王紹昕 秦童 黃震

摘要：為進(jìn)一步探求高效、廣譜的抗腫瘤氟代化學(xué)修飾小分子藥物，為癌癥治療提出新的解決方案，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)和細(xì)胞活性、流式細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄組分析、DNA損傷等實(shí)驗(yàn)來探索氟修飾核苷類分子5-氟胞苷的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-氟胞苷在多種腫瘤細(xì)胞中的 IC ?50 ?小于 1 μmol/L，且5-F-Cyd較為明顯地調(diào)節(jié)了癌癥的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制，與影響DNA復(fù)制、造成DNA損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān).此外，還發(fā)現(xiàn)氟原子修飾的5-氟胞苷有可能通過干擾聚合酶 θ的修復(fù)功能來阻止耐藥的發(fā)生. 因此，5-氟胞苷可作為癌癥治療的潛在候選藥物.

關(guān)鍵詞：核苷類藥物； 抗腫瘤； 凋亡； DNA損傷

中圖分類號(hào)： ?Q291

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19907/j.0490-6756.2023.056002

收稿日期： 2023-04-13

基金項(xiàng)目： ?西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（SKLTCM202202， 2022/09-2023/08）

作者簡(jiǎn)介： ??王紹昕（1998-）， 女， ?山東臨沂人， 碩士研究生， 研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué). E-mail： 1250688706@qq.com

通訊作者： ?黃震.zhen_huang@scu.edu.cn

The antitumor activity and mechanism of 5-fluoro-cytidine

WANG Shao-Xin， QIN Tong， HUANG Zhen

（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Educaion， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

To further explore efficient and broad-spectrum anti-tumor fluorinated chemically modified small molecule drugs and propose new solutions for cancer therapy， this study explored the antitumor activity and mechanism of fluorine-modified nucleoside analog molecule 5-fluorocytidine by molecular docking technique and cell activity， flow cytometry， transcriptome analysis， DNA damage. The experimental results showed that the IC ?50 ?of 5-fluorocytidine in a variety of tumor cells is less than 1 μmol/L. Moreover， 5-F-Cyd significantly regulates the occurrence and development of cancer， affecting DNA replication， causing DNA damage， and inducing cell apoptosis. In addition， it was found that fluorine-atom-modified 5-fluoro-cytidine has the potential to prevent the development of drug resistance by interfering with the repair function of polymerase θ. In conclusion， 5-fluorocytidine may serve as a potential drug candidate for cancer therapy.

Nucleoside analogs; Antitumor; Apoptosis；DNA damage

1 引 言

作為世界上第二大致死病因，癌癥的患病率和病死率逐年升高 ?［1］ .根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）公布的數(shù)據(jù)，中國(guó)以457萬(wàn)病例位居2020年癌癥新發(fā)人數(shù)的國(guó)家榜首，美國(guó)和印度分別以228萬(wàn)和132萬(wàn)居第二和第三位 ?［2］ .短短六年時(shí)間，中國(guó)新發(fā)癌癥病例就從2016年的406.4萬(wàn)例，增至2022年的482萬(wàn)例，增幅高達(dá)18.6% ?［3］ .在目前我們已知的癌癥中，胰腺癌因其診斷、治療難度高及低生存率被稱為“癌癥之王”.隨著對(duì)癌癥發(fā)病機(jī)制探索與完善，各種腫瘤的治療得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，但胰腺癌的診斷與治療在近年來幾乎沒有變化 ?［4］ .因此，本研究計(jì)劃以胰腺癌細(xì)胞株（PANC-1）進(jìn)行主要的機(jī)制探索，為胰腺癌治療提供新思路.

化療是目前癌癥治療最常見和最有效的主要方法之一 ?［5］ .根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的數(shù)據(jù)，美國(guó)每年約有65萬(wàn)名癌癥患者在門診癌癥治療中接受化療.根據(jù)作用機(jī)制不同，抗癌化療藥物分為以下六種：a）造成DNA損傷的烷基化劑；b） 摻入DNA或RNA合成鏈中，引起鏈合成中斷的鏈終止劑；c）聚合酶或與核苷酸合成相關(guān)酶的活性抑制劑；d）拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II的抑制劑；e）有絲分裂和細(xì)胞分裂的抑制劑；f）治療癌癥和減輕其他藥物副作用的皮質(zhì)類固醇 ?［6］ .其中，核苷類小分子的主要機(jī)制是作為核苷酸合成相關(guān)酶的活性抑制劑，干擾核苷酸的合成；作為DNA或RNA合成的底物，或作為聚合酶抑制劑與聚合酶緊密結(jié)合，干擾其正常功能的行使，從而引起新生DNA或RNA鏈合成的終止 ?［7］ .隨著新冠病毒爆發(fā)，人們又開始關(guān)注核苷類藥物的抗病毒機(jī)理.核苷的修飾可引起其結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和選擇性變化，從而具有抗病毒或抗癌的效力 ?［8］ .需要指出的是，從核苷的結(jié)構(gòu)來看，抗病毒和抗腫瘤并沒有絕對(duì)嚴(yán)格的區(qū)分 ?［9］ .氟原子修飾的核苷類藥物，由于可以提高藥物選擇性、有效性及遞送效率等優(yōu)勢(shì)，已成為主要的修飾策略之一.此外，該類藥物還具有易于合成、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn) ?［10］ .氟代藥物已經(jīng)被用于癌癥、艾滋病毒、瘧疾和天花感染在內(nèi)的多種疾病治療 ?［11］ ，5-氟胞苷（5-F-Cyd）作為一種氟代核苷類藥物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于酵母和真菌感染的治療，其基本機(jī)制為先脫氨，轉(zhuǎn)變成為5-氟尿苷，然后代謝為其它尿苷類似物，并且少量被轉(zhuǎn)化為5-氟胞苷三磷酸，隨后被摻入RNA合成鏈，進(jìn)而終止RNA合成 ?［12］ .有研究表明，氟胞苷和氟脫氧胞苷對(duì)的人宮頸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制作用 ?［13］ .因此，我們計(jì)劃對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以便進(jìn)一步探求高效、廣譜的抗腫瘤氟代化學(xué)修飾小分子藥物，為癌癥治療提出新的廣譜解決方案.

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

PANC-1細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、PC-3細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板、離心管購(gòu)自Corning公司（中國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶購(gòu)自Hyclone公司（美國(guó)）；澳洲胎牛血清購(gòu)自Thermo fisher公司（美國(guó)）；DMSO、 Cell Counting Kit-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 小分子核苷藥物的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) ?取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的PANC-1細(xì)胞，胰酶消化后離心，棄上清，含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果96孔板鋪板.每孔約3500個(gè)細(xì)胞（具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），各實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，1個(gè)空白組作為背景.37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)貼壁，細(xì)胞融合度為 30%～40% 時(shí)藥物處理，按濃度梯度（1 nmol/L、 10 nmol/L 、100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L濃度）給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，CCK8處理后測(cè)定吸光度.

2.2.2 5-F-Cyd的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) ?使用10 μmol/L ?的5-F-Cyd，以及吉西他濱處理PANC-1細(xì)胞48 h ，陰性對(duì)照組使用PBS處理.經(jīng)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理染色后，上機(jī)檢測(cè).

2.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 ?PANC-1細(xì)胞與10 μmol/L濃度的5-F-Cyd以及未經(jīng)處理的陰性對(duì)照組（NC）共同孵育48 h后，用Trizol試劑將細(xì)胞從培養(yǎng)板吹打至2 mL離心管，存于-80 ℃或直接送檢.

2.2.4 DNA損傷實(shí)驗(yàn) ?用96孔板鋪板，每孔1×10 ?4 個(gè)PANC-1細(xì)胞，過夜貼壁給藥4～7 h（ 50 μmol/L 、 30 μmol/L、20 μmol/L Capecitabine， Cisplatin， B0， B2）. 使用DNA損傷試劑盒處理后，用熒光顯微鏡觀察并拍照.

2.2.5 分子對(duì)接 ?在PDB下載蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使用autodock tools預(yù)處理小分子結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并設(shè)定grid，使用autodock vina進(jìn)行虛擬對(duì)接以及用pymol分析結(jié)果.

3 結(jié)果與分析

3.1 5-氟-胞苷對(duì)癌細(xì)胞增殖的作用

使用經(jīng)化學(xué)合成的5-氟-胞嘧啶（5-F-Cytosine，5-F-Cyt）和5-氟-胞苷（5-F-Cytidine，5-F-Cyd）在胰腺癌細(xì)胞PANC-1，乳腺癌細(xì)胞MCF-7，前列腺癌細(xì)胞LNcap和PC-3等多種癌細(xì)胞系中進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示.細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)使用吉西他濱（Gemcitabine，Gem）作為對(duì)照，設(shè)置五個(gè)藥物濃度，經(jīng)不同化合物處理48 h的細(xì)胞，使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖速率（圖2）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在多種癌細(xì)胞系中，5-F-Cyd均顯示出良好的細(xì)胞增殖抑制效果，且5-F-Cyd的活性優(yōu)于廣譜化療藥物吉西他濱.此外，5-F-Cyd在PANC-1、MCF-7、LNcaP細(xì)胞系中的IC ?50 分別為0.19 μmol/L、0.85 μmol/L和0.60 μmol/L，展現(xiàn)出顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性.

3.2 ?5-氟-胞苷處理后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)其處理的PANC-1細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序，并對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG聚類分析，選取顯著性最高的20個(gè)基因繪制不同通路的基因表達(dá)差異圖（圖3）.5-F-Cyd處理后，DNA復(fù)制、DNA損傷與修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及與癌癥相關(guān)的多條通路均有上調(diào)，顯示5-F-Cyd較為明顯的調(diào)節(jié)了癌癥的發(fā)生與發(fā)展，且機(jī)制與影響DNA復(fù)制、造成DNA損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)；同時(shí)，有機(jī)物的代謝以及胞質(zhì)、細(xì)胞器代謝、蛋白質(zhì)結(jié)合等通路發(fā)生了下調(diào)，說明5-F-Cyd影響或阻礙了細(xì)胞的正常代謝過程.

3.3 5-氟-胞苷的DNA損傷

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，5-F-Cyd處理后關(guān)于DNA損傷和修復(fù)途徑差異表達(dá)的結(jié)果，為驗(yàn)證其是否會(huì)造成DNA損傷，本研究用磷酸化H2AX （γ-H2AX）作為損傷標(biāo)志物來檢測(cè)DNA損傷情況（DNA雙鏈斷裂）.DNA雙鏈斷裂損傷（DNA double strand break damage ，DSB）是最危險(xiǎn)的DNA損傷類型之一.哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)DSB的首批反應(yīng)之一是組蛋白變體H2AX的Ser139殘基的磷酸化，H2AX的Ser139殘基的磷酸化導(dǎo)致染色質(zhì)凝結(jié)，并在修復(fù)因子的招募中發(fā)揮重要作用，由于H2AX在Ser139位點(diǎn)的磷酸化與DSB具良好相關(guān)性，因此磷酸化H2AX（γ-H2AX）是檢測(cè)DNA損傷及其修復(fù)的敏感標(biāo)記物.結(jié)果顯示，5-F-Cyd處理后的細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)烈DNA損傷熒光，說明與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，5-F-Cyd確可引起DNA損傷.

3.4 5-氟-胞苷的三磷酸形式與pol θ的虛擬對(duì)接

DNA損傷實(shí)驗(yàn)表明，5-F-Cyd可引起DNA雙鏈斷裂損傷，該損傷可通過DNA聚合酶theta（pol θ）介導(dǎo)的末端連接（TMEJ）進(jìn)行修復(fù).有研究表明，抑制TMEJ的藥物在組合治療策略中非常有效 ?［14］ .

為探究5-F-Cyd造成DNA損傷的分子機(jī)理，本研究用分子對(duì)接的方式探究氟修飾核苷對(duì)于pol θ的親和力影響.結(jié)果顯示（圖5），5-F-Cyd的三磷酸形式與pol θ 的 Kd 值為5.94×10 ?-7 ?mol/L， 相對(duì)于其天然底物dCTP的 Kd 值（1.40×10 ?-5 ?mol/L）下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，即親和力更高.此外，氟修飾還改變了核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)及其與聚合酶的相互作用力，相比dCTP只與pol θ通過氫鍵連接，5-F-CTP與pol θ的相互作用力更多且出現(xiàn)了鹽鍵的連接（圖6）.這些結(jié)果表明氟修飾會(huì)大大提升核苷與pol θ的親和力，改變核苷酸與pol θ的相互作用力，因此pol θ可能是5-F-Cyd，乃至氟代核苷藥物的潛在靶點(diǎn).

3.5 5-氟-胞苷可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡

基于5-F-Cyd在PANC-1細(xì)胞系中顯著抗癌效果，以及引起DNA損傷的結(jié)果，推測(cè)其抗癌機(jī)制之一可能是通過造成DNA損傷，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，殺死腫瘤細(xì)胞.本實(shí)驗(yàn)以吉西他濱為陽(yáng)性對(duì)照，通過流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)探究5-F-Cyd的促凋亡活性.結(jié)果表明（圖7），經(jīng)藥物處理48 h后：吉西他濱組（Gem）與文獻(xiàn)報(bào)道一致，引起14.1%的細(xì)胞凋亡 ?［15］ ，其中13.0%細(xì)胞處于凋亡晚期階段，1.1%細(xì)胞處于早凋階段；5-F-Cyd引起70.4%的細(xì)胞凋亡，其中68.8%和1.6%的細(xì)胞分別處于晚凋和早凋階段.與吉西他濱相比，5-F-Cyd引起更為顯著的凋亡現(xiàn)象.

4 討 論

眾多研究表明，DNA損傷劑以及DNA合成抑制劑，常通過造成DNA損傷，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡 ?［16，17］ ，我們也得出了一致的結(jié)論.本研究探索了在多種癌細(xì)胞系中具有良好抗癌活性的氟代核苷類似物5-氟-胞苷.我們發(fā)現(xiàn)其在多種細(xì)胞系中的活性均優(yōu)于廣譜化療藥物吉西他濱，此外5-氟-胞苷在胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中的效果較為顯著.眾所周知，胰腺癌作為生存率最低常見癌癥，因發(fā)病位置特殊和發(fā)展速度極快，其診斷和治療都存在極大的困難 ?［18］ .胰腺癌是一種侵襲性癌癥，在西方國(guó)家中是惡性腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因 ?［19］ .美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，每年大約有4.4萬(wàn)人死于胰腺癌 ?［20］ .本研究以胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1）為模型探索核苷類藥物的活性和機(jī)制，對(duì)于胰腺癌的治療具有一定借鑒意義.

為探索5-氟-胞苷的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析.結(jié)果顯示，經(jīng)5-F-Cyd處理后，PANC-1細(xì)胞系中與癌癥發(fā)生發(fā)展、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)等相關(guān)的通路發(fā)生明顯上調(diào).DNA損傷實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，5-F-Cyd通過引起DNA損傷，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡.此外，本研究借助分子虛擬對(duì)接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)5-F-Cyd的三磷酸形式與pol θ的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用力與天然底物（脫氧胞嘧啶核苷三磷酸）不同，除氫鍵外還通過鹽鍵與pol θ作用，且結(jié)合力更強(qiáng).因此，5-氟-胞苷很可能以pol θ為靶點(diǎn)，通過阻止其修復(fù)雙鏈斷裂損傷，防止耐藥的發(fā)生，強(qiáng)化抗腫瘤效果.pol θ是負(fù)責(zé)損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶之一.抗腫瘤藥物能引起DNA損傷，然而DNA損傷可以通過DNA損傷反應(yīng)（DDR） ?［21］ ?逆轉(zhuǎn)，從而對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，這個(gè)過程中存在多種DNA聚合酶的參與 ?［22］ .因此，DNA聚合酶是重要的藥物耐藥性研究靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步的研究與探索.

綜上所述，5-氟-胞苷具有顯著的抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡的效果，且很可能通過干擾pol θ 的修復(fù)功能，阻止耐藥反應(yīng)的發(fā)生，這些結(jié)果為在后續(xù)研究中將其用于胰腺癌治療或探究核苷類藥物的耐藥機(jī)制提供了可能.然而，一些核苷類藥物表現(xiàn)出的臨床毒性，限制了它們的使用 ?［23］ ，現(xiàn)多采取化學(xué)修飾將高活性分子改造為藥物前體的方式 ?［24］ ，降低核苷類藥物的毒性.因此后續(xù)工作也將對(duì)5-F-Cyd的毒副作用進(jìn)行研究，并嘗試通過合理的修飾改造方法，降低毒副作用的同時(shí)，保留其高抗腫瘤活性.總之，本文對(duì)5-氟胞苷抑制癌細(xì)胞增殖活性及其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探究，其顯著的抑癌活性可使其有望成為癌癥治療和新藥研發(fā)改造的候選藥物，值得進(jìn)一步研究、探索與改造.

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