胡夢璇 宋學勤 劉穎麗 趙樹堂

摘要：[目的]探究bHLH亞家族成員MYC基因在楊樹生長發(fā)育及對環(huán)境響應中的表達模式，為解析菜莉酸信號通路關(guān)鍵基因MYC調(diào)控楊樹生長發(fā)育及抗逆響應提供參考。[方法]利用生物信息學方法鑒定楊樹基因組中的MYC基因家旗成員并對各成員的基因結(jié)構(gòu)、保守基序進行了系統(tǒng)分析；在此基礎(chǔ)上，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了MYC成員在不同組織、不同植物激素響應及逆境脅迫下的表達模式。[結(jié)果]毛果楊基因組中含有10個MYC成員，這些成員在進化上相對保守，均具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，根據(jù)進化關(guān)系將其分為3個分支。組織表達分析發(fā)現(xiàn)，大部分MYC家族成員在根中均具有較高表達量，分枝Ⅱ兩對基因在莖中呈相反表達模式。不同激素處理及非生物脅迫條件下MYC基因存在顯著表達差異，但基因?qū)χg多存在類似的表達模式。[結(jié)論]楊樹MYC基因家族成員可能參與不同的生物學過程，研究結(jié)果為深人解析楊樹MYC基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：毛果楊；MYC基因；表達分析

中圖分類號：S718.46 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）03-0032-09

植物激素茉莉酸（JA）是脂肪酸衍生的羥脂素，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應等過程中發(fā)揮重要作用。JA通過其信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控與多種激素互作或調(diào)控下游響應基因參與多種生物學過程。JA信號途徑是一個由多基因參與的復雜調(diào)控過程。Coronatine insensitivel（COI1）是JA信號的受體，與JA結(jié)合后促進轉(zhuǎn)錄抑制因子jasmonate ZIM-domain（JAZ）家族蛋白泛素化并被26S蛋白酶體降解，從而解除JAZ對轉(zhuǎn)錄因子髓細胞組織增生蛋白（Myelocytomatosis proteins，MYCs）MYC2的抑制作用，最終激活下游響應基因的表達。植物中MYC是JA信號途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過形成COI/JAZs/MYC復合物發(fā)揮調(diào)控作用，參與多種激素信號轉(zhuǎn)導過程。

MYC轉(zhuǎn)錄因子含有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族。bHLH結(jié)構(gòu)域由堿性域與HLH域組成，N端堿性域具有DNA結(jié)合功能，C端HLH域參與bHLH蛋白二聚化形成同源或異源二聚復合體。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄因子中的超級家族，在擬南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）中共有158個家族成員，分為26個亞家族，其中，MYC轉(zhuǎn)錄因子分布于亞家族III，包含8個成員。已有研究證明，MYC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、次生代謝物的合成、逆境響應、植物激素信號轉(zhuǎn)導及不同激素信號通路之間的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MYC2是MYC類轉(zhuǎn)錄因子中研究最透徹的一個，在JA信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。在擬南芥根系發(fā)育過程中，MYC2可以直接結(jié)合到維持根尖細胞活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PLT1和PLT2的啟動子上抑制其表達，進而抑制擬南芥主根分生區(qū)細胞分裂。在藍光誘導下，擬南芥MYC2/MYC4可以結(jié)合NST1啟動子激活其表達，進而調(diào)控次生壁合成，促進花序軸纖維細胞次生壁加厚。改變紅光與遠紅光比例，光敏色素互作因子PIF4能夠與MYC2/MYC4直接相互作用影響MYC蛋白核定位，抑制MYC2/MYC4對NST1的激活進而影響細胞次生壁加厚。在花發(fā)育過程中，myc2/3/4三突變體及myc213、myc2/4雙突變體表現(xiàn)出早開花表型，同時伴有花萼發(fā)育延遲、花藥不能正常開裂或開裂延遲以及花粉粒存活率低等表型。此外，MYC2參與多種植物激素間的調(diào)控，包括生長素、細胞分裂素、乙烯等。MYC2可以與乙烯不敏感轉(zhuǎn)錄因子EIN3相互作用，抑制EIN3的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制H/S1的表達，最終影響擬南芥黃化苗頂端彎鉤的形成。在果實成熟方面，MYC2轉(zhuǎn)錄因子能通過結(jié)合蘋果乙烯合成途徑中的ACC合成酶基因和ACC氧化酶基因啟動子調(diào)控乙烯合成進而影響果實成熟。最近研究表明，MYC2可以通過抑制細胞分裂素氧化酶/脫氫酶（CKX）基因來提高細胞分裂素含量，從而抑制不定根的起始。綜上所述，MYC類轉(zhuǎn)錄因子對植物生長發(fā)育及生物和非生物脅迫響應具有重要調(diào)控作用。

盡管MYC基因家族已在擬南芥、水稻（Oryza sativa L.）等模式植物中研究得比較深入，但在林木中其功能研究還鮮有報道。楊樹（Populus L.）是重要的人工林樹種，而且具有基因組小、適應性強、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟等特性，已成為林木分子育種研究的模式樹種。因此，本文系統(tǒng)分析了楊樹MYC家族成員基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、組織表達特性及不同激素和脅迫響應模式，研究結(jié)果為進一步解析楊樹MYC基因的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1楊樹MYC家族成員鑒定與分析

在擬南芥基因組網(wǎng)站TAIR（TAIR-Home Page（arabidopsis.org））數(shù)據(jù)庫中獲取MYC基因家族8個成員的氨基酸序列，并以此為靶序列，在Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome-nextjgi.doe.gov/）中通過BLASTP方法比對檢索毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫V4.1，獲得MYC直系同源氨基酸序列。利用ExPASy（http：//www.expasy.org/）在線工具分析楊樹MYC蛋白基本理化性質(zhì)。使用WoLEPSORT（WoLF PSORT：Protein Subcellular Localization Prediction Tool（genscript.com））在線工具分析楊樹MYC蛋白的亞細胞定位情況。

1.2MYC基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

參考MEGA7.0，利用MEGA11中ClustaIW程序，將毛果楊、擬南芥MYC蛋白序列進行多重序列比對；采用Neighbor-Joining（NJ）法，模型為p-distance，成對刪除，校驗參數(shù)為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。iTOL（https：//itol.embl.de/）在線網(wǎng)站進一步完善進化樹。

1.3基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

楊樹MYC基因結(jié)構(gòu)用GSDS2.0（http：//gsdscbi.pku.edu.cn/）軟件分析。楊樹MYC蛋白結(jié)構(gòu)域使用MEME（MEME-Submission form（meme-suite.org））在線分析，最大motif檢索數(shù)為10，其余為默認參數(shù)。

1.4楊樹MYC基因組織特異性表達分析

實驗所用材料84K楊（Populus alba×P.glandulosa）由林木遺傳育種全國重點實驗室保存。RNA提取使用（RNA Easy Fast Plant Tissue Kit）試劑盒。分別提取溫室培養(yǎng)2個月84K楊的根、莖、葉以及莖的不同部位的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，并以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析（qRT-PCR）。反應體系為TB Green@ Premix EX Taq TMⅡ5 uL，正向引物（10 umol·L-1）0.5 uL，反向引物（10 umol·L-1）0.5uL，cDNA l uL，超純水3 uL；qRT-PCR程序為：95℃ 30 s；95℃ 5s；60℃ 30 s；50℃30s，45個循環(huán)。引物序列見表1。

1.5楊樹MYC基因響應激素和非生物脅迫表達分析

激素處理：選擇生長4周的84K組培苗，分別進行生長素（10 umol·L-1 NAA）、細胞分裂素（10 umoI.L-1 6-BA）和茉莉酸（100 umol.L-1MejA）處理。處理時間為：生長素（0.5、1、2、3、6h）、細胞分裂素（0.5、1、2、3h）、茉莉酸（1、3、6、9、12 h）。每個處理包含3次生物學重復，每次重復包含3株獨立植株，取樣位置為頂端向下第4片葉，以未處理的84K楊作為對照。

非生物脅迫處理：84K楊溫室培養(yǎng)4周后，分別進行4℃、20% PEG6000及200 mmol.L-1 NaCI處理，處理3、6、12、24 h后取頂端第4片葉，每處理重復3次，每重復3株植株混合取樣，以未處理84K楊作為對照。

使用RNA Easy Fast Plant Tissue Kit試劑盒提取處理后楊樹葉片RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。使用Primer Premier 5軟件，在楊樹MYC基因序列的非保守區(qū)設(shè)計qRT-PCR引物（表1），引物序列的Tm值為60-62℃，并由生工生物公司合成。qRT-PCR使用TB Green@Premix EX Taq TMⅡ（TaKaRa Dalian，

China）試劑盒，并根據(jù)Roche480實時熒光定量PCR儀說明書進行操作。反應體系為：TB Green@Premix EX Taq TMⅡ5 uL，上下游引物各0.5UL，cDNA 1 uL，超純水3 uL。qRT-PCR所用內(nèi)參基因為楊樹Actin基因（基因序列號：Potri.001G309500）。每個模板設(shè)置4個重復，所有實驗均進行3次生物學重復，采用2-△△ct方法進行定量數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1毛果楊MYC家族成員鑒定及分析

利用Phytozome網(wǎng)站BLAST工具查找擬南芥MYCs在毛果楊基因組中同源基因，共篩選獲得10個楊樹MYC基因成員（表2），編碼的蛋白質(zhì)序列長度為466～660 aa，蛋白質(zhì)分子量介于52.34-72.09 kDa，等電點為5.38～7.72。亞細胞定位預測結(jié)果顯示：10個MYC蛋白亞細胞定位不同，其中，6個定位在細胞核，2個定位在細胞核和細胞質(zhì)，2個定位在細胞核與葉綠體?；阼b定出的毛果楊PtrMYCs以及擬南芥MYC基因家族編碼的氨基酸序列，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果（圖1）顯示：與擬南芥MYC基因家族類似，毛果楊MYC基因家族分為3個分枝，但不同分枝成員數(shù)量與擬南芥存在較大差異。分枝I包含擬南芥MYC2/3/4/5共4個基因，但楊樹中只有2個同源基因，分別命名為PtrMYC2a和PtrMYC2b；分枝Ⅱ包含擬南芥AtbHLH14及楊樹4個同源基因，分別命名為PtrbHLH14a～14d；分枝Ⅲ包括擬南芥AtbHLH3和AtbHLH17，每個基因在楊樹中均有2個同源基因，命名為PtrbHLH3a、PtrbHLH3b和Ptr：bHLH17a、PtnbHLH11b。

2.2PtrMYC家族基因結(jié)構(gòu)以殛蛋白保守域分析

為了了解PtrMYC基因的結(jié)構(gòu)特征，對其基因結(jié)構(gòu)及保守基序進行分析，發(fā)現(xiàn)楊樹所有MYC基因均不含內(nèi)含子（圖2A）。使用MEME軟件對楊樹MYC蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明：所有MYC蛋白的結(jié)構(gòu)域在進化上是高度保守的，Motif1、2、3、4、5、6、7、8存在于所有家族成員中，其中，Motif1、3、7和2、4、5、6、8為該家族基因保守的特征結(jié)構(gòu)域即bHLH和bHLH-MYC-N。另外，有的家族分枝具有或缺失某些蛋白基序，如Motif9僅存在于分枝Ⅱ的家族成員中，Motif10僅存在于分枝I和Ⅲ的成員中，大多數(shù)同源配對成員有高度相似的結(jié)構(gòu)域組成，提示可能在基因功能上存在冗余（圖2B）。

2.3基因組織表達特異性分析

基因組織特異性表達模式研究對預測基因功能具有重要的作用。為了探討PtrMYC基因家族在楊樹生長發(fā)育中的功能，本研究利用qRT-PCR方法分析了MYC基因各成員在不同器官和組織的表達特異性，結(jié)果（圖3）顯示：不同MYC家族成員具有不同的組織表達特異性，但基因?qū)χg多存在類似的表達模式。除PtrbHLH3a外，其余9個PtrMYC基因在根中均有較高表達量，說明大部分MYC家族成員可能在根系發(fā)育過程中發(fā)揮作用；在從頂端到基部的不同莖段中，PtrbHLH14a和PtrbHLH14b這一組基因?qū)Ρ磉_量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明它們可能在莖由初生生長向次生生長發(fā)育過程中具有重要調(diào)節(jié)作用；PtrbHLH14e和PtrbHLH14d這組基因?qū)Ρ磉_量則呈現(xiàn)下降的趨勢，說明可能在頂端分生組織發(fā)育中具有重要的作用。楊樹MYC家族成員在不同器官和組織存在顯著表達差異，說明不同成員可能在楊樹生長發(fā)育不同生物學過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

2.4MYC家族基因響應生長素、細胞分裂素及茉莉酸的表達模式分析

為進一步了解楊樹MYC家族基因?qū)Σ煌参锛に氐捻憫闆r，本研究利用qRT-PCR方法檢測了其對生長素（NAA）、細胞分裂素（6-BA）、茉莉酸（MejA）響應的表達模式（圖4）。在NAA、6-BA、MejA處理后，楊樹MYC基因家族各成員表達模式各不相同。PtrbHLH14a、PtrbHLH14b基因表達量受生長素誘導0.5 h后開始下調(diào)，表明生長素可以快速抑制特異MYC基因的表達。細胞分裂素處理0.5 h后，PtrbHLH14a、PtrbHLH14b、PtrbHLH14d基因表達量顯著上調(diào)，說明它們可以快速響應細胞分裂素處理。大部分楊樹MYC基因都能響應茉莉酸信號，茉莉酸處理后，PtrMYC2a、PtrMYC2b、PtrbHLH14e、PtrbHLH14d、PtrbHLH17a、PtrbHLH17b基因表達量顯著上調(diào)。值得注意的是，PtrbHLH14a和PtrbHLH14b基因?qū)δ軌蝽憫L素和細胞分裂素處理，但表達模式呈相反趨勢，說明它們可能同時參與生長素與細胞分裂素信號通路。綜上所述，MYC家族成員可能廣泛參與不同激素調(diào)控植物生長發(fā)育的多個過程。

2.5MYC基因響應低溫、干旱和NaCl脅迫的表達模式分析

為揭示楊樹MYC基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應機制，本研究利用qRT-PCR方法檢測了該家族基因在4℃、PEG6000和NaCl脅迫下的表達模式（圖5）。在200 mmol·L-1 NaCl、20% PEG6000及4℃低溫處理后，楊樹MYC基因家族各成員表達都受到不同程度的誘導，且大部分基因表達量在處理后12 h達到高峰。低溫處理可以誘導6個楊樹MYC基因上調(diào)表達，其中PtrbHLH17a、PtrbHLH17b兩個基因受低溫誘導上調(diào)表達最多，且在12 h達到峰值；PtrbHLH14a、PtrbHLH14b下調(diào)表達，說明不同MYC基因響應低溫表達方式不同。在NaCI處理之后，PtrMYC2b、PtrbHLH14b、PtrbHLH3a、PtrbHLH3b、PtrbHLH14a、PtrbHLH14d基因的表達量先上調(diào)再下調(diào)，而PtrMYC2a、PtrbHLH14e、PtrbHLH17b基因則呈現(xiàn)相反表達模式。干旱處理后，PtrbHLH14a、PtrbHLH14b、PtrbHLH14d、PtrbHLH3a基因表達量顯著上調(diào)，其中，PtrbHLH3a表達量在處理后12h時達到高峰，其它3個基因在9h時達到高峰，說明不同MYC基因響應干旱時間不同。另外，同一分支基因響應相同非生物脅迫時具有相似表達模式，說明基因功能存在冗余。綜上所述，MYC家族成員在不同非生物脅迫中表達情況存在差異，推測在植物響應逆境脅迫中發(fā)揮不同作用。

3討論

林木在長期進化過程中形成了自己獨特的生物學特征和環(huán)境適應性，而基因組學和基因功能研究發(fā)現(xiàn)，不同物種同源基因可能在功能上存在較大差異，因此，在模式樹種楊樹中開展基因功能研究對揭示林木特有的生物學過程具有重要意義。MYC基因家族是bHLH基因家族一個亞家族，對植物的生長發(fā)育及環(huán)境適應性具有重要作用。目前，在擬南芥中對MYC2基因進行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)該基因不僅能參與調(diào)控根、葉、種子等器官的發(fā)育活動，并且還以調(diào)控開關(guān)的角色存在于多種激素通路互作過程中。然而，模式樹木毛果楊中，MYC家族基因基本特征及其逆境脅迫響應特性尚無報導。本研究根據(jù)擬南芥MYC基因家族氨基酸序列，在毛果揚基因組中通過序列比對獲得了楊樹MYC基因家族成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、組織表達特異性及對激素和逆境響應表達模式等進行了系統(tǒng)分析。在毛果楊基因組中共鑒定出10個MYC成員，系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因家族分為3個分枝，其中，分枝I包含2個成員，分枝Ⅱ有4個成員，分枝Ⅲ有4個成員，這與擬南芥中各分枝成員數(shù)量相差較大，說明MYC基因家族不同分枝在進化過程中可能存在基因擴張或丟失現(xiàn)象。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，PtrMYC蛋白含有多個基序，10個Motif中有8個Motif存在于所有MYC成員中（圖28），表明PtrMYC成員之間在蛋白結(jié)構(gòu)上高度保守。

基因組織表達特異性對進一步探究其功能具有重要作用。本研究中，楊樹PtrMYC在不同器官和組織存在明顯表達差異，表明它們可能在不同生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，MYC2抑制主根分生區(qū)細胞分裂，同時促進側(cè)根形成。另外，MYC2可以通過調(diào)控細胞分裂素含量抑制不定根起始，說明MYC2轉(zhuǎn)錄因子對根系發(fā)育的調(diào)控是多方面的。組織表達分析表明，PtrMYC家族9個成員在根部表達水平較高，暗示它們可能參與楊樹根系不同發(fā)育過程。在葉片發(fā)育過程中，MYC2能通過抑制生長素合成進而抑制葉脈發(fā)育。Qi等研究表明，MYC2/MYC3MYC4在激活葉片衰老相關(guān)基因SAG29誘導葉片衰老中存在功能冗余，而bHLH03、bHLH13、bHLH14和bHLHI7與SAG29的啟動子結(jié)合抑制其表達，拮抗MYC2/MYC3/MYC4誘導的葉片衰老。另外，MYC2-Dof2形成前饋機制促進葉片衰老。本研究中發(fā)現(xiàn)，PtrbHLH3a、PtrbHLH3b、PtrbHLH17a、PtrbHLH17b等在葉片中高豐度表達，可能參與楊樹葉片發(fā)育和衰老過程的調(diào)控。

植物激素之間的相互作用組成一個非常復雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在植物生長發(fā)育和逆境響應過程中起著非常重要的調(diào)控作用。MYC基因在不同激素之間互作過程中具有重要作用。在不定根和葉片發(fā)育過程中，MYC家族基因能夠抑制細胞分裂素代謝和生長素合成影響不定根起始和葉脈發(fā)育。擬南芥中，MYC2可以與其靶基因ERD1的啟動子結(jié)合，激活其表達，進而激活JA誘導的脫水應激反應。此外，茉莉酸和生長素協(xié)同作用調(diào)控擬南芥熱形態(tài)建成。在蘋果愈傷組織中過表達MdMYC2增訊加了MdClbHLHr、MdCBF1、MdCBF2和MdCBF3的表達水平，導致蘋果抗凍耐受性顯著提高。在番茄中MYC2激活乙烯響應因子SIERF.B8的轉(zhuǎn)錄，進而增強JA信號，增加了番茄耐寒性。本研究發(fā)現(xiàn)，不同PtrMYC成員響應激素和非生物脅迫方式不同，一些MYC基因既受激素誘導，又響應某種非生物脅追，如PtrYC14a、PtbHLH14b表達可以被生長素抑制，也可以被細胞分裂素誘導，同時還可以響應鹽和干旱脅迫；而PtrMYC2b表達能夠被茉莉酸誘導，同時還可以響應低溫和鹽脅迫，提示MYC基因家族可能參與不同植物激素相互作用，進而廣泛參與到植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應中，且不同成員可能參與不同生物學過程，但其具體調(diào)控機制尚需進一步研究。

4結(jié)論

本文系統(tǒng)分析了楊樹MYC基因家族的基因和蛋白結(jié)構(gòu)，組織表達特異性以及響應激素和逆境的表達模式。楊樹基因組中共有10個MYC成員，均含有bHLH轉(zhuǎn)錄因子典型結(jié)構(gòu)域；組織表達分析發(fā)現(xiàn)，楊樹MYC基因家族成員表達模式各異，可能參與了不同的生物學過程的調(diào)控。在不同的植物激素處理下，楊樹MYC家族成員表達模式多樣，表明不同的MYC基因可能參與到不同的植物激素信號通路。在不同的非生物脅迫下，楊樹MYC基因家族各成員的表達情況也不同，表明楊樹MYC基因在不同的非生物脅迫下發(fā)揮不同的功能。本研究為揭示MYC基因在楊樹生長發(fā)育和脅迫響應過程中的基因功能奠定了基礎(chǔ)。