邵武奎，趙準(zhǔn)，胡文冉，郝曉燕，高升旗，李建平，陳果，劉曉東*，黃全生*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830091）

棉花是全球最重要的經(jīng)濟作物之一。但是，棉花在生長發(fā)育過程中常受到許多不利環(huán)境條件的限制，包括生物和非生物脅迫。在這些脅迫中，由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的土傳性、毀滅性維管束病害黃萎病嚴重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。在棉花黃萎病嚴重暴發(fā)期間，棉花減產(chǎn)可能超過30%[2]。黃萎病菌侵染植物的根系引起維管枯萎發(fā)病[3]，并且形成的微菌核休眠結(jié)構(gòu)在沒有宿主的土壤中能存活數(shù)年進而感染后續(xù)作物[3]。目前，仍沒有殺菌劑能夠有效控制黃萎病，因此抗病品種的選擇和選育是控制黃萎病的根本措施[2]。但是調(diào)控棉花黃萎病抗性的關(guān)鍵基因和調(diào)控機制尚不清楚，在棉花種質(zhì)中鑒定抗黃萎病基因，并將其應(yīng)用到優(yōu)質(zhì)棉花品種的選育中具有重要意義[4]。

植物在長期進化過程中，形成了一系列多層次的監(jiān)測系統(tǒng)。植物用來防御微生物感染的先天免疫監(jiān)測系統(tǒng)主要有2 個層面：模式觸發(fā)的免疫（pattern-triggered immunity,PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity,ETI）。模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）識別病原體或微生物相關(guān)分子模式 （pathogen or microbial-associated molecular pattern, PAMP/MAMP）和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（endogenous damageassociated molecular pattern,DAMP）觸發(fā)PTI[5]。PRR 能檢測到病原體的分子特征，進而激發(fā)活性氧（reactive oxygen species,ROS）爆發(fā)、次生代謝物的產(chǎn)生和鈣離子（Ca2＋）流入胞漿，其中ROS 是參與植物生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子[6]。激素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是棉花對黃萎病的重要防御機制之一。其中，茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水楊酸（salicylic acid, SA）和乙烯（ethylene,ET）在植物感染病原菌后的應(yīng)激信號通路中發(fā)揮重要作用[6]。植物感染病原體后，PTI 和ETI 引發(fā)的免疫反應(yīng)將調(diào)節(jié)JA 的合成[7]，通常在短時間內(nèi)JA 含量會增加[8]。與JA 合成相關(guān)的JAZ（jasmonate-zim-domain protein，茉莉酸ZIM 結(jié)構(gòu)域蛋白）和AOS（allene oxide synthase，丙二烯氧化物合酶）等蛋白動態(tài)調(diào)節(jié)JA 合成，而JA 能增強擬南芥（Arabidopsis thaliana）對大麗輪枝菌和其他真菌的抗性[9]。

近年來，隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。許多與棉花黃萎病抗性相關(guān)的基因已被報道，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子如WRKY、NAC、bHLH、bZIP、ERF/AP2 和MYB 等家族成員參與棉花對黃萎病病菌的防御反應(yīng)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，植物免疫反應(yīng)過程中胞質(zhì)Ca2＋濃度顯著增加[10]。在病原體感染期間，細胞質(zhì)Ca2＋是植物細胞中重要的第二信使[11]。植物中鈣離子傳感器主要有3 種類型：鈣調(diào)蛋白 （calmodulin,CaM）和CaM 相關(guān)蛋白（CaM-related proteins）、鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase,CDPK）、類似于動物鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白（calcium B-like protein,CBL）。CDPK 蛋白被認為在植物先天免疫中起關(guān)鍵作用，包括參與ROS 調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答、防御相關(guān)基因表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]；CDPK 是各種PAMP 引發(fā)的PTI 信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐，而且能夠誘導(dǎo)ETI 標(biāo)志基因的表達。CDPK在病原體感染過程中可以被鈣信號激活，誘導(dǎo)構(gòu)象變化和激活激酶活性，導(dǎo)致CDPK 自身磷酸化和底物磷酸化[14]?，F(xiàn)已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)34 個CDPK基因[15]，其中AtCDPK28可以調(diào)節(jié)ROS 介導(dǎo)的防御信號，參與JA 和SA 相關(guān)的組織特異性平衡[16]。AtCDPK28被認為是免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負調(diào)控因子，AtCDPK28功能的喪失導(dǎo)致擬南芥對細菌感染的抗性增強[17]。在煙草（Nicotiana attenuata）中，與AtCDPK28同 源 性 較 高 的NaCDPK4和NaCDPK5基因被沉默后，煙草會積累大量的防御代謝產(chǎn)物[18]。與AtCDPK28同源的OsCDPK4和OsCDPK18在水稻（Oryza sativa）中的功能喪失導(dǎo)致免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和對病原體的抗性增強[19]。水稻OsCDPK9在稻瘟病反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。此外，JA 信號通路還與棉花感染大麗輪枝菌早期的防御反應(yīng)有關(guān)[20]。NPR1基因不僅在SA 介導(dǎo)的植物獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而且可與JA 信號通路的關(guān)鍵蛋白相互作用調(diào)節(jié)植物的免疫反應(yīng)[21]。前人研究表明，ROS 的爆發(fā)是植物識別病原體入侵后最早的防御反應(yīng)事件之一[22]。ROS 在抵抗病原體入侵時誘導(dǎo)相關(guān)防御基因的表達和細胞死亡，從而使植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性[23]。在棉花黃萎病抗性基因的研究中，許多基因的表達調(diào)控都與ROS 的信號傳導(dǎo)有關(guān)[24]。最近發(fā)現(xiàn)棉株中GhCDPK28（Gh_A11G186100）在大麗輪枝菌脅迫下表達上調(diào)并被磷酸化。敲低GhCDPK28表達導(dǎo)致棉花植株的ROS 含量增加，防御反應(yīng)增強，對大麗輪枝菌的敏感性降低[25]。

前期在用黃萎病菌接種棉花篩選黃萎病抗性相關(guān)基因時，發(fā)現(xiàn)陸地棉Gh_A10G086300受棉花黃萎病菌強烈誘導(dǎo)，序列比對分析表明該基因與擬南芥AtCDPK28基因高度同源，而且這個序列在陸地棉中含有其他5 個同源序列，將其命名為GhCDPK28-A10。本研究分析了GhCDPK28-A10同源序列的基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序和順式作用調(diào)控元件，并進一步分析了黃萎病菌、不同激素以及H2O2脅迫下GhCDPK28-A10基因在陸地棉中的轉(zhuǎn)錄水平，然后通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技術(shù)下調(diào)GhCDPK28-A10在陸地棉中的表達，對該基因的抗病功能進行初步分析，為豐富棉花抗病種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)。

1.1.1棉花品種.供試的棉花品種（系）是陸地棉（Gossypium hirsutumL.）標(biāo)準(zhǔn)品系TM-1，由新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點實驗室保存。TM-1 的種子用98%的硫酸溶液脫絨，在清水中多次洗滌晾干。每一盆播種5 株，共90 株，待播種后，置于人工氣候室在28 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件下生長。

1.1.2 黃萎病菌。本研究使用的黃萎病菌為本實驗室保存的強致病力的V991 菌株。

1.2.1GhCDPK28 的生物信息學(xué)分析。從棉花基因數(shù)據(jù)庫 （https://cottonfgd.net/）中獲得陸地棉GhCDPK28的6 個同源基因（Gh_A02G202200，Gh_A10G086300，Gh_A11G186100，Gh_D03G0-09200，Gh_D10G093700，Gh_D11G188500)，利用在線網(wǎng)站MEME Suite（http://meme-suite.org/）鑒定GhCDPK28的蛋白基序；通過在線網(wǎng)站Plant-CARE 預(yù)測GhCDPK28起始密碼子上游啟動子區(qū)1 500 bp 的順式作用元件；采用TBtools[26]軟件繪制GhCDPK28的基因結(jié)構(gòu)和染色體定位圖；通過GeneDoc 軟件對GhCDPK28 蛋白進行多序列比對。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得構(gòu)建進化樹的同源CDPK28 蛋白序列，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建GhCDPK28-A10（Gh_A10G086300）與 水 稻OsCDPK28 （XP_015619927）、玉米（Zea mays）ZmCDPK28（XP_020403601）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）GrCDPK28（XP_012443804）、番茄（Solanum lycop ersicum）SlCDPK28（NP_001234607）和 擬 南 芥AtCDPK28（NP_851280）的進化樹，自展值設(shè)置為1 005。

1.2.2 棉花GhCDPK28-A10 表達分析。將黃萎病菌V991 在28 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。從PDA 培養(yǎng)基中采集菌絲繼續(xù)在察氏液體培養(yǎng)基（2 g·L－1

NaNO3，1 g·L－1 KH2PO4，1 g·L－1 MgSO4·7H2O，1 g·L－1 KCl，2 mg·L－1 FeSO4·7H2O，30 g·L－1 蔗糖）中以150 r·min－1 的速度在28 ℃條件下培養(yǎng)5 d，用無菌水將孢子懸浮液的終濃度調(diào)節(jié)至分生孢子106～107 個·mL－1。當(dāng)棉花幼苗長到三葉期時，用V991 孢子懸浮液進行灌根法處理，以清水為對照，分別采集處理后0 h、0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 的根系樣品。分別用200 μmol·L－1 茉莉酸甲酯（methyl jasminate,MeJA），2 mmol·L－1 SA和1 mmol·L－1H2O2浸泡根系10 min，以清水為對照（CK），處理后0.5 h、1 h 和3 h，采集根系[27]分析外源SA、MeJA 和H2O2對GhCDPK28-A10表達的影響；采集棉花三葉期的根、莖、真葉，分析GhCDPK28-A10的組織特異性表達，上述所有處理樣品均以3 份樣本混合作為1 個重復(fù)，每個處理每個時間段各設(shè)3 個重復(fù)，用鋁箔紙包裹置于液氮中凍存，并在－80 ℃保存。

使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure 試劑盒提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試 劑 盒One-Step gDNA Removal 和cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）獲得cDNA。使用Primer Premier 5 設(shè)計實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物（表1）。以陸地棉中高度保守的基因GhUBQ7作為內(nèi)參基因，使用賽默飛世爾科技（中國）有限公司的Applied Biosystems StepOne 熒光定量儀進行qRT-PCR。使用Top Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）制備qRT-PCR 反應(yīng)體系。采用2－△△Ct 法計算GhCDPK28-A10基因的相對表達量[27]。

1.2.3GhCDPK28-A10基因沉默和黃萎病病原菌接種。通過Primer Premier 5 設(shè)計GhCDPK28-A10基因特異性VIGS 片段引物（表1），將特異性VIGS 擴增片段與-blunt zero 載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）連接。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 后，篩選陽性菌落進行PCR 檢測。然后送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序正確后，使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ進行酶切，將GhCDPK28-A10基因VIGS 沉默片段和TRV::RNA2 載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5α，酶切驗證后，將構(gòu)建成功的TRV2::GhCDPK28-A10載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，并于－80 ℃儲存。

待棉花幼苗生長至子葉完全展開時，將含TRV2::00、TRV2::GhCDPK28-A10和TRV2::Gh-CLA1（Cloroplastos alterados1，陽性對照具有明顯的白化表型）載體以及TRV::RNA1 載體的農(nóng)桿菌GV3101 分別在含有卡那霉素、利福平和慶大霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 ℃，200 r·min－1培養(yǎng)至OD600＝1.5，5 000 r·min－1離心10 min，棄上清；用懸浮液（10 mmol·L－1MgCl2，10 mmol·L－12-嗎啉乙磺酸，200 μmol·L－1乙酰丁香酮）等體積懸浮菌體至OD600＝1.5，室溫靜置3 h 后，將TRV2::00，TRV2::CLA1, TRV2::GhCDPK28-A10的懸浮液分別與含TRV::RNA1 載體的農(nóng)桿菌懸浮液1∶1（體積比）混合；混合后分別注射至棉花幼苗子葉中，黑暗處理24 h 后正常培養(yǎng)（轉(zhuǎn)化的植株分別記作TRV::00，TRV::CLA1和TRV::GhCDPK28-A10）。大約培養(yǎng)14 d 后，當(dāng)GhCLA1陽性對照的沉默棉花出現(xiàn)白化表型時，檢測TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株中GhCDPK28-A10的表達情況和沉默效率，并將V991 病菌懸浮液使用灌根法接種棉花幼苗。

1.2.4GhCDPK28-A10沉默棉株的抗病性鑒定。在黃萎病菌V991 接菌處理20 d 左右時棉花幼苗葉片變黃、枯萎，參照Hu 等[27]的方法對棉花GhCDPK28沉默植株和對照植株進行表型鑒定和病情指數(shù)統(tǒng)計分析，評估幼苗的病害嚴重程度。

TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株抗病性鑒定試驗中每個重復(fù)鑒定90 株棉花，共3 次重復(fù)。為了測定棉花幼苗所含黃萎病菌的生物量，在黃萎病菌處理20 d 后分別于沉默植株和對照植株子葉節(jié)點下方1 cm 處采集莖段，首先將TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10的莖段在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后觀察大麗輪枝菌的生長情況并統(tǒng)計侵染率；然后以對照植株和沉默植株的莖段總DNA 作為模板，利用qRT-PCR 檢測真菌DNA 相對豐度，對照植株和沉默植株分別采集30 個莖段，重復(fù)3 次，并進行剖稈實驗觀察維管束中大麗輪枝菌生長情況。以棉花內(nèi)源基因GhUBQ7為對照，利用真菌特異性ITS1-F 引物與V.dahliae特異性引物ST-VE1-R（表1），進行黃萎病菌DNA 豐度檢測。植株病情指數(shù)統(tǒng)計和侵染率計算公式如下：

表1 本研究所使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

式中，i表示從0 到4 的發(fā)病等級，ni是i發(fā)病等級的植株數(shù)，N是總植株數(shù)。

侵染率＝發(fā)病莖段數(shù)/總莖段數(shù)×100%.

1.2.5 H2O2的積累，激素相關(guān)基因與抗病相關(guān)基因的表達水平測定。用3，3’-鹽酸二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DABHCl）對接菌后TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株葉片進行染色。沉默植株和對照植株的葉片分別在1 mg·mL－1DAB-HCl（Sigma-Aldrich）pH 為3.8 的溶液中室溫黑暗過夜浸泡，并用乳酸、甘油、乙醇混合液（體積比為1∶1∶2）進行脫色。

隨機從TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株中采集第2 片真葉，重復(fù)3 次。然后用qRTPCR 分析NPR1（Gh_A08G2190）、PDF1.2（Gh_D01G2290）、PR1（Gh_A12G0274）、PR4（Gh_D13G1816）、JAZ1（Gh_A06G0705）5 個防御標(biāo)記相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達水平，方法同1.2.2。

用Excel 進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0 進行方差分析，使用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

選取模式植物擬南芥和其他種植廣泛的大田作物的CDPK28 蛋白序列，與GhCDPK28-A10構(gòu)建進化樹（圖1A），結(jié)果表明：同源的蛋白中，擬南芥和番茄中的CDPK28 與GhCDPK28-A10的序列相似度最高，其次是雷蒙德氏棉、玉米和水稻中的同源蛋白。染色體定位顯示陸地棉中GhCDPK28-A10的6 個同源基因分布在不同的染色體上（圖1B）。利用陸地棉全基因組GFF 注釋文件提取了GhCDPK28-A10外顯子和內(nèi)含子信息，該基因的6 個同源序列均含有12 個外顯子，除了Gh_D11G188500外，其余同源序列均有UTR 區(qū)域（圖1C）。GhCDPK28-A10 蛋白序列的基序分析結(jié)果顯示：GhCDPK28-A10 同源蛋白含有相似數(shù)量和排列的保守基序（圖1D），這表明GhCDPK28-A10基因在進化上的保守性和同源性。截取GhCDPK28-A10基因起始密碼子上游的1 500 bp 序列，并通過PlantCARE 在線網(wǎng)站預(yù)測序列中所包含的順式作用元件，結(jié)果顯示GhCDPK28-A10啟動子區(qū)含有響應(yīng)JA 的順式作用元件TGACG 基序和MYB 基序，一些脫落酸（abscisic acid,ABA）和光反應(yīng)相關(guān)的作用元件ABRE 和GT1 基序以及轉(zhuǎn)錄表達核心元件和一些響應(yīng)非生物脅迫的基序如MBS、CTR、ARE 等（圖1E）。這些順式作用元件預(yù)測分析表明GhCDPK28-A10不僅可能被JA 誘導(dǎo)，而且可能參與棉花抵抗非生物脅迫的過程。通過蛋白多序列比對，發(fā)現(xiàn)GhCDPK28-A10 含有典型的CDPK家族絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（S_TKc）和EF 手型結(jié)構(gòu)域（EF-hand）（圖1F）。

圖1 GhCDPK28-A10 同源序列生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of GhCDPK28-A10 homologous sequences

組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)GhCDPK28-A10在根、莖和真葉中均有表達，尤其是在葉中的表達量極顯著高于根和莖（圖2A），推測其可能在不同組織中發(fā)揮的功能具有差異性。通過MeJA、SA和H2O2處理，發(fā)現(xiàn)MeJA 和H2O2處理后3hGhCDPK28-A10表達量顯著升高，而SA 處理的影響不顯著（圖2B）。用黃萎病菌處理棉花幼苗，發(fā)現(xiàn)GhCDPK28-A10的表達量在CK 和V991處理之后均隨時間推移而降低，但在接種后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h 的表達水平均極顯著或顯著低于CK （圖2C）。這些發(fā)現(xiàn)表明GhCDPK28-A10受黃萎病菌和H2O2誘導(dǎo)表達，可能通過JA 信號通路參與對黃萎病的防御反應(yīng)。

圖2 棉花GhCDPK28-A10 的表達模式Fig.2 The expression pattern of GhCDPK2-A10 in cotton

為了探究GhCDPK28-A10在棉花抗黃萎病中的作用，利用VIGS 技術(shù)沉默GhCDPK28-A10基因后接種V991 來分析沉默植株的抗病性。當(dāng)TRV::GhCLA1植株新展開的真葉出現(xiàn)白化表型時，表明VIGS 試驗是有效的（圖3A）。通過qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)在TRV::GhCDPK28-A10沉默的棉花植株中GhCDPK28-A10的表達量顯著降低（圖3B）。接種病原菌后對棉花幼苗植株表型分析發(fā)現(xiàn)，對照植株的典型黃萎病癥狀如葉片萎蔫枯黃等表型較GhCDPK28-A10基因沉默植株更為嚴重（圖3C）。病情指數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)沉默GhCDPK28-A10植株的病情指數(shù)顯著低于對照TRV::00植株，分別為32 和51（圖3D）。對接種黃萎病菌的GhCDPK28-A10沉默和對照棉花植株的莖段進行黃萎病菌繁殖比較，發(fā)現(xiàn)接種5 d后沉默植株大麗輪枝菌侵染率顯著低于對照植株（圖3E），同時沉默植株有病菌繁殖的莖段數(shù)明顯低于對照植株（圖3F），且對照植株維管束的棕色變化比沉默植株更明顯（圖3G）。黃萎病菌豐度檢測顯示，在GhCDPK28-A10沉默的植株中檢測到的黃萎病真菌DNA 水平顯著低于對照植株 （圖3H），此外，DAB 染色發(fā)現(xiàn)TRV::GhCDPK28-A10顯示更多的ROS 積累和細胞死亡（圖3I）。這些結(jié)果表明，沉默GhCDPK28-A10的棉花黃萎病抗性增強，GhCDPK28-A10可能負調(diào)控棉花對黃萎病的抗性。

圖3 抑制GhCDPK28-A10 表達增強了棉花對黃萎病的抗性Fig.3 Inhibition of GhCDPK28-A10 expression enhances resistance to Verticillium wilt in cotton

為了探究沉默GhCDPK28-A10增強棉花對大麗輪枝菌的防御分子機制，檢測在接種V991后TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株體內(nèi)與防御相關(guān)的關(guān)鍵基因GhPR1、GhNPR1、Gh-PDF1.2、GhPR4以及JA 合成相關(guān)基因GhJAZ1的表達水平變化。結(jié)果表明，清水處理下，相較于TRV::00，TRV::GhCDPK28-A10植 株GhPR1、GhNPR1和GhPR4的表達沒有顯著變化，而接種V991 后，TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植 株中這些基因的表達量均升高，且沉默植株中的表達量顯著高于TRV::00植株（圖4A～C），表明沉默GhCDPK28-A10植株接菌后，抗病基因GhPR1、GhNPR1和GhPR4上調(diào)表達，從而使得TRV::GhCDPK28-A10植株對黃萎病菌產(chǎn)生更強的抗性。CK 和V991 處理下，GhPDF1.2基因在TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株中的表達水平?jīng)]有顯著性差異，V991 處理后TRV::00和TRV::GhCDPK28-A10植株中GhPDF1.2的表達均要高于CK （圖4D）。在CK 和V991 處理后，GhJAZ1在TRV::00植株中的表達水平均顯著高于其在TRV::GhCDPK28-A10植株中的表達水平，但是在V991 處理后，GhJAZ1在沉默植株中的表達量較CK 下降倍數(shù)更大。（圖4E）。這些防御相關(guān)標(biāo)記基因的表達水平變化暗示沉默GhCDPK28-A10后，解除了植物體對JA 合成上游通路的抑制，使得JA 積累，誘導(dǎo)相關(guān)抗病基因的表達，進而增強了棉花對黃萎病的抗性。

圖4 黃萎病抗性相關(guān)基因的表達分析Fig.4 Expression analysis of genes related to Verticillium wilt resistance

Ca2＋作為一種重要的二級信使不僅參與了植物的生長發(fā)育過程，而且是響應(yīng)逆境脅迫重要的信號分子之一。CDPK 被認為是傳感器蛋白，能夠通過EF 手型結(jié)構(gòu)域結(jié)合Ca2＋并改變蛋白構(gòu)象以響應(yīng)細胞環(huán)境的變化。CDPK 廣泛參與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同生物學(xué)過程[28-29]。本研究通過生物信息學(xué)分析、外源激素處理和VIGS 試驗發(fā)現(xiàn)GhCDPK28-A10參與調(diào)節(jié)棉花的生長發(fā)育及其對黃萎病菌的應(yīng)激反應(yīng)。GhCDPK28-A10 具有典型的鈣依賴蛋白激酶家族絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和EF 手型結(jié)構(gòu)域，啟動子區(qū)域存在響應(yīng)JA、ABA 和一些光反應(yīng)順式作用元件，表明其可能通過調(diào)節(jié)Ca2＋信號參與JA 和ABA 等誘導(dǎo)的生物和非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)。已有研究結(jié)果表明GhCDPK28-A10不僅受到黃萎病菌誘導(dǎo)表達，而且也受JA 和H2O2處理的誘導(dǎo)。由于這些因素通常誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)性獲得性抗性，推測GhCDPK28-A10基因可能參與棉花對黃萎病的響應(yīng)并通過JA 調(diào)控途徑發(fā)揮作用。VIGS 試驗證實GhCDPK28-A10基因沉默棉株對黃萎病菌的抗性顯著增強，表明GhCDPK28-A10在抗棉花黃萎病侵染中起負調(diào)控作用。

ROS 作為重要的次級免疫激活信號，是植物體感知并阻止病原菌入侵的產(chǎn)物[30]。在本研究中，接種黃萎病菌后，與TRV::00植株相比，TRV::GhCDPK28-A10植株富集了更多的H2O2，表明棉花植株對黃萎病菌抗性的增加可能與壞死性病原體引起的胞外高水平ROS 有關(guān)。NPR1作為重要的植物抗病基因，參與SA 和JA 誘導(dǎo)的PR基因表達[31]，盡管GhCDPK28-A10不受外源SA 誘導(dǎo)表達，但接菌后TRV::GhCDPK28-A10植株GhNPR1表達升高，暗示了TRV::GhCDPK28-A10植株中GhNPR1表達受JA 誘導(dǎo)。PR1的表達上調(diào)對系統(tǒng)性獲得性抗性至關(guān)重要[32-33]。JA 誘導(dǎo)的PDF1.2基因能夠增強植物對壞死性真菌的基礎(chǔ)抗性。接菌后TRV::00植株和TRV::GhCDPK28-A10植株GhPDF1.2的表達量均高于CK，然而其在TRV::GhCDPK28-A10植株中的表達水平低于對照植株，這其中潛在的機理仍需要進一步研究解釋。PR4 可以穿過病原體的菌絲膜，與真菌凝集素相互作用破壞真菌對植物的侵染[34]，GhNPR1、GhPR1和GhPR4在TRV::GhCDPK28-A10植株中表達上調(diào)。已有研究發(fā)現(xiàn)，JA 廣泛參與植株抗病過程，JA 的積累能夠有效提高植物的抵抗力。JA 合成相關(guān)GhJAZ1基因在TRV::GhCDPK28-A10植株中的表達降低。這些結(jié)果表明GhCDPK28-A10沉默植株對黃萎病抗性的提高可能與JA 信號通路及ROS 富集有關(guān)，潛在的機制仍需要在未來的研究中進行探索。

本研究探討了GhCDPK28-A10與棉花黃萎病抗性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GhCDPK28-A10（Gh_A10G086300）在大麗輪枝菌脅迫下表達下調(diào)。在棉花中沉默GhCDPK28-A10基因，會導(dǎo)致活性氧含量增加，提高一系列抗病相關(guān)基因的表達從而增強棉花植株的抗病能力。這些結(jié)果說明GhCDPK28-A10可能是負調(diào)控棉花黃萎病抗性的重要候選基因，但GhCDPK28-A10調(diào)控棉花黃萎病抗性的機制有待進一步闡明。