鮑慧瑋，孟凡娟，王月潔，唐 錄，曾 萍，徐 陽

（1.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117；2.吉林省婦幼保健院吉林省產(chǎn)科質量控制中心，長春 130117；3.白城醫(yī)學高等?？茖W校藥學院，白城 137000）

慢性咳嗽是肺系疾病的常見癥候，咳嗽時間持續(xù)8周或以上，胸部影像學檢查無明顯異常者被稱為慢性咳嗽。隨著時代發(fā)展，各種類型的咳嗽發(fā)病率逐年增高，以慢性咳嗽為主要癥狀內(nèi)科就診患者數(shù)量越來越多[1]。大約有75%至90%的慢性咳嗽患者可明確病因[2]。目前，西醫(yī)多用抗組胺、抗反流、糖皮質激素、制酸劑、抗生素、鎮(zhèn)咳祛痰等藥物治療，雖具有一定療效，但毒副作用明顯，且易反復，中醫(yī)在慢性咳嗽的治療中堅持標本兼治[3]，逐漸成為治療慢性咳嗽的重要方向。

林 蛙 油（Ranae Oviductus）又 稱 蛤 蟆 油、哈 蟆 油、雪蛤油，學名是東北林蛙油[4]，是我國傳統(tǒng)藥物中滿藥的代表藥物之一，收載于2020年版《中華人民共和國藥典》，為蛙科動物中國林蛙Rana temporaia chensinensis雌蛙的干燥輸卵管[5]，具有補腎益精，養(yǎng)陰潤肺的功效。目前已鑒定的林蛙油中的氨基酸種類有18種，分別為天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸[6]。多糖類成分也是林蛙油的主要成分之一，鄭衛(wèi)星[7]等通過SPSS軟件設計正交試驗，確定林蛙油多糖最佳工藝參數(shù)，最終多糖得率達到10.4%并提出林蛙油具有顯著抗疲勞活性。同時林蛙油中也存在種類眾多的類固醇類物質以及維生素?，F(xiàn)代醫(yī)學臨床上林蛙油被用于鎮(zhèn)咳、祛痰、抗疲勞、增強機體免疫力。提高機體耐力及抗應激能力。鎮(zhèn)靜、抗焦慮增強性功能、降血脂、增強機體抗氧化能力、延緩衰老、抗癌輔助治療、增加白細胞數(shù)量、調節(jié)體內(nèi)激素平衡、滋陰養(yǎng)顏、美白皮膚等領域。

目前國內(nèi)已經(jīng)有越來越多的林蛙油成分及其藥理作用的實驗研究，但是尚沒有對于林蛙油治療慢性咳嗽作用的機制的系統(tǒng)性研究。在以前的藥物研發(fā)模式中，主要遵循“一個藥物、一個基因、一種疾病”的模式，這正是相當多新藥在臨床實驗階段失敗的主要原因，基于網(wǎng)絡藥理學形成藥物分子設計新模式起源于20世紀90年代，是目前發(fā)展創(chuàng)新藥物的重要途徑[8,9]，網(wǎng)絡藥理學主要方法是研究藥物-活性成分-通路-靶點之間的相互作用，其整體性、系統(tǒng)性以及數(shù)據(jù)化的特點與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治原則一致，目前已被廣泛應用于中藥藥理作用及藥物對疾病作用機制的研究。本篇文章將利用網(wǎng)絡藥理學的研究方法探究林蛙油鎮(zhèn)咳的作用機制，通過數(shù)據(jù)尋找林蛙油鎮(zhèn)咳的關鍵活性成分、通路以及靶點，為林蛙油鎮(zhèn)咳作用的研究提供數(shù)據(jù)參考以及思路。

1 材料與方法

1.1 林蛙油活性成分的篩選

利用中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)以哈蟆油、蛤蟆油、林蛙油、中國林蛙油為關鍵詞進行檢索，匯集文獻中已經(jīng)證明存在的林蛙油活性成分。

1.2 林蛙油活性成分作用靶點的預測和篩選

通過化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com/)查找林蛙油活性成分的CAS號。利用pubchem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以各個成分CAS號為關鍵詞進行檢索，下載SDF格式的各種化合物的化學結構圖。利用Swiss網(wǎng)站(http://www.swissadme.ch/)中SwissADME功能項下導入SDF文件進行結構分析，篩選符合要求的成分進行SwissTargetPrediction分析，篩選出Probability值大于0的條目為林蛙油藥物靶點。

1.3 林蛙油治療慢性咳嗽靶點的預測和篩選

以“Chronic cough”為關鍵詞，分別于Genecards（https://www.genecards.org/）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）（https://omim.org/）[10]兩 個 數(shù) 據(jù) 庫中進行檢索下載并匯總為慢性咳嗽的疾病靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡PPI的構建

將得到的藥物靶點與慢性咳嗽疾病靶點進行對比，得到藥物-疾病重復靶點，將這些靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進行蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析(PPI)。將分析結果導出為TSV格式文件，將文件導入Cytoscape 3.7.0數(shù)據(jù)可視化軟件制作蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖(PPI網(wǎng)絡圖)。

1.5 藥物-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖的構建

將林蛙油活性成分、藥物靶點利用excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理，制作出network以及對應的type文件，將兩個文件導入數(shù)據(jù)可視化軟件Cytoscape 3.7.0，利用軟件Network-Analyzer功能對所有有效化合物進行Degree值排序并根據(jù)Degree值排序將各個靶點以及活性成分圖標面積由大到小進行排列，這樣可以在網(wǎng)絡圖中通過成分圖標大小判斷其重要性，面積越大則表示該成分越重要。

1.6 KEGG和GO富集分析

將林蛙油靶點導入基因富集分析網(wǎng)站Metascape（metascape.org）并分析，選擇智人數(shù)據(jù)庫(H.sapiens)分別進行GO分子功能（GO Molecular Functions）、GO生 物 過 程（GO Biological Processes）、GO細 胞 組 分（GO Cellular Components）以及KEGG通路富集分析。下載四種分析的結果數(shù)據(jù)并進行整理，將整理后的GO分析結果數(shù)據(jù)導入微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站（www.bioinformatics.com.cn/）制作GO三合一柱狀圖、GO三合一氣泡圖。將KEGG通路富集分析結果與林蛙油藥物靶點進行匯總整理。利用中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)查找鎮(zhèn)咳的關鍵通路，并與KEGG通路富集分析結果進行比對，篩選出林蛙油藥物通路中的關鍵通路，利用Cytoscape 3.7.0軟件制作通路-靶點網(wǎng)絡圖。并通過所得的數(shù)據(jù)圖對林蛙油鎮(zhèn)咳作用機制進行探討。

1.7 “藥物-有效成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建

將林蛙油活性成分、潛在靶點與疾病通路富集分析結果進行映射，導入Cytoscape軟件，構建“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 林蛙油有效成分篩選

通過查詢中國知網(wǎng)對林蛙油所有化學成分進行查詢，篩選出符合Swiss網(wǎng)站結構分析中胃腸道吸收度(GI absorption)高且符合至少三項藥性參數(shù)成分的為林蛙油活性成分，如表1所示。

表1 林蛙油活性成分

2.2 林蛙油活性成分作用靶點的預測和篩選

將2.1中得到的林蛙油活性成分通過化源網(wǎng)查找CAS號（詳見表1），通過查找篩選，以Probability值大于0的條目為標準，得到林蛙油藥物靶點508個，去掉重復值后得到274個靶點。將林蛙油活性成分和靶點通過Excel表進行整合，并導入Cytoscape軟件中構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，詳見圖1。

圖1 林蛙油活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 慢性咳嗽疾病靶點的收集

在Gene Cards和OMIM數(shù)據(jù)庫中，以“chronic cough”為關鍵詞檢索得出與慢性咳嗽相關的靶點，其中Genecards中獲得4063條疾病靶點，取其中評分大于2.1的靶點共2483條，OMIM數(shù)據(jù)庫共獲得靶點98條，去重后共得到疾病靶點2549條。

2.4 PPI網(wǎng)絡及核心靶點篩選與分析

將林蛙油與慢性咳嗽疾病得到的145個有效靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，得到靶點相互作用PPI網(wǎng)絡圖，詳見圖2，PPI網(wǎng)絡中顯示的節(jié)點越大及顏色越深則其度值就越大，表明該靶點關聯(lián)性好且為關鍵靶點，如AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、白細胞介素6(IL6)、表皮生長因子受體(EGFR)等靶點，將其Degree值前10的靶點進行整理，詳見表2。

表2 關鍵靶點拓撲學參數(shù)表

圖2 PPI網(wǎng)絡圖

2.5 藥物-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖的構建

將林蛙油活性成分、藥物與疾病交集靶點利用excel2016軟件進行數(shù)據(jù)整理，制作出network以及對應的type文件，將兩個文件導入數(shù)據(jù)可視化軟件Cytoscape 3.7.0，首先利用軟件Network-Analyzer功能對所有有效化合物進行Degree值排序，將林蛙油活性成分設置為紅色，靶點設置為藍色，每一個成分與之相連的靶點越多，說明該成分Degree值越高，則該成分越重要[11]，同理，也可以通過成分與靶點連線的多少判斷該靶點的重要程度。Degree值最高的前10個靶點分別為絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、前列腺素過氧化物合酶2(PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、Raf-1原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶(RAF1)、白細胞介素6(IL6)、γ-氨基丁酸B型受體亞基1(GABBR1)、BCL2細 胞 凋 亡 調 節(jié) 劑(BCL2)、細 胞 分 裂周期25A(CDC25A)。詳見圖3。

圖3 藥物-活性成分-藥物與疾病交集靶點圖

2.6 GO和KEGG富集分析

將林蛙油靶點導入基因富集分析網(wǎng)站Metascape并分析，選擇智人數(shù)據(jù)庫(H.sapiens)分別進行GO分子功能、GO生物過程、GO細胞組分以及KEGG通路富集分析。

其中GO分子功能分析（GO Molecular Functions）共等得到分子功能162條，GO生物過程分析(GO Biological Processes)中共獲得1314條數(shù)，GO細胞組分分析（GO Cellular Components）中共獲得92條數(shù)據(jù)，篩選各項分析中%InGO值排名前10的條目。利用微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站制作得到GO分析柱狀圖，如圖4所示。

圖4 GO分析柱狀圖

KEGG通路富集分析得到173條通路。利用中國知網(wǎng)查找鎮(zhèn)咳信號通路后與林蛙油通路進行比對，篩選出10條關鍵通路，利用微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站制作得到KEGG富集分析氣泡圖，如圖5所示。

將KEGG通路及其對應靶點蛋白導入Cytoscape 3.7.0軟件，為將通路設置為黃色，藥物靶點設置為藍色，制作出KEGG通路-靶點圖。與通路相關的靶點數(shù)量越多，則證明該通路Degree值越高，該通路越重要，詳見圖6。

圖6 KEGG通路-靶點圖

2.7 “藥物有效成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建

將藥物、活性成分、通路、靶點整合為network以及type文件，導入Cytoscape 3.7.0軟件，在通過Degree值進行排序，紅色部分為藥物活性成分，藍色部分為慢性咳嗽與藥物交集靶點，黃色部分為藥物信號通路，每一個成分或信號通路與之相關的靶點越多，說明該成分Degree值越高，則該成分或信號通路越重要，同理，也可以通過成分與靶點連線的多少判斷該靶點的重要程度，詳見圖7。

圖7 藥物有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖

3 討論

近年來隨著時代的發(fā)展，慢性咳嗽疾病的患者數(shù)量龐大，隨著中醫(yī)對咳嗽的認識不斷深入，有必要對慢性咳嗽的中醫(yī)診療以及治療機制等進行更新[13]。本篇文章利用網(wǎng)絡藥理學方法探究林蛙油治療慢性咳嗽的作用機制并對林蛙油的治療作用靶點進行數(shù)據(jù)上的預測。通過構建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖分析得到Degree值顯著高于其他活性成分的成分有9-十六碳烯 酸(Palmitoleic acid)、十 六 碳 二 烯 酸(9，12-hexadecadienoic acid)、十 三 烷 酸 甲 酯(Methyl tridecanoate)、十 一烯酸(10-Undecenoic acid)，根據(jù)Degree值排序，這四種化合物有可能為林蛙油治療慢性咳嗽的關鍵成分。

通過藥物-活性成分-通路-靶點網(wǎng)絡圖的構建，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激 酶1(MAPK1)、AKT絲 氨 酸/蘇 氨 酸 激 酶1(AKT1)、前列腺素過氧化物合酶2(PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、Raf-1原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶(RAF1)、白細胞介素6(IL6)、γ-氨基丁酸B型受體亞基1(GABBR1)、BCL2細 胞 凋 亡 調 節(jié) 劑(BCL2)、細 胞 分 裂周期25A(CDC25A)關聯(lián)度較高。其中MAPK3與MAPK1，兩者均屬于MAPK激酶[14]。MAPK激酶于80年代末首次發(fā)現(xiàn)，參與細胞增殖、分化和轉錄調控等多種過程[15]。Zhou等人指出，MAPK1和MAPK3途徑的活化會導致支氣管上皮細胞炎癥反應的發(fā)生。AKT通路是細胞活動最基本的信號傳導途，AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[16-17]，是PI3K/Akt作用于信號通路下游的主要作用靶點，是信號網(wǎng)絡的中樞環(huán)節(jié)，對細胞增殖、分化及多種生物學過程起到關鍵的調節(jié)作用，可以參與調節(jié)炎癥反應，可對于肺部等部位炎癥引起的急性或慢性咳嗽起到一定的緩解以及治療作用。IL-6靶點主要由單核-巨噬細胞在外來刺激（如細菌以及病毒感染等）作用下產(chǎn)生的炎癥細胞因子，這兩種細胞因子的水平變化可以反映體內(nèi)單核-巨噬細胞的激活狀態(tài)在感染性疾病的發(fā)病中具有重要作用[18-20]，同理IL-6靶點也有可能對炎癥引起的慢性咳嗽有鎮(zhèn)咳及治療炎癥類疾病的作用。前列腺素過氧化物合酶2(PTGS2)可以通過調控VEGF和MAPK信號通路，參與調控血管形態(tài)及血管發(fā)生發(fā)育，從而加快受損傷肺部組織的恢復，促進受傷的肺血管再生，從而可能起到養(yǎng)肺、治療或緩解慢性咳嗽等功效。

通過GO富集分析以及KEGG通路富集分析，林蛙油鎮(zhèn)咳作用涉及到通路16關鍵通路，其中PI3KAkt信號通路是細胞內(nèi)信號轉導的重要途徑，能調控細胞的生長、遷移、增殖和代謝過程。PI3K-Akt信號通路活化后會調節(jié)下游包括NF-kB、Caspase9在內(nèi)的多種因子磷酸化，進而發(fā)揮多種不同的作用。有文獻顯示，PI3K-Akt信號通路可以參與下呼吸道上皮細胞修復、減少氣道重以及維持T細胞的穩(wěn)定和功能等多個過程，所以PI3K-Akt信號通路可能通過肺部細胞修復緩解肺部損傷引起的慢性咳嗽。此外TNF是免疫系統(tǒng)的重要因子。AGE-RAGE信號通路是糖尿病疾病發(fā)展進程中重要的信號通路。AGE-RAGE信號通路可調節(jié)NF-kB的活性。有文獻提出，NF-kB可調節(jié)呼吸道的粘液分泌，且NF-kB表達水平與氣道變應性炎癥程度成正相關。所以AGE-RAGE信號通路也可起到鎮(zhèn)咳、抗炎等作用。

綜上所述本文利用網(wǎng)絡藥理學方法探對林蛙油止咳作用機制進行了探究，最終得到9-十六碳烯酸(Palmitoleic acid)、十 六 碳 二 烯 酸(9，12-hexadecadienoic acid)、十三烷酸甲酯(Methyl tridecanoate)、十一烯酸(10-Undecenoic acid)四種成分可能是林蛙油止咳的關鍵 活 性 成 分。MAPK3、MAPK1、AKT1、IL-6、PTGS2等蛋白質可能為林蛙油止咳的關鍵靶點蛋白。PI3K-Akt、TNF、AGE-RAGE三條通路可能為林蛙油鎮(zhèn)咳作用的關鍵通路。以上數(shù)據(jù)表明，中藥林蛙油中有多種活性成分、靶點蛋白，作用于多種信號通路從而起到治療或緩解慢性咳嗽的作用，本篇文章利用網(wǎng)絡藥理學方法探究林蛙油治療慢性咳嗽作用機制的預測結果可為后續(xù)關于林蛙油治療或緩解慢性咳嗽的相關實驗研究提供方向、理論依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。