常鑫燚，李軒照，唐秉暉，潘振遠(yuǎn)，吳元龍，沈超，努日曼古麗·艾尼，林忠旭,4，尤春源,4*，聶新輝*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2.石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，新疆 石河子 832011；3.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/ 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

棉花作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物及戰(zhàn)略物資來源，在國民經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的地位。黃萎?。╒erticillium wilt）被稱為棉花的“癌癥”，是直接影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，對棉花生長發(fā)育造成不可逆的傷害。棉花黃萎病屬于土傳真菌病害，黑白輪枝菌（V.albo-atrum）和大麗輪枝菌（V.dahilae）是其致病菌[1-2]，主要危害棉花維管束及葉片等組織（器官），致使棉花葉片黃化、萎蔫、脫落及植株死亡[3]，嚴(yán)重阻礙棉花營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸及光合作用的進(jìn)行。在棉花生產(chǎn)中，其防治非常困難。因此，加強(qiáng)對棉花黃萎病抗性調(diào)控機(jī)理的研究[4]和選育抗病新品種[5]是防治棉花黃萎病最有效的措施。數(shù)年來，眾多科研工作者對棉花抗黃萎病調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究[6-7]，發(fā)掘與黃萎病抗性相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait loci,QTL）[8-9]，并通過遺傳轉(zhuǎn)化及基因功能分析[10-11]等方法進(jìn)行驗(yàn)證。

陸地棉（Gossypium hirsutum）是全球種植面積最大的棉花栽培種，其產(chǎn)量占世界棉花總產(chǎn)量95%以上[12]。但其遺傳背景較為狹窄，通過種內(nèi)雜交改良性狀非常困難[13]。黃褐棉（G.mustelinum）原產(chǎn)于巴西，與陸地棉遺傳背景差異大，具有豐富的抗病基因[14]，其野生棉種質(zhì)資源對提高陸地棉纖維品質(zhì)、拓寬遺傳背景具有重大價(jià)值[15-16]。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)不斷發(fā)展完善，被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模群體基因型鑒定和QTL 定位，大大提高了發(fā)掘調(diào)控優(yōu)良性狀基因或標(biāo)記的效率。利用特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序技術(shù)（specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq），能夠在全基因組范圍內(nèi)鑒定和開發(fā)特異性的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）標(biāo)記[17]。SNP 標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系及遺傳變異分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析和構(gòu)建遺傳圖譜，具有高效、精確等特點(diǎn)[18-19]。

國內(nèi)外許多研究報(bào)道是關(guān)于利用分子標(biāo)記技術(shù)和不同群體檢測到大量與棉花黃萎病抗性相關(guān)的QTL。趙君等[20]以蘇VR018 為母本、泗棉3 號為父本構(gòu)建F2群體，并檢測到4 個(gè)與棉花黃萎病抗性相關(guān)的QTL，分別位于A05、D05、D05和D06 染色體上。鄧琳等[21]構(gòu)建了以陸地棉PD94042 為輪回親本、黃褐棉為供體親本的導(dǎo)入系群體，檢測到10 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，解釋14.0%～39.3%的表型變異。Rashid[22]利用300 份有中棉所36 背景的陸海漸滲系材料進(jìn)行QTL 定位，檢測到60 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，解釋3.8%～11.9%的表型變異。魯寧寧[23]以抗、感黃萎病棉花品種構(gòu)建的重組自交系（recombinant inbred line,RIL）和F2群體為研究材料，在RIL 群體中檢測到8 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，在F2群體檢測到6 個(gè)QTL 與黃萎病抗性相關(guān)。李廷剛等[24-25]以299 份陸地棉材料構(gòu)建關(guān)聯(lián)群體，檢測到17 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，且A10 染色體上的SNP（A10_99672586）位點(diǎn)在3 個(gè)環(huán)境內(nèi)均被檢測到。楊芮[26]利用海陸漸滲系BMI9626 和中棉所36 構(gòu)建F2、F2:3、F2:4群體，檢測到10 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，可解釋3.32%～10.00%的表型變異，其中7 個(gè)QTL 在多個(gè)環(huán)境下均被檢測到。

黃褐棉導(dǎo)入系群體 （以下簡稱為BC5S5群體）的輪回親本陸地棉B0011（以下簡稱為B0011）有產(chǎn)量高、綜合性狀優(yōu)良等特性[27]，是華雜棉H318 的親本之一[28]。供體親本黃褐棉具有纖維品質(zhì)優(yōu)良、抗黃萎病等特性[14]。因此，本研究在多年多點(diǎn)環(huán)境下鑒定BC5S5群體的黃萎病抗性，并結(jié)合基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL 定位，以期挖掘到與黃萎病抗性相關(guān)的穩(wěn)定QTL，為抗黃萎病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

以黃褐棉為供體親本，與輪回親本B0011 雜交產(chǎn)生F1，并與B0011 連續(xù)回交5 次，回交過程選取具有代表性株系與輪回親本雜交，并進(jìn)行標(biāo)記鑒定，獲得71 個(gè)BC5株系。然后通過單子傳法將71 個(gè)株系連續(xù)自交5 代，最后獲得有71 個(gè)株系的黃褐棉導(dǎo)入系群體（BC5S5群體）并作為試驗(yàn)材料[16]。回交和自交過程利用分子標(biāo)記法進(jìn)行鑒定，以獲得遺傳穩(wěn)定的導(dǎo)入系材料。

以71 個(gè)株系和親本 （陸地棉B0011、黃褐棉）幼嫩葉片為材料，利用液氮速凍，在－70 ℃條件下貯藏。隨后使用Plant Genomic DNA Kit（天根生化，北京，中國）提取基因組DNA，利用Nano-Drop 2000C 超微量分光光度計(jì)（賽默飛，美國）檢測提取基因組DNA 的濃度和純度，OD260/OD280在1.8～2.0 視為符合質(zhì)量要求，用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳進(jìn)一步檢測提取基因組DNA 的純度和完整性，滿足建庫要求后，送至百邁客生物科技有限公司用Illumina HiSeq-2500平臺(tái)（因美納，美國）進(jìn)行高通量測序、標(biāo)簽分析和變異鑒定[29-30]。親本測序深度為20 倍，子代測序深度為5 倍。

2018―2019 年分別在瑪納斯農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站病圃地（2018 年記為E1、2019 年記為E3）和庫爾勒試驗(yàn)站病圃地（2018 年記為E2、2019 年記為E4）種植BC5S5群體和親本B0011。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2 次重復(fù)，每小區(qū)種植2 行，行長5 m；種植模式：一膜四行，行距（28＋50＋28）cm＋55 cm，株距9.5 cm。以新陸早36 為感病對照，以中植棉2號為抗病對照。

當(dāng)感病對照病情指數(shù) （disease index,DI）高于35 時(shí)開始進(jìn)行抗病性鑒定。瑪納斯試驗(yàn)點(diǎn)分別于2018 年6 月28 日和2019 年7 月3 日、庫爾勒試驗(yàn)點(diǎn)分別于2018 年7 月5 日和2019 年7月3 日進(jìn)行抗病性鑒定，每個(gè)環(huán)境每隔10 d 進(jìn)行1 次抗病性鑒定，共鑒定3 次。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22101.5－2009 《棉花抗病蟲性評價(jià)技術(shù)規(guī)范 第5 部分：黃萎病》[31]的五級法進(jìn)行棉花黃萎病抗性鑒定，并計(jì)算病情指數(shù)和相對病情指數(shù)（relative disease index,RDI）。

1.4.1表型分析。對4 個(gè)環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 24.0 進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析（如均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)、峰度及偏度等）和方差分析（單因素一般線性模型）[32]。利用R 語言lme4 包（https://cran.r-project.org/web/packages/lme4/index.html）進(jìn)行最佳線性無偏預(yù)測（best linear unbiased prediction,BLUP）評估及遺傳力計(jì)算，用R語 言corrplot 包（https://cran.r-project.org/web/packages/corrplot/index.html）對BC5S5群體在4個(gè)環(huán)境下的RDI 均值進(jìn)行皮爾遜（Pearson）相關(guān)分析。其中，方差分析、BLUP 值評估和相關(guān)分析選用3 次調(diào)查中變異系數(shù)最大的1 次抗病性鑒定結(jié)果。

1.4.2QTL 定位。本研究選用4 個(gè)環(huán)境中RDI變異系數(shù)最大的1 次抗病性鑒定結(jié)果作為該環(huán)境的表型值進(jìn)行QTL 定位。QTL 定位參照沈超等[16]和Wang 等[33]的定位方法。利用2 839 個(gè)SNP標(biāo)記[16]，結(jié)合QTL IciMapping 4.1（https://isbreeding.caas.cn/）軟件[33]CSL 功能基于逐步回歸加性效應(yīng)模型（RSTER-LRT- 加性效應(yīng)值）檢測與黃萎病抗性相關(guān)QTL，設(shè)對數(shù)優(yōu)勢比（logarithm of the odd score，LOD）閾值≥2.5。根據(jù)軟件數(shù)據(jù)格式要求，將與受體親本B0011 相同的基因型記為“0”，與供體親本黃褐棉相同的基因型記為“2”。參照McCouch 等的規(guī)則命名QTL[34]，根據(jù)BLUP 值檢測的QTL 后面加上“B”作區(qū)分，在2個(gè)或2 個(gè)以上環(huán)境同時(shí)被檢測到的QTL 被認(rèn)為是穩(wěn)定QTL[35]，并利用R 語言LinkageMapView包（https://cran.r-project.org/web/packages/Linkage-MapView/）繪制與黃萎病抗性相關(guān)QTL 的染色體分布圖。

在CottonQTLdb 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.cottonqtldb.org）中檢索并下載抗黃萎病相關(guān)的QTL[36]，并利用QTL 標(biāo)記在Cottongen 數(shù)據(jù)庫（https://www.cottongen.org/find/markers）中確定相應(yīng)QTL的物理位置[37]。物理位置相同或物理位置包含本研究檢測到的QTL 視為對已鑒定QTL 的重復(fù)鑒定，反之，則視為新檢測到的QTL。

對4 個(gè)環(huán)境下BC5S5群體RDI 進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。BC5S5群體平均RDI 為13.62～43.66，變異系數(shù)為21.45%～67.93%，遺傳力為83.89%～95.17%。其中，E1 的發(fā)病相對較輕，RDI 為1.04～60.61，平均為13.62～27.92；E3的發(fā)病最重，RDI 為14.94～85.77，平均為39.49～43.66（表1 和附圖1）。其中，E1_1、E2_1、E3_1 和E4_1 是相應(yīng)環(huán)境中離散程度較高、變異系數(shù)最大的調(diào)查結(jié)果?；谶@4 次調(diào)查數(shù)據(jù)的BLUP值的頻率分布，發(fā)現(xiàn)BC5S5群體RDI 呈現(xiàn)相對連續(xù)的正態(tài)分布，且分離較大，峰度和偏度滿足正態(tài)分布要求，符合數(shù)量性狀分布特性（圖1）。因此，本研究后續(xù)的方差分析、相關(guān)分析及QTL 分析均基于E1_1、E2_1、E3_1 和E4_1。

表1 BC5S5 群體相對病情指數(shù)描述統(tǒng)計(jì)Table 1 Relative disease index description statistics of the BC5S5 population

圖1 BC5S5 群體相對病情指數(shù)在多環(huán)境中BLUP的頻率分布Fig.1 BLUP frequency distribution of relative disease index of BC5S5 population in multi-environments

為了解棉花黃萎病的發(fā)生是否受到基因型和環(huán)境的影響，對2.1 選擇的E1_1、E2_1、E3_1和E4_1 的RDI 進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表2）表明基因型、環(huán)境以及基因型與環(huán)境的互作對RDI 的影響均在0.001 水平極顯著。表明棉花黃萎病的發(fā)生程度不僅受基因型和環(huán)境的影響，也易受基因型與環(huán)境互作的影響。

表2 相對病情指數(shù)不同環(huán)境間的方差分析Table 2 ANOVA analysis of relative disease index in different environments

對在相應(yīng)環(huán)境內(nèi)變異系數(shù)最大的4 個(gè)環(huán)境進(jìn)行BC5S5群體RDI 相關(guān)分析，結(jié)果（表3）表明：4 個(gè)環(huán)境間RDI 均存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.29～0.65，其中，E1 與E3 的相關(guān)系數(shù)為0.65，存在較強(qiáng)的相關(guān)性；E2 與E3 的相關(guān)系數(shù)為0.29，相關(guān)性較弱。表明不同環(huán)境間RDI具有較大差異。

表3 不同環(huán)境下BC5S5 群體相對病情指數(shù)相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis of relative disease index of BC5S5 population in different environments

2.4.1黃萎病抗性相關(guān)QTL。利用QTL IciMapping 4.1 軟件，共檢測到15 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，表型變異解釋率（phenotypic variance explained,PVE）為4.21%～26.77%，LOD 值為2.69～12.44，加性效應(yīng)值為－13.29～14.59。在At 亞基因組共檢測到10 個(gè)QTL，其中A02 和A07 染色體上各檢測到2 個(gè)QTL；在Dt 亞基因組共檢測到5 個(gè)QTL，分別在D03、D04、D06、D10 和D12染色體上。其中，qVW-A01-1（E1 和E3 環(huán)境）、qVW-A02-2（E1、E2 和E3 環(huán)境）、qVW-A07-2（E3和E4 環(huán)境）在2 個(gè)及以上環(huán)境中被檢測到，PVE分別為15.56%～16.56%、11.95%～24.62%和13.22%～16.73%（表4 和附圖2），表明這些QTL比較穩(wěn)定、可能與棉花黃萎病抗性有較強(qiáng)的連鎖性。

表4 黃萎病抗性相關(guān)的QTL 信息Table 4 Information of QTL related to Verticillium wilt resistance

2.4.2基于BLUP 值的黃萎病抗性相關(guān)QTL?；贐C5S5群體在4 個(gè)環(huán)境中RDI 的BLUP 值，共檢測到5 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL （表5），PVE 為6.10%～23.67%，LOD 值為3.43～10.42，加性效應(yīng)值為－3.94～5.66，分布在A01、A02、A10、D02 和D06 染色體上。其中qVW-A01-1B、qVW-A02-1B和qVW-D06-1B的PVE 分 別 為23.67%、17.90%和12.66%，分別與前文鑒定的qVW-A01-1、qVW-A02-2和qVW-D06-1的 物 理位置一致（表5 和附圖3）。

表5 基于BLUP 值鑒定的黃萎病抗性相關(guān)的QTLTable 5 QTL related to Verticillium wilt resistance based on BLUP value

作圖群體不僅是QTL 分析的基礎(chǔ)，更是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的根本。目前，常用于QTL 定位的群體有F2、F2:3、回交一代（backcross generation,BC1）、加倍單倍體（doubled haploid, DH）和RIL等分離群體[38]，但這些群體遺傳背景較為復(fù)雜，且棉花黃萎病是多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境及基因的共同影響，導(dǎo)致QTL 的精確定位相對困難。然而，導(dǎo)入系群體經(jīng)過不斷與輪回親本回交，遺傳背景僅含有供體親本1 個(gè)或幾個(gè)染色體片段[39]，使導(dǎo)入系群體成為QTL 分析的理想材料。因此，親本選擇及作圖群體類型是影響QTL分析的關(guān)鍵因素。黃褐棉具有纖維品質(zhì)優(yōu)良及抗病性強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)[14]，本研究以黃褐棉為供體親本構(gòu)建有71 個(gè)株系的BC5S5群體可用于檢測棉花黃萎病抗性相關(guān)的QTL，為檢測穩(wěn)定QTL 位點(diǎn)、分子標(biāo)記輔助選擇育種及候選基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

我國棉花黃萎病菌的分布及棉花黃萎病抗性調(diào)控機(jī)理十分復(fù)雜。張桂寅等[40-41]利用1 個(gè)海島棉和15 個(gè)陸地棉品種為分離寄主對大麗輪枝菌進(jìn)行分析，共分離出Teyu1、Han7860、Han6208等67 個(gè)菌系；致病力鑒定表明從同一田塊不同棉花品種上分離的黃萎病菌是由致病力不同的多種菌系構(gòu)成，不同品種上分離的菌系致病力存在差異；寄主品種的抗性與分離的黃萎病菌系的致病力無關(guān)，且不同基因型品種可能會(huì)影響不同致病力菌落的消長。本研究將包含71 個(gè)株系的BC5S5群體種植于病圃中，并進(jìn)行多年多點(diǎn)的黃萎病抗性鑒定，方差分析顯示，基因型和環(huán)境對棉花黃萎病發(fā)生程度的影響均達(dá)極顯著水平，同時(shí)基因型與環(huán)境互作對棉花黃萎病發(fā)生程度的影響也極顯著。相關(guān)分析顯示，4 個(gè)環(huán)境下群體的RDI 間存在顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，且不同環(huán)境間RDI 存在較大差異。因此，棉花黃萎病發(fā)生易受基因型及種植環(huán)境的影響。

研究表明，并非所有的有利等位基因均來源于高值親本[42]。孫穎[43]以黃褐棉為供體親本，中棉所35 為輪回親本構(gòu)建有564 個(gè)單株的BC3F2群體，連鎖分析共檢測到121 個(gè)QTL 與棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀相關(guān)，其中，46 個(gè)QTL 有利等位基因來源于黃褐棉。陳奇等[44]基于黃褐棉導(dǎo)入系進(jìn)行棉花衣分QTL 定位，共檢測到21 個(gè)QTL，其主效QTLqLP-3增效基因均來源于黃褐棉。鄧林等[21]基于黃褐棉導(dǎo)入系定位棉花抗黃萎病相關(guān)的QTL，共檢測到10 個(gè)QTL，其中4 個(gè)QTL 增效基因來源于黃褐棉。

本研究中，在4 個(gè)環(huán)境下共檢測到15 個(gè)與棉花黃萎病抗性相關(guān)的QTL，加性效應(yīng)分析結(jié)果（表4）顯示：有6 個(gè)QTL 為正向加性效應(yīng)，且加性效應(yīng)為5.10～14.59，表明有利等位基因來源于供體親本黃褐棉，其中本研究檢測到的穩(wěn)定QTL：qVW-A02-2的加性效應(yīng)為7.53～11.23；有9 個(gè)QTL 有利等位基因來源于B0011，加性效應(yīng)為－13.29～－2.40，其中qVW-A01-1和qVWA07-2為本研究穩(wěn)定檢測的QTL。利用BLUP 值進(jìn)行棉花抗黃萎病相關(guān)QTL 分析，共檢測到5個(gè)QTL（表5），其中2 個(gè)QTL 的有利等位基因來源于黃褐棉，3 個(gè)QTL 的有利等位基因來源于B0011。此結(jié)果證實(shí)了有利等位基因并非都只來源于高值親本。

關(guān)于棉花抗黃萎病相關(guān)QTL 定位已有較多報(bào)道，但大多是基于簡單重復(fù)序列 （simple sequence repeat,SSR）標(biāo)記進(jìn)行，不能提供較為精確的物理位置。棉花全基因組測序的完成和高通量分子標(biāo)記（如SNP）的開發(fā)應(yīng)用，使得棉花黃萎病抗性相關(guān)基因定位更精確。

本研究共檢測到3 個(gè)穩(wěn)定QTL（qVW-A01-1、qVWA02-2和qVW-A07-2），且qVW-A01-1、qVW-A02-2在黃萎病抗性相關(guān)QTL 定位及基于BLUP 值的黃萎病抗性相關(guān)QTL 定位中均被檢測到。通過與前人鑒定的QTL 進(jìn)行比較，本研究檢測到的部分位點(diǎn)與前人鑒定到的與棉花黃萎病抗性相關(guān)QTL 的物理位置相近或一致。Palanga等[45]利用有169 個(gè)株系的RIL 群體進(jìn)行黃萎病抗性相關(guān)QTL 定位，共檢測到119 個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，其中qDInc-C1-1（標(biāo)記i23690Gh和i25127Gh）和qDInc-C1-2（標(biāo)記i35470Gh 和i40498Gh）在陸地棉TM-1 參考基因組的物理位置分別為A01 染色體98 274 676～106 996 201 bp和99 181 202～102 158 017 bp，與本研究檢測到的來源于黃褐棉的增效基因qVW-A01-1（99 228 055 bp）位置相近；qDInc-C10-3（標(biāo)記i43465Gh和i44312Gh）物理位置為A10 染色體70 467 989～71 371 332 bp，與本研究檢測到的qVW-A10-1（71 301 137 bp）相近；qDI-C12-2（標(biāo)記：i45732Gh和i49103Gh）物理位置為A12 染色體3 042 213～5 012 230 bp，與本研究檢測到的qVW-A12-1（3 073 420 bp）相近。因此，本研究所檢測到的黃萎病抗性相關(guān)QTL 準(zhǔn)確可靠。

本研究對黃褐棉導(dǎo)入系BC5S5群體進(jìn)行黃萎病抗性鑒定及相關(guān)QTL 定位，共檢測到15 個(gè)QTL，解釋4.21%～26.77%的表型變異，其中qVW-A01-1、qVW-A02-2和qVW-A07-2能 在2個(gè)及以上環(huán)境中被檢測到；基于BLUP 值檢測到5 個(gè)QTL，解釋6.10%～23.67%的表型變異，其中3 個(gè)是重復(fù)鑒定的QTL；其中qVW-A01-1在前人研究中已有相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定QTL可為棉花抗黃萎病分子標(biāo)記輔助選擇育種等提供參考。

附圖：詳見本刊網(wǎng)站https://journal.cricaas.com.cn

附圖1 不同環(huán)境下BC5S5群體相對病情指數(shù)分布

Fig.S1 The relative disease index distribution of BC5S5population in different environments

附圖2 與棉花黃萎病抗性相關(guān)的QTL

Fig.S2 QTL related to resistance to Verticillium wilt disease in cotton

附圖3 與棉花黃萎病抗性相關(guān)的QTL（BLUP 值）

Fig.S3 QTL related to resistance to Verticillium wilt disease in cotton(BLUP value)