4 的突變頻率為10%，是CRC 中最常見的突變基因之一。Smad4/DPC4 是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路的中心介質，TGF-β 信號通路在細胞生長、分化、凋亡、遷移以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物學過程中起著重要作用。因此，當Smad4/DPC4 缺失或突變時，伴隨著TGF-β 信號傳導的喪失，會導致不受控制的細胞增殖?，F就Smad4/DPC4 在CRC 發(fā)生、發(fā)展、轉移及治療中的作用進行綜述。

1 Smad4/DPC4 基因與蛋白的結構和功能

Smad4 基因位于染色體18q21.1，是一種抑癌基因，是Smads 家族中最常發(fā)生基因突變的基因之一。Smad4 基因包含12 個外顯子和10 個內含子，該基因編碼的蛋白質由552 個氨基酸組成，分子質量為60 KD。Smad4 蛋白的一級結構由3個主要部分組成，包括N 端MH1 結構域、C 端MH2結構域以及中間連接區(qū)。根據Smads 的結構和功能，可分為3 個亞型：受體激活型Smads（RSmads、Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8），抑制型Smads（I-Smads、Smad6、Smad7），共同調節(jié)型Smads（Co-Smads、Smad4）。轉化生長因子β 超家族是一大類分子，主要包括TGF-β 亞家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）亞家族，當TGF-β 和BMP 配體與靶細胞表面的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，BMP Ⅰ型受體磷酸化Smad1/5/8，而TGF-β Ⅰ型受體磷酸化Smad2/3，活化的R-Smads 與Smad4 形成異聚Smad 復合物轉移入核，在細胞核中募集相關轉錄激活因子或抑制因子調控靶基因反應。此外，抑制型Smads 可通過與R-Smads 競爭性結合Ⅰ型受體或通過與Smad2/3 競爭性結合Smad4 來負調節(jié)信號傳導[3-7]。TGF-β 和BMP 亞家族中的許多成員在各種癌癥中起著重要作用。

2 Smad4/DPC4 與CRC 上皮間質轉化

上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞特性減少，間質特性增加，細胞骨架重塑和細胞基質黏附消失，轉化為具有遷移和侵襲能力的間充質細胞的過程[8]。EMT 與腫瘤的轉移、侵襲相關，Smad4 突變在CRC 后期促進腫瘤細胞發(fā)生EMT。EMT 主要由Snail 鋅指蛋白、鋅指E 盒結合蛋白、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子進行調控。Smad4 可通過調控這3 類轉錄因子表達，加速CRC EMT 過程，影響CRC 的遷移和侵襲。TGF-β 信號可通過TGF-β/Smad4 途徑介導Smad2/3/4 復合物向細胞核易位，誘導間充質分子標記物Snail、Slug、Twist 和Zeb 的表達，從而誘導EMT[7]。Ioannou 等[9]運用免疫組化檢測CRC 標本，發(fā)現Smad4 與Snail-1、Slug、Twist-1 的表達呈正相關，與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達呈負相關，結果表明，Smad4 是結直腸癌EMT轉變的一個核心成分，它與轉錄因子結合，降低E-鈣黏蛋白表達并改變上皮細胞表型。除了經典TGF-β/Smad4 途徑之外，Smad4 還可以通過非經典途徑調控結直腸癌EMT。劉中財等[10]證實，在CRC 中Smad4 高表達可通過阻止PI3K/AKT通路抑制EphA2 的活化，從而阻止EMT 的發(fā)生，減弱癌細胞的遷移和侵襲能力。Xiao 等[11]發(fā)現，溶瘤腺病毒CD55-Smad4 通過調控Wnt/βcatenin 通路抑制結直腸癌EMT，從而抑制CRC細胞的遷移和侵襲。以上研究強化了Smad4 在結直腸癌EMT 過程中的作用，為有效治療CRC 提供了理論依據。

3 Smad4/DPC4 與CRC 炎癥微環(huán)境

腫瘤炎癥微環(huán)境被世界公認為癌癥發(fā)生和進展的標志之一。在腫瘤進展后期，炎癥反應相關因子表達的增加可促進腫瘤的擴散和轉移。Smad4 缺失可通過調控趨化因子表達募集炎癥反應相關因子和腫瘤相關炎性細胞，促進CRC進展。Inamoto 等[12]發(fā)現，Smad4 缺失通過CCL15-CCR1 軸招募CCR1+骨髓來源的抑制性細胞（MDSCs）促進CRC 進展。人類MDSCs 包括單核細胞MDSCs 和粒細胞MDSCs 兩個亞型群，MDSCs 群體是CRC 惡性進展中重要間質成分之一。梁倩[13]進一步研究發(fā)現，TRIM47 可以與Smad4相互結合，引起Smad4 泛素化降解，Smad4 的缺失導致CCL15 和CCR1 的表達升高，激活MMP9的活性，最終促進CRC 的增殖和轉移。此外，Smad4 缺失還可通過CXCL1/8－CXCR2 軸募集腫瘤相關中性粒細胞，而中性粒細胞分泌相關炎性因子促進CRC 進展[14]。因此，阻斷這些相關通路可能是針對Smad4 陰性的CRC 的新治療方法。在炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）背景下發(fā)生的CRC 被稱為結腸炎相關性CRC，其發(fā)病機制尚不十分明確。Means 等[15]通過RNA 測序比較Smad4 表達和Smad4 缺乏的小鼠結腸上皮細胞，發(fā)現Smad4 缺乏的小鼠結腸上皮細胞許多炎癥相關基因上調，包括趨化因子CCL20，并增加對結腸炎相關癌癥的易感性。Hanna 等[16]進一步證實，Smad4 可以通過抑制CCL20 / CCR6 介導的炎癥來抑制結腸炎癥相關腫瘤。這些實驗和觀察結果表明，CRC 中的Smad4 缺失導致癌細胞表型和腫瘤微環(huán)境切換到更具侵襲性的癌癥表型。

4 Smad4/DPC4 與CRC 的發(fā)生和發(fā)展

CRC 的發(fā)生和發(fā)展主要有染色體不穩(wěn)定性（CIN）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）兩條途徑，前者主要涉及APC、TP53 及Smad4 等基因。最近的一項薈萃分析系統(tǒng)性回顧了1999—2020 年幾項關于散發(fā)性CRC 的研究，提示Smad4 基因的突變率為5.0%～24.2%[17]。Smad4 是重要的腫瘤抑癌基因，當Smad4 突變或缺失時，TGF-β 信號通路不能激活，失去對腫瘤的抑制作用。Yoo 等[18]運用免疫組化法檢測1 281 例Ⅰ～Ⅳ期CRC 患者的Smad4 表達，發(fā)現210 例（占16.4%）缺失，942 例（占73.5%）為低表達，129 例（占10.1%）為高表達；結果證實，Smad4 缺失具有更差的5 年無進展生存率和7 年腫瘤特異性生存率，Smad4 缺失可作為判斷CRC 預后的獨立因素。為了進一步闡明Smad4 與CRC 預后的關系，Fang 等[17]回顧性分析了5 項關于Smad4 基因狀態(tài)與CRC 預后關系的研究，結果表明，Smad4 突變型CRC 具有更差的預后，證實Smad4 突變與CRC 預后不良有關。上述研究提示，Smad4 缺失或突變是CRC患者預后不良的獨立危險因素。

Smad4 在CRC 中缺失的主要原因是18 號染色體雜合性缺失，但是其他轉錄和翻譯后機制也可能導致其缺失或功能障礙，如泛素化、類泛素化和microRNA 干擾。microRNA 在腫瘤抑制和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中控制關鍵癌基因和腫瘤抑制基因的表達，已被證明在癌癥中起著關鍵作用。據報道[19]，miR-20a-5p、miR-224、miR-34a、miR-19b-3p、miR-4260、miR-27a、miR-130a/301a/454等可以通過靶向Smad4 調控CRC 的發(fā)生和發(fā)展。例如，miR-144 可通過靶向下調Smad4 表達抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，Smad4 被認為是miR-144 在結腸癌進展中的下游靶標[20]。因此，研究miRNA/Smad4 通路可為結腸癌患者提供新的治療方法，同時也為治療Smad4 缺失的CRC 患者提供了新思路。章帥等[21]研究linc-PINT在CRC 中的作用及其機制，發(fā)現linc-PINT 與Smad4在結腸癌組織中的表達水平呈正相關，過表達linc-PINT 后，Smad4 蛋白的表達水平升高。提示linc-PINT 可通過靶向Smad4 介導CRC 的惡性進展，說明linc-PINT 是治療CRC 的潛在靶點。LINC00941 是一種新型lncRNA，其在CRC 中表達上調，通過激活癌細胞EMT，促進CRC 細胞遷移和侵襲。研究發(fā)現[22]，LINC00941 可通過與TrCP-β 競爭性結合Smad4 蛋白MH2結構域，抑制Smad4蛋白泛素化，激活TGF-β/Smad2/3 信號通路，促進CRC 轉移。Smad4 與microRNA 或lncRNA 的相互作用為轉移性CRC 的機制提供了新的見解，同時也為晚期CRC 提供了新的潛在治療靶點。

在過去20 年里，越來越多的研究[7]證實Smad4 參與Wnt/β-catenin、PI3K/AKT 和MAPK等多種經典通路的調控，形成一個復雜的網絡體系，影響CRC 的發(fā)生發(fā)展。例如，Smad4 與Wnt通路的相互作用可以使腸上皮分化細胞獲得干細胞樣特性[23]。Smad4 缺失促進上皮細胞βcatenin 蛋白表達，導致腸上皮中的Wnt 通路激活，觸發(fā)干細胞特性的獲得，最終引起小鼠模型驅動分化的腸上皮細胞中的去分化和腺瘤快速形成。此外，Park 等[24]建立自發(fā)性結腸癌小鼠模型，發(fā)現Smad4 和TP53 缺失下調p21 并激活Wnt/β-catenin 通路，協同促進腸道腫瘤發(fā)生。而且Wnt/β-catenin 通路抑制劑可以抑制Smad4 和TP53 突變激活Wnt/β-catenin 通路的胃腸道癌癥。Demagny 等[25]報道Smad4 的活性和穩(wěn)定性由3 條主要的信號通路通過其連接區(qū)進行調節(jié)，該連接區(qū)包含一個生長因子調節(jié)的轉錄激活域，整合Wnt 通路、成纖維生長因子通路（FGF）和TGFβ信號通路。在Smad4 水平上整合了對生長發(fā)育和腫瘤進展至關重要的3 條主要信號通路。

根據“腺瘤—癌序貫模型”，CRC 中的致癌轉化由APC、KRAS、Smad4 和TP53 的突變驅動[26]。因此，推測Smad4 與其他基因共存突變時可能對CRC 患者的預后產生累加效應。Wang 等[27]通過二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）檢測433 例轉移性CRC 患者RAS、BRAFV600E、APC、TP53 和Smad4 的基因狀態(tài)，發(fā)現單獨的Smad4 突變不足以預測CRC 患者的預后，而這與先前研究的結論相矛盾，認為先前的研究沒有評估共存突變對Smad4 突變人群的影響。進一步研究發(fā)現，TP53 和Smad4 突變的共存與轉移性CRC 患者的預后明顯較差有關。Chung 等[28]探討Smad4 和PTEN 在預測結直腸腺癌患者預后方面的性能，發(fā)現與單獨缺失Smad4 或PTEN 相比，同時缺失Smad4 和PTEN 可能導致CRC 更具侵襲性和不良預后。Tong 等[29]研究Smad4 在BRAFV600E 鋸齒狀腫瘤的作用，發(fā)現在BRAF-V600E致癌性小鼠模型中，Smad4 缺失可促進鋸齒狀腫瘤的快速發(fā)展，提示Smad4 是早期鋸齒狀癌癥的關鍵因素，深入研究Smad4 與BRAF-V600E 關系有助于增加對這種罕見但侵襲性強的CRC 亞群的了解。楊文超[30]研究Smad4 在CRC 干性中的調控機制，構建Smad4 過表達和敲減結腸癌細胞模型，發(fā)現Smad4 過表達后，抑制了結腸癌細胞的增殖、克隆形成和微球體形成能力；Smad4敲減后，增強了結腸癌細胞的增殖、克隆形成和微球體形成能力。同時，運用高通量測序檢測發(fā)現，Smad4 可促進結腸癌細胞中分化抑制因子-3（ID3）的表達，進一步構建ID3 基因敲減的結腸癌細胞模型，發(fā)現敲減ID3 增強了結腸癌細胞的增殖、克隆形成和微球體形成能力。結果提示，Smad4 可能通過調節(jié)ID3 基因的表達來抑制結腸癌細胞的干性。

5 Smad4/DPC4 與CRC 肝轉移

CRC 發(fā)生遠處轉移的概率極高，最易轉移至肝臟，這也是CRC 患者死亡的主要原因。Smad4功能喪失可以促進CRC 肝轉移（colorectal cancer liver metastasis，CLM），是CLM 的獨立危險因素，可作為預測CLM 的生物學指標[31]。Smad4 促進CLM 的機制研究：在Smad4 缺失的腸道腫瘤小鼠模型中發(fā)現趨化因子CCL9 表達上調，招募具有相應CCR1 受體的未成熟髓系細胞[32]，運用該小鼠模型進一步研究發(fā)現，CCR1（+）骨髓來源的細胞募集到結腸癌細胞的微環(huán)境中，產生金屬蛋白酶MMP9 和MMP2，促進CLM[33]。在人類CRC細胞中，同樣觀察到CRC 細胞中Smad4 缺失促進趨化因子CCL15（小鼠CCL9 的人類同源物）的上調，招募CCR1（+）MDSCs，從而促進CLM 的發(fā)生[12，34]。據報道，大約50%的CRC 患者會發(fā)生CLM，而超過一半的CLM 患者在肝切除術后2 年內復發(fā)[35]。Mizuno 等[36]回顧性分析Smad4 基因狀態(tài)與CLM 患者肝切除術后結局，發(fā)現在因CLM 而接受肝切除術的患者中，Smad4 突變型患者的總生存率（overall survival，OS）較差。最新研究[37]評估Smad4 突變對CLM 患者手術切緣寬度和局部復發(fā)的影響，結果表明，Smad4 突變與CLM 的手術切緣寬度或局部復發(fā)的發(fā)生率不相關，同時再次證實Smad4 突變是肝轉移切除術后OS 不良的獨立危險因素。上述研究強調了Smad4 基因狀態(tài)在CLM 患者手術決策中的作用，但是Smad4 突變導致CLM 的分子機制尚需進一步研究。

6 Smad4/DPC4 與CRC 血管生成

無論是原發(fā)腫瘤還是繼發(fā)腫瘤，一旦腫瘤直徑超過1～2 mm，就會出現血管生成，因此，需要豐富的血液供應來為腫瘤的生長和轉移提供營養(yǎng)和氧氣。Li 等[38]研究Smad4 對結腸癌細胞分泌血管內皮生長因子A（VEGF-A）和VEGF-C 的作用，發(fā)現Smad4、VEGF-A、VEGF-C 是結腸癌的獨立預后危險因素，Smad4 的表達與VEGFA、VEGF-C 呈負相關，過表達Smad4 抑制VEGF-A 和VEGF-C 的表達，闡明Smad4 可通過增強Smad3 磷酸化抑制結腸癌組織中VEGF-A和VEGF-C 的表達，從而抑制腫瘤血管和淋巴管生成。Smad4 功能喪失上調VEGF 的表達，促進CRC 的血管生成，有利于癌細胞侵襲血管內皮細胞，為腫瘤進展和轉移提供微環(huán)境。最新研究提示，重組人妊娠特異性糖蛋白9（PSG9）在CRC患者血清中顯著升高，PSG9 和Smad4形成復合物，增強Smad4 核保留，PSG9/Smad4復合物與啟動子結合激活包括VEGF-A 在內的多種血管生成細胞因子的轉錄，促進腫瘤血管生成[39]。Smad4結合多種血管生成細胞因子的啟動子促進腫瘤血管生成，與Smad4 抑制腫瘤血管生成的結論不一致。而Craven 等[40]發(fā)現Smad4 在癌細胞中的表達與微血管密度（MVD）呈正相關。VEGF 的啟動子包含Smad 結合序列，深入研究Smad4 調控VEGF 表達的機制，可為CRC 抗-VEGF 的靶向治療提供理論依據。

7 Smad4/DPC4 與CRC 淋巴管生成

腫瘤淋巴管生成是腫瘤淋巴結轉移的分子生物機制，淋巴結轉移是CRC 轉移擴散的重要通道，也是患者的主要死亡原因之一。Smad4 可以通過調控VEGF-C 和VEGF-D 表達，影響CRC 淋巴管生成。Liu 等[41]構建Smad4 過表達細胞模型，運用Western blot 和ELISA 技術檢測Smad4 和VEGF-C 的表達，發(fā)現過表達Smad4 可以抑制VEGF-C 的表達，從而抑制CRC 淋巴管生成。同時，構建Smad4 過表達裸鼠模型，在體內進一步驗證過表達Smad4 抑制VEGF-C 的表達和CRC 的淋巴管生成。這項研究表明，Smad4 可能通過抑制VEGF-C 的分泌而減少結腸癌細胞的淋巴管生成，并通過抑制腫瘤的遷移、侵襲和發(fā)生發(fā)揮腫瘤抑制作用，但是目前缺乏對Smad4調控結腸癌VEGF-C 機制的研究。Li 等[42]進一步研究Smad4 調控結腸癌VEGF-C 的機制，發(fā)現與非轉移性結腸癌組織相比，Smad4蛋白在轉移性癌癥組織中的表達增加，同時伴隨VEGF-C 蛋白的表達明顯增加，表明Smad4 表達與VEGF-C呈正相關。該研究結果提示，Smad4 和VEGF-C之間存在兩種相反作用途徑，即Smad4/miR-128-3p/VEGF-C 和Smad4/VEGF-C，分別是負調控和正調控方式。進一步深入研究證實，在非轉移性結腸癌中，Smad4/miR-128-3p/VEGF-C 負調控VEGF-C 表達起主導作用，在轉移性結腸癌中，Smad4/VEGF-C 正向調控VEGF-C 表達起主導作用，而ASLNC07322 在Smad4/miR-128-3p/VEGF-C 和Smad4/VEGF-C 轉換之間起到關鍵轉換作用。綜上所述，Smad4 可能通過抑制VEGF-C 和VEGF-D 的表達而減少CRC 淋巴管生成，但需關注Smad4 在非轉移性和轉移性CRC中的差異作用。

8 Smad4/DPC4 與CRC 神經浸潤（PNI）

PNI 是指腫瘤細胞侵犯神經內膜、束膜和外膜任何一層或者腫瘤細胞在神經周圍并包繞神經外膜33%以上。脈管浸潤和PNI 是影響CRC局部復發(fā)及遠處轉移的重要因素之一。Smad4 可以通過調控淋巴管及血管生成，影響CRC 的脈管浸潤，但是國內外關于Smad4 與腫瘤神經新生及PNI 的研究很少。Yoo 等[18]對Smad4 表達與CRC 患者的臨床病理關系研究發(fā)現，隨著Smad4表達的減少，CRC 患者發(fā)生PNI 越來越頻繁；同樣，Ioannou 等[9]應用HIC 檢測CRC 患者，發(fā)現Smad4 表達與PNI 雖然沒有顯著關系，但是可以識別出一個趨勢。關于Smad4 是否影響腫瘤神經新生和PNI 及其可能的機制有待進一步研究。

9 Smad4/DPC4 與CRC 治療

目前用于CRC 化療的藥物主要有5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）和伊立替康[43]。5-FU 是一種細胞周期特異性抗代謝藥物，對以5-FU 為基礎的化療耐藥是治療CRC 的一個重大障礙。CRC 中，Smad4 突變或缺失是化療耐藥的關鍵因素，需深入研究Smad4 調控CRC藥物敏感性的機制。Zhang 等[44]探索Smad4 調控5-FU 耐藥性機制，發(fā)現Smad4 通過抑制PI3K/AKT/CDC2/凋亡抑制蛋白級聯反應阻滯G1 或G2 細胞周期誘導CRC 細胞的化療敏感性。同時研究指出，MEK/ERK 通路是5-FU 誘導CRC 細胞凋亡的必需通路，但對Smad4 誘導的化療敏感性沒有影響。Wang 等[45]建立Smad4 突變小鼠模型，發(fā)現TGF-β 信號傳導受損導致腸道微生物組改變，損害CRC 對5－FU 的反應。Smad4 可能是CRC 患者以5-FU 為基礎化療的預測性生物標記物。Smad4 表達水平還可作為評估OXA 聯合5-FU 化療方案治療轉移性CRC 患者預后的一個指標。miR-34a 和miR-19b 通過靶向Smad4介導對OXA 治療的耐藥性，促進結腸癌增殖和進展[46-47]。伊立替康是治療CRC 的另一種常見的化療藥物，經常單獨使用或與5-FU 聯合使用以對抗結腸癌，而Smad4 缺失使CRC 對伊立替康產生耐藥性[48]。Wong 等[48]報道，Smad4 陰性結腸癌細胞中的RICTOR（RPTOR independent companion of MTOR complex 2）敲低增加了伊立替康的細胞毒性作用，在機制上，Smad4 與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2（mTORC2）的RICTOR相互作用并抑制RICTOR，從而抑制AKT 下游效應子磷酸化，AKT 的藥理學抑制使Smad4 陰性結腸癌細胞在體外和體內對伊立替康敏感。因此，靶向RICTOR 可使Smad4 陰性結腸癌對伊立替康敏感。除此之外，據Mei 等[49]報道，Smad4 突變是以西妥昔單抗為基礎的治療預后不良的潛在生物標記物。這些研究表明，Smad4 在腫瘤進展和靶向治療CRC 患者中發(fā)揮關鍵作用，是靶向治療CRC 的潛在生物標記物。

10 展望

Smad4/DPC4 在CRC 的發(fā)生發(fā)展及轉移過程中起著重要作用，尤其是在EMT、腫瘤炎癥微環(huán)境、腫瘤轉移和癌細胞干性的分子機制上的深入研究，表明Smad4/DPC4 是預測CRC 預后的潛在生物學標記物。隨著基因檢測技術的發(fā)展，需對Smad4/DPC4 與CRC 相關突變基因APC、TP53、KRAS、BRAF、PI3K 及MSI 等的關系進一步研究，因為Smad4/DPC4 與共存基因突變在CRC 預后和治療方案決策上發(fā)揮著關鍵作用。目前尚缺乏針對Smad4/DPC4 突變CRC 的個體化和精準化治療，分子生物學的進展闡明Smad4/DPC4 與多種信號通路相互串聯，越來越多的Smad4/DPC4 相關腫瘤成分及耐藥機制被發(fā)現，深入研究Smad4/DPC4 及相關生物分子將有助于對CRC 的治療。