李軍鴿，邱智東，趙 瑩，王永春，孟珈同，唐秋竹

（長春中醫(yī)藥大學·吉林 長春·130117）

黃連解毒顆粒來自于經(jīng)典名方《外臺秘要》黃連解毒湯原方，主治清熱瀉火[1-3]。黃連解毒顆粒是由傳統(tǒng)黃連解毒湯處方比例按現(xiàn)代提取工藝配制而成的顆粒劑。黃連解毒湯為清熱解毒的經(jīng)典方劑，由黃連、黃柏、黃芩、梔子四味藥組成，其臨床療效顯著[4-5]，被廣大醫(yī)者應(yīng)用至今。為解決湯劑存儲、服用和攜帶不便的特點，從遵古和傳承角度出發(fā)，課題組前期已對黃連解毒湯的物質(zhì)基準和黃連解毒顆粒制備工藝進行研究，由于方中黃連為君藥，黃芩為臣藥，鹽酸小檗堿為黃連的主要生物堿成分，黃芩苷為黃芩的主要代表成分，故本研究通過測定黃連解毒顆粒中鹽酸小檗堿和黃芩苷化學成分含量研究，以期為黃連解毒顆粒的質(zhì)量標準制定提供參考。

1 材料與儀器

高效液相色譜儀（紫外檢測器，島津LC2030）；電子天平（萬分之一，梅特勒ME204E）；超聲波清洗機（昆山KQ-600B）；鹽酸小檗堿對照品 （純度85.9%，111638-201907），黃 芩 苷 對 照 品（純 度93.3%，110715-201318）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（Fisher，色譜純）；水為超純水；其它試劑均為分析純。黃連、黃芩、黃柏和梔子飲片各3批，均購于吉林省北藥藥材加工有限公司，由長春中醫(yī)藥大學翁麗麗教授鑒定。藥材飲片和黃連解毒顆粒信息表見表1。

表1 藥材飲片和黃連解毒顆粒信息表

2 方法

2.1 黃連解毒顆粒制備

按處方比例取黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥材，第一次加12倍量水，浸泡1小時，第二次加10倍量水，煎煮兩次，每次1.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮 至 相 對 密 度1.03～1.10（75℃）稠 膏，干 燥，粉 碎 成 細粉，加糊精和75%乙醇適量，制成顆粒，60℃干燥，整粒，即 得[6-7]。共 制 備 三 批 樣 品20220101、20220102、20220103。

2.2 含量測定

2.2.1色譜條件

Pepax C18（250mm×4.6mm，5μm）色 譜 柱，流 動 相乙 腈-0.1%磷 酸（27∶73），檢 測 波 長354nm，柱 溫30℃，流速1.0mL/min，對照品和供試品進樣量均為5μL。

2.2.2對照品溶液制備

分別取鹽酸小檗堿和黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1mL含0.1mg的混合對照品溶液，備用。

2.2.3供試品溶液制備

取黃連解毒顆粒，研細，精密稱定1.0g，精密加1%鹽酸甲醇溶液50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘（250W，50HZ），放冷，甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取對照品溶液、供試品溶液和糊精陰性樣品溶液，按“2.2.1”色譜條件進行測定，記錄色譜圖，如圖1、圖2、圖3，對照品色譜圖與供試品色譜圖相同保留時間處都有相應(yīng)色譜峰，分離度符合要求，峰型較好，陰性樣品溶液無干擾，該方法專屬性好。

圖1 對照品色譜（1鹽酸小檗堿，2黃芩苷）

圖2 供試品品色譜（1鹽酸小檗堿，2黃芩苷）

圖3 陰性色譜圖

3.2 線性

取12.29 mg鹽酸小檗堿對照品加甲醇定容于50mL量瓶中，分別再加甲醇稀釋成0.0132、0.0264、0.0352、0.0528、0.1056、0.2112mg/mL濃 度 的 對 照 品 溶液，取10.56mg黃芩苷對照品加甲醇定容于50mL量瓶中，分別再加甲醇稀釋成0.0164、0.0328、0.065、0.0985、0.1313mg/mL濃度對照品溶液，精密吸取不同濃度鹽酸小檗堿和黃芩苷對照品溶液各5μL，按“2.2.1”依 法 測 定，以 進 樣 量（μg）為 橫 坐 標，峰 面 積 值為縱坐標，進行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表2。

表2 線性結(jié)果

3.3 精密度

取 黃 連 解 毒 顆 粒 樣 品（20220101）按“2.2.3”方 法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件依法測定，連續(xù)測定6次，進樣量5μL，記錄色譜峰面積值，計算RSD%，結(jié)果鹽酸小檗堿RSD為1.21%，黃芩苷RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性

取黃連解毒顆粒樣品 （20220101），精密稱定1.0g，按“2.2.3”方 法 制 備 供 試 品 溶 液，按“2.2.1”色 譜條 件 依 法 測 定，進 樣 量 為5μL，分 別 于0、2、4、8、12、24 h進行測定，紀錄峰面積，結(jié)果鹽酸小檗堿和黃芩苷的RSD分別為1.05 %、1.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi) 穩(wěn) 定[8-10]。

3.5 重復(fù)性

取 黃 連 解 毒 顆 粒 樣 品（20220101）6份，按“2.2.3”方法，平行制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件依法測定，經(jīng)計算，鹽酸小檗堿含量34.88 mg/g，RSD為1.23 %；黃芩苷含量6.72 mg/g，RSD為1.17 %，表明該 方 法 重現(xiàn) 性 良好[11-13]。

3.6 加樣回收率

為考察擬定方法測定結(jié)果與真實值接近的程度，對擬定方法進行準確度試驗。取黃連解毒顆粒樣品（20220101，鹽酸小檗堿34.88mg/g，黃芩苷含量6.72 mg/g）6份，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品約23mg（純度85.9%），黃芩苷對照品3mg（純度93.3%），按擬定方法測定，結(jié)果鹽酸小檗堿回收率平均值為98.53%，RSD為1.48 %，黃芩苷回收率平均值為99.24%，RSD為1.65%，結(jié)果見表3，表明該方法準確度良好。

表3 鹽酸小檗堿和黃芩苷加樣回收率結(jié)果

3.7 三批樣品含量測定

取黃連解毒顆粒三批樣品（20220101、20220102、20220103），分 別 按“2.2.3”方 法 制 備 供 試 品 溶 液，按“2.2.1”色譜條件依法測定，計算各批鹽酸小檗堿和黃芩苷含量，結(jié)果見表4。

表4 黃連解毒顆粒三批樣品含量測定結(jié)果

4 討論

黃連解毒顆粒是從遵古與傳承思想角度開發(fā)的經(jīng)典名方制劑，為了后期的質(zhì)量控制，篩選一種或幾種含量指標進行監(jiān)測制劑質(zhì)量有利于新藥開發(fā)的整體性研究。黃連解毒顆粒由黃連、黃芩、黃柏和梔子四味藥組成，指標成分應(yīng)首選君藥黃連和臣藥黃芩中的成分，參考2020版《中國藥典》一部黃連和黃芩項下的含量測定項，選擇鹽酸小檗堿和黃芩苷為黃連解毒顆粒主要指標成分。

黃連解毒顆粒為水煎提取得到的干膏加輔料制成的顆粒劑，含量測定在成分提取方法中對比了加熱回流和超聲的方法，對于鹽酸小檗堿超聲和回流提取方法含量相差不多，為了實驗操作簡便可選超聲提取，對于黃芩苷超聲提取比回流提取含量低約10%，由于黃連解毒顆粒中黃芩苷含量較鹽酸小檗堿含量低，且黃芩苷為臣藥有效代表成分，是次要有效成分，綜合考慮，提取方法選擇超聲法。且通過單因素試驗對提取時間和提取溶劑量進行篩選，最終確定超聲提取時間為30分鐘，提取溶劑量為50mL。

對于制劑多種成分含量測定，流動相的選擇尤為重要，本研究參考《中國藥典》2020版和相關(guān)文獻[14-16]對流動相組成和比例進行考察篩選，黃芩苷流動相選擇較寬泛，容易得到較好的峰型，鹽酸小檗堿峰型較差易拖尾，且分離度不易達到要求，故考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀，乙腈-磷酸水及不同比例的流動相，最終以乙腈-0.1%磷酸水（27∶73）為 流 動 相，得 到 的 峰 型 較 好，分 離 度＞1.5，同 時對柱溫與流速等色譜條件進行了考察。本研究所建方法方便快速、準確、專屬性強[17-20]，適合用于黃連解毒顆粒中鹽酸小檗堿和黃芩苷含量測定，為黃連解毒顆粒質(zhì)量控制研究提供參考。