王如意，范晶菁，李洪林，王 蕊

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237）

亨廷頓舞蹈癥（Huntington's disease, HD）作為神經(jīng)退行性疾病中最主要的單基因遺傳病，主要由基因突變引起[1]。其臨床癥狀表現(xiàn)為舞蹈癥、肌張力障礙、認(rèn)知功能減退及抑郁等[1]。亨廷頓蛋白（Htt）參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)、突觸傳遞和自噬調(diào)節(jié)等[2]，在神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎形成、神經(jīng)元存活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，突變的Htt 蛋白（mHtt）誘導(dǎo)紋狀體神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失。神經(jīng)元的丟失使得紋狀體中多巴胺（DA）水平紊亂[3]，進(jìn)而破壞大腦中所有神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，導(dǎo)致紋狀體功能障礙[4]，最終引起運(yùn)動(dòng)損傷[5]。3-硝基丙酸（3-NP）通過血腦屏障，結(jié)合并抑制線粒體上琥珀酸脫氫酶的催化位點(diǎn)，抑制三羧酸循環(huán)，從而選擇性損傷紋狀體神經(jīng)元，使動(dòng)物表現(xiàn)出與HD 相似的病理改變和運(yùn)動(dòng)癥狀[6]。因此，3-NP 誘導(dǎo)的HD 大鼠模型被廣泛用于該疾病的研究。

丁苯那嗪（TBZ）是一種非典型抗精神病藥，具有降低單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的作用[7-8]，已被廣泛用于治療精神病、運(yùn)動(dòng)障礙以及中樞功能障礙等疾病[9-10]。據(jù)報(bào)道，TBZ 對(duì)舞蹈樣癥狀具有暫時(shí)的抑制作用[11]，然而，其對(duì)3-NP 誘導(dǎo)的HD 樣癥狀及病理改變的作用機(jī)制尚未完全揭示。

本文通過建立3-NP 誘導(dǎo)的HD 大鼠模型，證實(shí)了TBZ 可緩解3-NP 引起的大鼠體重下降和運(yùn)動(dòng)功能障礙，并著重研究了其改善舞蹈樣癥狀的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBZ 通過降低囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2（VMAT2）的表達(dá)和對(duì)突觸的保護(hù)作用調(diào)節(jié)DA 的突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程，減少紋狀體中DA 的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放。同時(shí)，TBZ 通過抑制酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)降低DA 在紋狀體中的合成。通過上述兩種作用共同減少紋狀體中DA 水平，減少神經(jīng)元損傷，保護(hù)紋狀體正常功能，從而改善HD 樣癥狀。本文通過對(duì)TBZ 治療3-NP 誘導(dǎo)的HD 大鼠模型的藥效及機(jī)制研究，驗(yàn)證了其治療HD 的可行性，研究結(jié)果為HD 的治療策略提供了新的方向。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和藥物

3-NP（N5636-1G，純度≥97%）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，溶于生理鹽水中，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4；TBZ（T2839-200MG，純度99%）購(gòu)自日本TCL 公司；Htt 抗體和突觸素（SYN）抗體均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；TH 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；VMAT2 抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；免疫組化二抗試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒均購(gòu)自武漢賽維爾有限公司；熒光二抗IgG、蛋白酶抑制劑和化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）均購(gòu)自Thermo Scientific 科技（中國(guó)）有限公司；DA 檢測(cè)試劑盒和HVA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Cusabio 公司；尼氏染色試劑盒和苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型建立 雄性Wistar 大鼠，200～300g，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

將大鼠隨機(jī)分為3 組：生理鹽水組；3-NP組（注射劑量20mg/kg[12]）；3-NP+TBZ 組（3-NP、TBZ 注射劑量分別為20、3mg/kg[13]）。實(shí)驗(yàn)流程如圖1 所示。預(yù)給藥1 周后，腹腔注射3-NP 或生理鹽水，連續(xù)5d。5d 后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。1.2.2 體重測(cè)量 每天在給藥前，于同一時(shí)間稱取大鼠的體重并記錄，按體重計(jì)算每日給藥量，取第1 d 和最后1 d 的體重計(jì)算其體重變化率。體重變化率（Δmw）計(jì)算公式如下：

圖1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖Fig.1 Experimental flow chart

其中，m'、m1分別為最后1 d 和第1 d 的體重。

1.2.3轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 通過轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的平衡能力。在實(shí)驗(yàn)第12d 進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，正式測(cè)試之前，所有大鼠接受為期3d 的訓(xùn)練，轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速為4r/min，每天3 次，每次訓(xùn)練3min。正式實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)棒從4r/min到20r/min 加速旋轉(zhuǎn)，記錄大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間，重復(fù)3 次，取平均值用于比較分析。

1.2.4強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠置于安靜的環(huán)境中休息3h，以消除對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。隨后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，將大鼠分別放入直徑25cm、水深30cm 的有機(jī)玻璃桶中，水溫為(25±3)℃，讓其游泳6min，記錄后5min 大鼠的不動(dòng)時(shí)間。當(dāng)動(dòng)物停止掙扎，僅為了保持平衡或漂浮而運(yùn)動(dòng)時(shí)，就認(rèn)為其處于不動(dòng)狀態(tài)。

1.2.5Westernblot 實(shí)驗(yàn) 大鼠處死后解剖、分離其紋狀體。在含有PMSF和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解組織。提取后的蛋白用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。在100 V 電壓下，經(jīng)過φ=10%的分離膠分離，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。封閉2 h 后，將條帶分別與Htt 抗體（體積比1∶1000）、TH 抗體（體積比1∶1000）或VMAT2 抗體（體積比1∶1000）于4 ℃下過夜孵育；洗膜，室溫下與GAPDH 抗體（體積比1∶10000）孵育2 h。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)液顯色，于化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon 5200s 型）下曝光顯影。用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量。

1.2.6尼氏染色 大鼠麻醉后依次經(jīng)心臟灌注50mL生理鹽水和100mLφ=4%的多聚甲醛，分離腦組織保存于φ=4%的多聚甲醛中。酒精梯度脫水，石蠟包埋，以4μm厚度切片。切片脫蠟后于尼氏染色液中孵育10min，酒精梯度脫水，二甲苯脫色后用中性樹脂封片。

1.2.7免疫組化 石蠟切片脫蠟，于檸檬酸抗原修復(fù)液中熱修復(fù)，φ=3%的過氧化氫中孵育25min 以去除內(nèi)源性過氧化物酶。切片于φ=5%山羊血清中封閉30min，加入Htt 抗體（體積比1∶1000）或TH 抗體（體積比1∶3000）于4℃條件下過夜孵育。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后，將切片與生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG 于37℃孵育1h。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）工作液進(jìn)行顯色，觀察到陽(yáng)性位置出現(xiàn)棕黃色后，用PBS 結(jié)束顯色。酒精梯度脫水后，浸入二甲苯中使其透明。稍晾干，中性樹脂封片。

1.2.8免疫熒光 一抗孵育前步驟與免疫組化相同，加入突觸素SYN 抗體（體積比1∶200）于4℃中避光過夜孵育。洗滌3 次，室溫下加入AlexaFluor?568山羊抗鼠（體積比1∶100）避光孵育2h。加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液孵育1min。PBS沖洗后，使用尼康共聚焦顯微鏡（Nikon-csu-w1sora型）觀察切片，設(shè)置激光波長(zhǎng)為（405～561）nm。使用imageJ 軟件統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。

1.2.9酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

（1）樣品制備 取適量紋狀體組織，PBS 沖洗血跡。加PBS 研磨至勻漿狀，于?20℃條件下放置過夜。反復(fù)凍融2 次以破壞細(xì)胞膜，在5000g，2～8℃條件下離心5min，分離上清。

（2）DA 水平檢測(cè) 用DA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)紋狀體中的DA 水平。加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，于37℃孵育2h，棄液。每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液，于37℃孵育1h，洗滌。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，于37℃孵育1h，棄液，洗滌。依次加入底物溶液，于37℃避光孵育15～30min。加入終止液停止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于450nm 下測(cè)定各孔的光密度。使用BCA 試劑盒蛋白定量進(jìn)行歸一化處理。

（3）HVA 水平檢測(cè) 用HVA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)紋狀體中HVA 水平。加入標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品，立即添加抗體工作液，于37 ℃孵育40 min。洗滌，加入酶結(jié)合物工作液，于37 ℃ 溫育30 min。洗滌，每孔加入底物溶液，于37 ℃避光顯色20 min。依次加入終止溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)量各孔的光密度值。使用BCA 試劑盒蛋白定量進(jìn)行歸一化處理。

1.2.10數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)處理及作圖采用GraphPadPrism8.0，統(tǒng)計(jì)分析采用IBMSPSSStatistics 25，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異性比較，其中“*”和“#”分別表示與模型組3-NP 和對(duì)照組相比；P<0.05 表示有顯著性差異；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；n表示每組樣本數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TBZ 逆轉(zhuǎn)3-NP 誘導(dǎo)的體重減少和異常行為表現(xiàn)

體重和行為學(xué)變化被用來評(píng)估動(dòng)物模型是否成功。結(jié)果表明，經(jīng)3-NP 誘導(dǎo)后，動(dòng)物體重較對(duì)照組顯著下降（P<0.001，圖2（a）），這可能與代謝紊亂、神經(jīng)元變性以及雙側(cè)紋狀體損傷有關(guān)[14]，伴隨著體重下降會(huì)出現(xiàn)一些運(yùn)動(dòng)行為表型的改變[15-18]；在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間顯著減少（P<0.001，圖2（b）），在水中不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P<0.001，圖2（c）），表明運(yùn)動(dòng)能力受損，表現(xiàn)出HD 樣癥狀，這些變化可能與3-NP 損傷紋狀體功能有關(guān)[19]。與3-NP 單獨(dú)處理組相比，經(jīng)3-NP+TBZ（3 mg/kg,P<0.001）處理的大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間顯著增加，且在桿上運(yùn)動(dòng)時(shí)四肢更有力，而3-NP 處理組動(dòng)物則表現(xiàn)出跛行狀態(tài)。此外，TBZ 減少了動(dòng)物在水中的不動(dòng)時(shí)間 （P<0.001）。上述結(jié)果表明，TBZ 改善了大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和游泳能力，表明TBZ 可以緩解3-NP 誘導(dǎo)的HD 樣癥狀。

圖2 TBZ 逆轉(zhuǎn)3-NP 誘導(dǎo)的體重減少和異常行為Fig.2 TBZ reversed 3-NP induced weight loss and abnormal behavior

2.2 TBZ 減輕3-NP 誘導(dǎo)的Htt 蛋白水平的升高

mHtt 蛋白在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，可引起細(xì)胞毒性[20]，但HD 病變主要發(fā)生在紋狀體[21]。本研究通過Western blot 和免疫組化對(duì)動(dòng)物紋狀體中Htt 的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖3 所示。與對(duì)照組相比，3-NP 處理組大鼠的紋狀體中Htt 水平顯著升高（P<0.05，圖3（a）、3（b）），這與HD 應(yīng)有的病理特征相吻合。而TBZ 治療可以明顯逆轉(zhuǎn)Htt 水平的升高趨勢(shì)（P<0.01）。如圖3（c）顯示，紋狀體Htt 陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色，與對(duì)照組相比，經(jīng)3-NP 誘導(dǎo)的大鼠紋狀體中陽(yáng)性信號(hào)密度與強(qiáng)度均明顯增加，表明Htt 水平升高。而加入TBZ 可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，提示TBZ 能降低Htt 的表達(dá)，該結(jié)果與Western blot 保持一致（圖3（c））。上述結(jié)果驗(yàn)證了TBZ 可減輕3-NP 誘導(dǎo)的Htt 蛋白水平的升高。

圖3 TBZ 減輕3-NP 誘導(dǎo)的Htt 蛋白水平的升高Fig.3 TBZ reverses 3-NP-induced Htt protein upregulation

2.3 TBZ 提高3-NP 誘導(dǎo)的大鼠紋狀體和黑質(zhì)中神經(jīng)元的存活

mHtt 可能引起興奮性谷氨酸中毒，并破壞附近神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能，從而損傷神經(jīng)元[22]。為了驗(yàn)證TBZ 對(duì)紋狀體神經(jīng)元的影響，采用尼氏染色法對(duì)大鼠紋狀體神經(jīng)元進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析并計(jì)數(shù)。如圖4 所示，對(duì)照組中神經(jīng)元形態(tài)正常且分布均勻，無(wú)明顯腫脹和核固縮。經(jīng)3-NP 誘導(dǎo)的大鼠紋狀體中神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組減少（P<0.01），且神經(jīng)元分布不均，胞體呈現(xiàn)皺縮狀，且仁不清。經(jīng)TBZ 治療后，神經(jīng)元數(shù)量增加（P<0.01），形態(tài)趨于正常（圖4（a）、4（b））。mHtt 在疾病早期對(duì)紋狀體神經(jīng)元造成深度損傷，隨后影響大腦其他區(qū)域的神經(jīng)元[23-24]，因此，本研究進(jìn)一步對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷情況進(jìn)行評(píng)估。與紋狀體相似，3-NP 處理組中大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的數(shù)目明顯減少（P<0.01），而3-NP+TBZ 組中大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加（P<0.05，圖4（c））。3-NP 引起神經(jīng)元丟失和死亡，而TBZ 可減輕3-NP 引起的神經(jīng)毒性，表明該化合物對(duì)3-NP 誘導(dǎo)的HD 大鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。

圖4 TBZ 提高3-NP 誘導(dǎo)的大鼠紋狀體和黑質(zhì)中神經(jīng)元的存活Fig.4 TBZ improved 3-NP - induced neuronal survival in striatum and substantia nigra

2.4 TBZ 影響紋狀體中DA 及其代謝物的水平

紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變已被證明對(duì)HD的病理生理基礎(chǔ)和疾病的發(fā)展有重要貢獻(xiàn)[25-26]。本文采用ELISA 法測(cè)定動(dòng)物紋狀體中DA 及其代謝物的濃度，驗(yàn)證了TBZ 對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。如圖5(a)所示，3-NP 誘導(dǎo)的大鼠紋狀體中DA 水平顯著升高（P<0.05），而其代謝產(chǎn)物高香草酸（HVA）水平明顯下降 (圖5(b))，提示該動(dòng)物模型中DA 及其代謝物水平紊亂，表明3-NP 處理組大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙可能與引起上述神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變有關(guān)。而TBZ處理的大鼠紋狀體中DA 水平（P<0.01）較模型組顯著下降，HVA 水平明顯升高（P<0.05），表明TBZ 可以逆轉(zhuǎn)3-NP 導(dǎo)致的紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。這可能是TBZ 改善3-NP 誘導(dǎo)的HD 大鼠異常行為表型的原因之一。

圖5 TBZ 影響多巴胺及其代謝物的水平Fig.5 TBZ affects the levels of DA and its metabolite

2.5 TBZ 調(diào)節(jié)TH 的表達(dá)水平

采用Western blot 和免疫組化方法檢測(cè)紋狀體中TH 的表達(dá)水平。如圖6(a) 所示，紋狀體的TH 陽(yáng)性信號(hào)為黑質(zhì)DA 神經(jīng)元投射的神經(jīng)末梢，組化染色顯示各組均可見棕黃色陽(yáng)性纖維。與對(duì)照組相比，注射3-NP 的大鼠紋狀體中TH 陽(yáng)性纖維密度和信號(hào)強(qiáng)度均明顯升高。與此相反，TBZ 治療后紋狀體陽(yáng)性纖維密度降低且信號(hào)減弱。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，3-NP 誘導(dǎo)的動(dòng)物紋狀體中TH 水平高于對(duì)照組，但TBZ 處理組大鼠TH 水平顯著下降（P<0.01，圖6(b))。Western blot 的結(jié)果與上述結(jié)果一致(圖6(c))。因此，TBZ 可調(diào)節(jié)紋狀體中TH 的表達(dá)，使其恢復(fù)到正常水平。TH 是參與DA 合成的限速酶，抑制TH 可以大大降低DA 的生成[27-29]。TBZ 可能通過抑制紋狀體中TH 的表達(dá)來降低DA 及其代謝物的含量，從而影響運(yùn)動(dòng)表型。

2.6 TBZ 抑制3-NP 誘導(dǎo)的突觸損傷并調(diào)節(jié)VMAT2的表達(dá)水平

mHtt 對(duì)突觸功能具有明顯的毒性，如干擾突觸囊泡的運(yùn)輸、破壞突觸囊泡的結(jié)構(gòu)、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的攝取和釋放、影響突觸蛋白的表達(dá)或轉(zhuǎn)譯后修飾[30]。為了驗(yàn)證TBZ 能否通過調(diào)節(jié)突觸囊泡影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放，本文研究了紋狀體中SYN 和VMAT2 的表達(dá)。采用免疫熒光法對(duì)大鼠紋狀體切片進(jìn)行處理，采用共聚焦顯微鏡拍攝圖像（圖7（a））。圖7（b）表明3-NP 降低了大鼠紋狀體中SYN 水平（P<0.01），說明其對(duì)突觸具有損傷作用；而TBZ 逆轉(zhuǎn)了3-NP 對(duì)突觸的損傷（P<0.01），表明TBZ具有選擇性地結(jié)合并抑制VMAT2 的功能，可以減少囊泡對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的作用[31]。由圖7（c）、7（d）可見，3-NP 處理組中動(dòng)物紋狀體的VMAT2 水平顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而TBZ 能改善這一異?，F(xiàn)象（P<0.05），且其改變VMAT2 水平的趨勢(shì)與改變DA 水平趨勢(shì)保持一致，表明TBZ 可能通過調(diào)節(jié)VMAT2 水平影響紋狀體DA 的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放。因此，TBZ 可能通過保護(hù)突觸水平及功能，并調(diào)節(jié)VMAT2蛋白的表達(dá)，恢復(fù)紋狀體中DA 的含量，其對(duì)DA 的調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步保護(hù)了神經(jīng)元，從而恢復(fù)紋狀體正常功能，最終緩解了3-NP 誘導(dǎo)的HD 樣癥狀，詳細(xì)機(jī)制過程見圖8。

圖7 TBZ 抑制3-NP 誘導(dǎo)的突觸損傷并調(diào)節(jié)VMAT2 的表達(dá)水平Fig.7 TBZ inhibited 3-NP induced synaptic damage and regulated VMAT2 expression

圖8 TBZ 改善HD 樣癥狀的機(jī)制示意圖Fig.8 Schematic diagram of mechanism of TBZ ameliorating HD-like symptoms

3 結(jié) 論

本文驗(yàn)證了TBZ 對(duì)3-NP 誘導(dǎo)的HD 大鼠模型的治療作用，并證實(shí)TBZ 可以恢復(fù)該動(dòng)物模型紋狀體中發(fā)生的DA 及其代謝產(chǎn)物HVA 水平的紊亂，以及降低VMAT2 的蛋白表達(dá)，保護(hù)突觸功能，進(jìn)而減少單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放，調(diào)節(jié)紋狀體中DA 的含量。此外，TBZ 還可以作用于DA 合成路徑中的合成限速酶TH，通過抑制該蛋白的表達(dá)減少DA 在紋狀體中的合成。這些作用共同導(dǎo)致TBZ 降低紋狀體中DA 水平，防止DA突觸后神經(jīng)元的過度刺激，減少紋狀體功能損傷，從而改善HD 樣癥狀。這可能為TBZ 治療HD 的機(jī)制提供了新的解釋。