王瑞鵬, 劉 茜, 楊智強(qiáng), 張博昆, 黃 姿, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

類胡蘿卜素是植物體重要的色素次生代謝產(chǎn)物。在植物類胡蘿卜素的生物合成途徑中,兩分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)在八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)的催化下形成八氫番茄紅素,后者在八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)、ξ-胡蘿卜素脫氫酶(ξ-carotene desaturase,ZDS)、類胡蘿卜素異構(gòu)酶(carotenoid isomerase,CRTISO)等的作用下脫氫、異構(gòu)形成反式番茄紅素。番茄紅素在不同環(huán)化酶(lycopene cyclase,LCY)作用下,分別生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素,這是類胡蘿卜素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵分支點(diǎn)。此后兩者經(jīng)過(guò)連續(xù)羥化分別形成不同的含氧類胡蘿卜素(Xanthophylls)[1]。這種羥化反應(yīng)包括由細(xì)胞色素P450家族類胡蘿卜素羥化酶(cytochrome P450-type monooxygenase 97,CYP97)和亞鐵血紅素依賴型β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotenoid hydroxylase,CHYB)催化的2種路徑,兩者同屬于類胡蘿卜素羥化酶家族[2]。其中,CYP97家族負(fù)責(zé)具有ε環(huán)的α-胡蘿卜素的羥基化,簡(jiǎn)稱為CHYE,而具有β環(huán)的β-胡蘿卜素的羥基化則由CHYB家族完成,通過(guò)羥基化最終分別合成葉黃素(Lutein)、玉米黃素(Zeaxanthin)等重要植物色素,與番茄紅素等共同組成植物的天然類胡蘿卜素功能成分[3]。植物中類胡蘿卜素的生物合成途徑保守存在,但不同植物物種在各自生存環(huán)境的適應(yīng)進(jìn)化過(guò)程中,由于相關(guān)合成途徑基因及其表達(dá)水平的差異最終積累不同含量的色素組分,呈現(xiàn)豐富多變的色澤。

萬(wàn)壽菊(TageteserectaL.)是菊科萬(wàn)壽菊屬草本植物,原產(chǎn)于墨西哥,因其花形大、色彩絢麗、易于栽培,常作為園藝花卉在世界各地栽培種植[4]。由于萬(wàn)壽菊花中富含類胡蘿卜素,尤其是葉黃素,而這些色素成分是維持人體健康所必需的營(yíng)養(yǎng)素,具有抗氧化、防止退行性視力疾病、抗癌、抗輻射等重要功能[5-6],但在人體內(nèi)無(wú)法合成,必須從膳食中攝取或補(bǔ)充[7]。葉黃素是類胡蘿卜素合成途徑中α分支的終產(chǎn)物,作為含氧類胡蘿卜素家族的重要成員之一,既有多種生物活性又具有增色作用,因此在醫(yī)藥、化妝品、飼料等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[8]。富含葉黃素的萬(wàn)壽菊花也因此成為用于提取天然色素成分的主要植物資源,但目前對(duì)其類胡蘿卜素合成途徑基因的克隆和分析報(bào)道較少。本課題組通過(guò)萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序獲得了萬(wàn)壽菊CHYE(TeCHYE)基因的組裝推測(cè)序列,在本文中進(jìn)一步從花中克隆分離該基因,通過(guò)生物信息學(xué)分析以及在萬(wàn)壽菊葉片和不同發(fā)育時(shí)期花組織中的表達(dá)水平測(cè)定,對(duì)其功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

萬(wàn)壽菊(TageteserectaL.)栽培品種‘Juwang’種植于合肥工業(yè)大學(xué)植物培養(yǎng)室。分別采集生長(zhǎng)約70 d萬(wàn)壽菊植株的葉片(L)、花蕾(F1)、未盛開花(F2)、盛開后3 d的花(F3)組織,用于RNA提取、葉黃素質(zhì)量比測(cè)定。

1.1.2 試劑藥品

TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購(gòu)于天根生化科技有限公司;引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0軟件,引物合成和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;其他試劑均為國(guó)外原裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體與菌株

pEASY-Blunt克隆載體購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萬(wàn)壽菊RNA提取與cDNA合成

將采集的萬(wàn)壽菊組織樣品液氮研磨,利用TRIzol提取總RNA,并以Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度、濃度;然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將所提取RNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 萬(wàn)壽菊TeCHYE基因的擴(kuò)增

基于本課題組萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得萬(wàn)壽菊TeCHYE基因組裝序列,并據(jù)此序列設(shè)計(jì)的基因克隆引物CHYEF/R見表1所列。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,利用巢式PCR對(duì)TeCHYE基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序如下:

預(yù)變性(98 ℃、2 min);變性(98 ℃、10 s), 退火(55 ℃、20 s),延伸(72 ℃、90 s),重復(fù)30個(gè)循環(huán);最后延伸(72 ℃、5 min)。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3TeCHYE基因的克隆

利用DNA純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,然后將純化后擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體pEASY-Blunt進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)16 h。然后挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng),以引物CHYEF2、CHYER2進(jìn)行菌落PCR鑒定。取陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取、送樣測(cè)序,并比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.2.4TeCHYE基因生物信息學(xué)分析

利用蛋白組學(xué)分析平臺(tái)(ExPASy,https://www.expasy.org/)ProtParam和ProtScale對(duì)TeCHYE編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,使用同源建模方法(SWISS-MODEL)對(duì)TeCHYE蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并運(yùn)用RasWin軟件對(duì)其進(jìn)行注釋優(yōu)化。將TeCHYE基因序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,利用MEGA 7.0軟件,使用鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)化分析,并對(duì)保守性較高的蛋白用Espript 3.0(https://espript.ibcp.fr/)在線軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。

1.2.5TeCHYE基因表達(dá)分析

以萬(wàn)壽菊‘Juwang’的葉片和不同發(fā)育階段花組織樣品提取RNA、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)TeCHYE克隆測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)定量檢測(cè)引物CHYERTF/R(分別位于編碼序列第1 017堿基和第1 124堿基處),內(nèi)參為萬(wàn)壽菊TIF6基因[9],相應(yīng)引物TIF6F/R序列見表1,對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,該反應(yīng)體系(20 μL)如下: 2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,模板cDNA(1∶30稀釋)4 μL,無(wú)菌雙蒸水5.2 μL。擴(kuò)增程序(兩步法)如下:94 ℃、30 s;94 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個(gè)循環(huán)。在Bio-Rad CFX96 Real-time PCR系統(tǒng)運(yùn)行,利用2-ΔΔCt方法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 萬(wàn)壽菊不同組織葉黃素質(zhì)量比測(cè)定

將萬(wàn)壽菊葉、花組織采樣后45 ℃烘干。置于研缽中加入液氮迅速研磨成粉末。稱取0.1 g置于試管中,先后加入0.1% BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)-乙醇0.8 mL、50% KOH 0.2 mL,渦旋振蕩混勻,然后50 ℃水浴鍋水浴1 h,每隔20 min渦旋1次。水浴完成待冷卻后,加入1 mL丙酮超聲提取1 h,吸取10 μL提取液濾液,利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定葉黃素質(zhì)量比。色譜條件如下:色譜柱Symmetry C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為乙腈、二氯甲烷、甲醇,三者體積比為7∶2∶1;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)[10]為445 nm 。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中葉黃素的質(zhì)量比。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 TeCHYE基因克隆結(jié)果分析

以萬(wàn)壽菊花cDNA為模板,利用特異巢式PCR引物CHYEF/R對(duì)TeCHYE基因進(jìn)行2輪擴(kuò)增,將第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1a所示。圖1a中:M代表DNA Marker;1代表TeCHYE基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

由圖1a可知,本實(shí)驗(yàn)獲得了與預(yù)期大小(1 656 bp)基本一致的目的條帶,且條帶清晰,沒有其他明顯的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。將此擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pEASY-Blunt克隆載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。

利用基因特異引物CHYEF2/R2對(duì)卡那霉素抗性平板上生長(zhǎng)的單克隆進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果如圖1b所示。

圖1 TeCHYE基因克隆載體的構(gòu)建

圖1b中:M代表DNA Marker;1～4代表單克隆編號(hào);+代表正對(duì)照,為TeCHYE基因擴(kuò)增產(chǎn)物;-代表負(fù)對(duì)照,為pEASY-Blunt空載體擴(kuò)增產(chǎn)物。

從圖1b可以看出,單克隆1～3可能連接有TeCHYE基因。然后將鑒定為陽(yáng)性的單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明,本研究獲得了萬(wàn)壽菊TeCHYE基因全長(zhǎng)編碼序列,其與轉(zhuǎn)錄組組裝序列僅有少數(shù)堿基的差異,進(jìn)一步說(shuō)明組裝結(jié)果較為準(zhǔn)確。

2.2 TeCHYE基因生物信息學(xué)和表達(dá)分析結(jié)果

通過(guò)蛋白組學(xué)分析平臺(tái)(ExPASy)對(duì)TeCHYE編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示,TeCHYE含有552個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量為62 125.21;理論等電點(diǎn)為6.62;不穩(wěn)定系數(shù)為35.79,屬于穩(wěn)定蛋白;親水性平均值為-0.174,屬于親水性蛋白。

通過(guò)同源建模方法進(jìn)一步對(duì)TeCHYE的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并采用軟件優(yōu)化模型,所具有的α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)如圖2所示。圖2中:粉色表示α螺旋;黃色表示β折疊;淡藍(lán)色表示轉(zhuǎn)角;白色表示其他結(jié)構(gòu);方框標(biāo)注為亞鐵血紅素的識(shí)別結(jié)合。

圖2 TeCHYE蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用植物CHYE基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示。圖3中:Te(Tageteserecta,萬(wàn)壽菊);Ha(Helianthusannuus,向日葵XM022130222.2);Cc(Cynaracardunculus,大薊XM025127352.1);Ls(Lactucasativa,萵苣XM02390889 6.1);Cm(Chrysanthemummorifolium,杭菊KX85384 9.1);Cs(Cucumissativus,黃瓜XM 004143239.3);Ps(Papaversomniferum,罌粟XM026562158.1);Nt(Nicotianatabacum,煙草XM016580209.1);Sl(Solanumlycopersicum,番茄NM001247129.2);Rc(Ricinuscommunis,蓖麻XM015719409.2);Jc(Jatrophacurcas,麻風(fēng)樹XM020682561.2);Hb(Heveabrasiliensis,橡膠樹XM0 21821728.1);Pm(Prunusmume,梅花XM008243131.1);Pa(Prunusavium,甜櫻桃XM021947619.1);Zj(Ziziphusjujuba,棗XM016043092.2);Cs(Cannabissativa,大麻XM030652736.1);Eg(Eucalyptusgrandis,巨按XM010 052026.3);Bo(Bixaorellana,紅木KT359009.1);Cs(Crotonstellatopilosus,巴豆HG917436.1);Vr(Vitisriparia,河岸葡萄XM034837759.1);Vv(Vitisvinifera,釀酒葡萄XM019221707.1);Cq(Chenopodiumquinoa,藜麥XM021859450.1)。

圖3 TeCHYE基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明CHYE基因在植物中普遍存在,其中萬(wàn)壽菊TeCHYE與藜麥(Chenopodiumquinoa)同源基因相似性最低,為73.66%,而與同科植物向日葵(Helianthusannuus)的同源性最高,為87.53%。與TeCHYE同源性較高的不同植物物種CHYE蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖4所示。

‘Juwang’葉片(L)以及不同發(fā)育時(shí)期(F1、F2、F3)的花組織如圖5a所示,對(duì)各組織中TeCHYE基因的表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果如圖5b所示,圖5b中不同字母表示有顯著差異(P<0.05),下同。由圖5b可知,TeCHYE基因在葉片和各發(fā)育時(shí)期的花中均有表達(dá),但在發(fā)育階段的未盛開花(F2)中表達(dá)水平最高。

圖4 不同植物的CHYE蛋白氨基酸序列比對(duì)

圖5 TeCHYE基因表達(dá)量分析

2.3 葉黃素質(zhì)量比分析

對(duì)上述萬(wàn)壽菊組織中的葉黃素進(jìn)行提取,利用HPLC方法對(duì)葉黃素質(zhì)量比進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。圖6中,箭頭所指為葉黃素色譜峰。由圖6可得萬(wàn)壽菊‘Juwang’葉黃素質(zhì)量比如圖7所示,由圖7可知,萬(wàn)壽菊葉片(L)、花蕾(F1)、未盛開花(F2)、盛開后3 d花(F3)中葉黃素質(zhì)量比分別為10.62、44.49、79.32、57.01 μg/g,不同發(fā)育階段花組織中葉黃素質(zhì)量比均明顯高于葉片,是葉片的5～10倍。萬(wàn)壽菊花組織是合成積累葉黃素的主要部位,且隨著發(fā)育程度加深,花中葉黃素質(zhì)量比顯著增加,但在完全盛開后略有下降,表明在成熟后期葉黃素可能通過(guò)代謝途徑轉(zhuǎn)化為其他次生物質(zhì)。

圖6 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品和‘Juwang’樣品的HPLC譜圖

圖7 萬(wàn)壽菊‘Juwang’葉黃素質(zhì)量比分析

3 討 論

萬(wàn)壽菊顏色多樣,有明黃、橙黃、橘黃、橘紅,色彩深淺不一[11]。但無(wú)論顏色深淺,葉黃素均為萬(wàn)壽菊花中主要色素成分,因此這種顏色差異主要取決于葉黃素的含量[12-13]。本實(shí)驗(yàn)所選用橙色萬(wàn)壽菊品種‘Juwang’,其花中葉黃素質(zhì)量比也顯著高于葉片,是合成積累以及用于天然葉黃素提取的組織。但目前對(duì)萬(wàn)壽菊葉黃素合成途徑相關(guān)基因的克隆報(bào)道并不多,本文對(duì)催化α-胡蘿卜素形成葉黃素的α-胡蘿卜素ε環(huán)羥化酶基因TeCHYE進(jìn)行了克隆,獲得其完整編碼序列。進(jìn)化分析表明萬(wàn)壽菊TeCHYE與同科植物向日葵HaCHYE同源性最高,也進(jìn)一步說(shuō)明進(jìn)化分析的可信性。所預(yù)測(cè)TeCHYE編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥同源AtCYP97C1蛋白結(jié)構(gòu)類似。有報(bào)道認(rèn)為,AtCYP97C1主要定位于葉綠體膜,催化α-胡蘿卜素ε環(huán)和β環(huán)的羥基化,但對(duì)β-胡蘿卜素的β環(huán)僅有很低的催化活性[14-16]。當(dāng)最佳底物α-胡蘿卜素耗盡時(shí),植物才發(fā)揮β-胡蘿卜素羥化酶活性[17]。本文中所檢測(cè)萬(wàn)壽菊TeCHYE基因的表達(dá)模式與相應(yīng)組織中葉黃素質(zhì)量比也顯示相似趨勢(shì),因此TeCHYE可能具有類似功能,催化葉黃素在萬(wàn)壽菊花中的合成。在課題組前期的轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序分析中[9],CHYE在萬(wàn)壽菊中只發(fā)現(xiàn)了本文所克隆的1個(gè)基因序列,不存在多個(gè)拷貝,考慮到萬(wàn)壽菊花中葉黃素的高合成積累,TeCHYE基因可能在其中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明,萬(wàn)壽菊所合成葉黃素可以與脂肪酸(主要是飽和脂肪酸)結(jié)合,主要以葉黃素酯的形式存在[18]。在相同的光、熱條件下,葉黃素酯的穩(wěn)定性要優(yōu)于葉黃素[19]。此外,以葉黃素酯提取的天然色素成分也更有利于人體、飼養(yǎng)動(dòng)物的吸收利用。而通過(guò)CHYE催化α-胡蘿卜素ε環(huán)引入羥基形成葉黃素,這種羥基化也為葉黃素進(jìn)一步與脂肪酸形成葉黃素酯,在萬(wàn)壽菊花組織中穩(wěn)定積累提供了條件。文獻(xiàn)[20]對(duì)牽?；ǖ难芯勘砻?通過(guò)CHYE羥基化促進(jìn)葉黃素酯的積累是其花瓣呈色的重要原因。

綜上所述,本研究通過(guò)TeCHYE基因克隆與分析,為植物類胡蘿卜素合成途徑及可能的遺傳改良應(yīng)用提供了新的基因資源。后續(xù)可以利用番茄等模式園藝作物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過(guò)分析過(guò)表達(dá)株系果實(shí)色素表型進(jìn)一步驗(yàn)證其功能并評(píng)估應(yīng)用潛力。