王躍龍，申嘉明，程端端，高曉晨，王恩鵬，陳 雪，張 輝，魏忠寶，孫佳明*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林省科學(xué)技術(shù)信息研究所，長春 130117）

人參 （Panax ginseng C.A.Meyer），五加科人參屬，其功效大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、安神益智、生津等[1]。其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有皂苷、多糖、肽、甾醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮、核苷酸、有機(jī)酸和維生素等[2]。經(jīng)現(xiàn)代研究表明，人參還具有保護(hù)心血管功能、免疫調(diào)節(jié)功能與糖尿病相關(guān)疾病的藥理作用[3]。Li等通過整理綜述發(fā)現(xiàn)，人參的提取部位能夠抵抗或減緩神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，包括β-淀粉樣蛋白形成、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙等，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[4]。

糖尿病，是一種高發(fā)的代謝類疾病，我國大于18歲的人群中2型糖尿病的患者有11.2%，且2型糖尿病患者可以占到糖尿病患者的90%以上[5]。臨床常用胰島素類、促胰島素分泌類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑等藥物進(jìn)行治療[6]。目前現(xiàn)有的 α-葡萄糖苷酶抑制劑類型包括，微生物代謝產(chǎn)物、天然提取產(chǎn)物和化學(xué)合成半合成產(chǎn)物制劑[7]。人參作為一款藥食同源的知名中藥，在中國，從古至今都有明確記載使用人參治療糖尿病的記錄[8]。Sainan等，通過高速逆流色譜法從人參提取物中篩選出6種皂苷作為 α-葡萄糖苷酶的有效抑制劑[9]。孫彬等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)人參低聚肽對糖尿病大鼠具有明顯降低血糖的作用[10]。孔簫亭等，將研究發(fā)現(xiàn)人參粗多肽具有明顯的 α-葡萄糖苷酶抑制作用[11]。

中藥的肽類成分，一直是近年來研究的熱點(diǎn)。在對人參肽的研究中，人參多肽的研究一直備受關(guān)注，而人參小分子肽的相關(guān)報(bào)導(dǎo)很少。以上研究，雖闡釋了人參肽在糖尿病方面的治療作用與機(jī)制，但對人參肽的藥效物質(zhì)研究卻不夠清晰。本研究通過UPLCQE-Orbitrap-MS技術(shù)對人參寡肽的結(jié)構(gòu)做出明確的解析，并通過分子對接技術(shù)對人參寡肽與 α-葡萄糖苷酶抑制劑的結(jié)合能進(jìn)行預(yù)測，判斷具有明顯抑制α-葡萄糖苷酶的人參寡肽。與傳統(tǒng)篩選研究方法相比，液質(zhì)聯(lián)用與分子對接技術(shù)相結(jié)合不僅可以提高篩選的效率，而且為人參寡肽類成分的作用機(jī)制的分析和闡述提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

2022年9月，于吉林省撫松縣購得6年生曬參，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey的根莖。

UltiMate 3000 series高效液相色譜儀、超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；BP211D型十萬分之一電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；KQ3200BE超聲波清洗器，昆山市超聲儀有限公司。

乙醇（分析純，20220309），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸，北京鼎國生物公司；乙腈、甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）；AB-8大孔樹脂填料，廊坊淼陽化工有限公司。

1.2 樣品的制備

取10g人 參 粉 末（40目），按1∶12（g∶mL）液 料 比 加入60%乙醇，回流提取3次，每次1.5小時(shí)，合并提取液，65℃減壓回收乙醇至無醇味，水溶液凍干得凍干粉。稱取0.45g提取物，溶于15mL超純水中，過濾，棄去沉淀保留取上清為樣品溶液，再用AB-8型大孔樹脂純化，50%乙醇溶液洗脫3次，合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，60℃烘干，得人參精制組分樣品。

稱取1mg精制組分樣品，使用50%色譜甲醇溶解，過0.22μm的超濾膜，供UPLC-QE-Orbitrap-MS質(zhì)譜儀分析。

1.3 人參精制組分的液質(zhì)分析

人參精制組分樣品溶液采用UPLC-QE-Orbitrap-MS質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，采用自動進(jìn)樣進(jìn)行檢測。

色譜條件：采用Unitary C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.8μm100A)；流 動 相 為 乙 腈（A）和1‰甲 酸（B），通過二元線性梯度洗脫，流動相梯度：0～20 min（10～50 A），流 速0.5 mL/min；進(jìn) 樣 量10μL；柱 溫30℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源(ESI)，樣品采用正離子模式掃描。噴霧電壓2.5 kV，毛細(xì)管溫度350℃，透鏡電壓50 eV，鞘氣壓力2.76×105Pa，輔助氣壓力6.89×104Pa，輔 助 氣 溫 度300℃，分 辨 率70000，質(zhì) 量 掃描 范 圍m/z 100～1500。

1.4 分子對接

使用ChemDraw 20.0繪制人參中寡肽類成分的mol 2D結(jié)構(gòu)的分子式，通過Chem 3D軟件能量最小化，轉(zhuǎn)換為柔性結(jié)構(gòu)的pdb格式，使用MGLTools1.5.7軟件確認(rèn)可旋轉(zhuǎn)的鍵并保存為pdbqt格式，以備后續(xù)對接使用。

通 過RSCB PDB數(shù) 據(jù) 庫（http://www.rcsb.org/）下載 α-葡萄糖苷酶（2QMJ）的pdb格式文件，經(jīng)Pymol對其進(jìn)行去水、加氫等操作，使用Autodock保存為pdbqt格式。通過查詢文獻(xiàn)[12]確定 α-葡萄糖苷酶的結(jié)合 位 點(diǎn) 坐 標(biāo) （2QMJ，-21.56，-6.936，-1.971）及 尺 寸（26×26×26），并 按 照 相 關(guān) 格 式 保 存 為txt格 式，寡 肽 所有可旋轉(zhuǎn)鍵均設(shè)為柔性，α-葡萄糖苷酶設(shè)置為鋼性，搜尋精度exhaustiveness設(shè)為64，格點(diǎn)間距 ，其他參數(shù)默認(rèn)，運(yùn)行Autodock Vina，采用拉馬克遺傳算法對接運(yùn)算100次。將結(jié)果用Ligplus和Pymol程序?qū)訕?gòu)象進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參精制組分的液質(zhì)分析

人參精制組分樣品，經(jīng)UPLC-QE-Orbitrap-MS質(zhì)譜儀分析，得到正離子模式下的總離子流圖（圖1）。結(jié)合各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析、與文獻(xiàn)對比[13-16]，得到了3個寡肽成分，結(jié)果見表1。研究結(jié)果表明從人參精制組分指認(rèn)出3個寡肽類化學(xué)成分，分別為谷氨酸-酪氨酸（Gly-Tyr），甘氨酸-組 氨 酸（Gly-His），纈 氨 酸-亮 氨 酸（Gly-His）。

圖1 人參中寡肽化合物的正離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of oligopeptide compounds in ginseng under positive ion mode

表1 人參寡肽的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果Table 1 Results of UPLC-QE-Orbitrap-MS for the Analysis of Oligopeptides from ginseng

2.2 分子對接結(jié)果

將UPLC-QE-Orbitrap-MS質(zhì)譜儀指認(rèn)的3個寡肽類成分與 α-葡萄糖苷酶（2QMJ）通過Vina軟件進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示，所有的寡肽類成分均可以與α-葡萄糖苷酶（2QMJ）自發(fā)結(jié)合，說明3個寡肽類成分對 α-葡萄糖苷酶具有較好的潛在抑制活性，具體對接結(jié)果見表2。將與α-葡萄糖苷酶與3個寡肽類成分的對接構(gòu)象通過Pymol和Ligplus程序進(jìn)行可視化分析，詳見圖2。

圖2 甘氨酸-酪氨酸（Gly-Tyr），甘氨酸-組氨酸（Gly-His）和纈氨酸-亮氨酸（Val-Leu）與α-葡萄糖苷酶的3D分子對接模式Fig.2 3D molecular docking modes of Glycine-Tyrosine,Glycine-Histidine and Valine-Leucine(Gly-Tyr,Gly-His and Val-Leu)withα-glucosidase

表2 3個寡肽與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合情況Table 2 Binding of three oligopeptides toα-glucosidase

依據(jù)分子對接的結(jié)果，配體與受體的結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，一般結(jié)合能小于-4.25 kcal/mol說明結(jié)合能力及格，結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol說明結(jié)合能力良好，結(jié)合能小于-7.0 kcal/mol說明具有優(yōu)秀的結(jié)合能力[17]。人參中的3個寡肽與 α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能均小于-4.25 kcal/mol，可見寡肽能夠與α-葡萄糖苷酶自發(fā)結(jié)合。并且，Gly-Tyr、Gly-His與 α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol，說明Gly-Tyr、Gly-His具有良好的 α-葡萄糖苷酶潛在抑制活性。

將其分子對接的結(jié)果可視化，可以發(fā)現(xiàn)，Gly-Tyr分別與 α-葡萄糖苷酶活性中心的ASP-203、ASP-327、ARG-526通過3個氫鍵相互作用，Gly-His分別與 α-葡萄糖苷酶活性中心的ASP-327、ARG-526通過3個氫鍵相互作用。且這兩個人參寡肽都與α-葡萄糖苷酶活性中心的ASP-327、ARG-526氨基酸殘基產(chǎn)生氫鍵，整體上Gly-Tyr鍵長略低于Gly-His，故而Gly-Tyr的結(jié)合能略優(yōu)于Gly-His。雖然Val-Leu與 α-葡萄糖苷酶活性中心的ASP-203、ARG-526、ASP-542產(chǎn)生4個氫鍵進(jìn)行連接，但此外范得華力和靜電相互作用等非鍵相互作用在酶活性中心與小分子配體形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象中也起了非常重要的作用，這可能是Val-Leu的結(jié)合能高于另外兩個人參寡肽的原因之一[12]。

3 結(jié)論

本研究通過對人參的寡肽成分進(jìn)行了UPLCQE-Orbitrap-MS質(zhì)譜儀分析，共鑒定了3個人參寡肽成分的結(jié)構(gòu)，且均能與 α-葡萄糖苷酶自發(fā)結(jié)合，說明其具有潛在的 α-葡萄糖苷酶抑制活性。說明具有潛在的抑制 α-葡萄糖苷酶活性。通過可視化分析發(fā)現(xiàn)3個人參寡肽與 α-葡萄糖苷酶的活性對接位點(diǎn)ASP-203、ASP-327、ARG-526、ASP-542氨 基 酸 殘 基發(fā)生相互作用，主要通過形成以氫鍵為主的分子間相互作用力，表現(xiàn)出較好的結(jié)合能力，為人參寡肽類成分能夠通過抑制α-葡萄糖苷酶減少糖吸收而治療糖尿病提供了理論依據(jù)。